Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op

Het algemene doel van deze procedure is om de samenstelling van MultiPro-complexen in thal-cordmembranen onder verschillende omstandigheden vergelijkend te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst thal-membranen te isoleren uit lamona-cellen die zijn blootgesteld aan anaerobe omstandigheden. Vervolgens worden de th-cordmembranen gesolubiliseerd en gefractioneerd op een sucrose-dichtheidsgradiënt.

Vervolgens worden gelijke volumes van de gewenste fracties gemengd en gescheiden via SDS-PAGE. Ten slotte worden de met kumasi gekleurde banden gedigesteerd met trypsine. Uiteindelijk worden de monsters geanalyseerd met kwantitatieve massaspectrometrie om veranderingen in de eiwitabondantie tussen de onderzochte fracties waar te nemen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals kwantitatieve proteomische studies waarbij een gedefinieerde hoeveelheid eiwit wordt vergeleken, is dat in onze benadering gelijke volumes van gefractioneerde monsters worden gecombineerd en geanalyseerd. Dit maakt het mogelijk om het migratiegedrag van eiwitten binnen de gradiënt te bestuderen en bovendien de samenstelling van verschillende niet-eiwitcomplexen in het derde groepsmembraan te analyseren. Met betrekking tot de toegepaste stammen: na het kweken van chlamydomonas rein hardy-stammen, volgens het tekstprotocol, dienen stockoplossingen van 2 M sucrose, 10% beta-DM in water en 0,5 M Tris pH 8.0 te worden gebruikt.

Om de volgende oplossingen voor sucrose-dichtheidsgradiënten voor te bereiden voor het opzetten van de gradiënten met behulp van centrifugebuizen van 14 bij 89 millimeter, begint u met het langzaam inschenken van 1 mL van de 1,3 M oplossing, gevolgd door 1 mL van de 1,0 M oplossing. Schenk vervolgens telkens 2 mL van de 0,85 M, 0,7 M, 0,65 M en tot slot de 0,4 M oplossingen in. Bewaar de gradiënten overnacht in de koelkamer om anaerobe omstandigheden te induceren.

Plaats in de chlamydomonas-culturen een glazen pipet in de kweekkolven en borrel Argonne er gedurende vier uur door bij voortdurend roeren en verlichting om thylakoïdmembranen te isoleren. Begin na de incubatie met het pelleten van de cellen gedurende vijf minuten bij 2 500 ×g en 4 °C. Resuspendeer vervolgens de celpellets in 30 mL H1-buffer.

Herhaal de centrifugatie en resuspendeer de cellen opnieuw. Suspendeer de cellen in H one buffer om de cellen te lyseren en leid ze door een nebulisator met een stikstofdruk van 1 500 Pascals. Zorg ervoor dat de afstand tussen de keramische kogel en het metaal klein genoeg is om de cellen te breken.

Centrifuge de cellen vervolgens zeven minuten bij 2 500 ×g en 4 °C. De supernatant moet lichtgroen van kleur zijn. Als de cellyse succesvol was, resuspendeer de cellen in 50 milliliters H₂-buffer en pellet ze gedurende 10 minuten bij 32 800 ×g en 4 °C.

Resuspendeer de cellen vervolgens in 10 milliliters H drie buffer en gebruik een Potter-homogenisator om het geresuspendeerde pellet te homogeniseren. Begin vervolgens met 12 milliliters cellen in H drie buffer om sucrose-dichtheidsgradiënten voor het navelstrengweefsel voor te bereiden.

Giet vervolgens langzaam een laag van 12 milliliters H four buffer in en sluit af met 12 milliliters H five buffer. Gebruik H five om de rotor te balanceren en centrifugeer de gradiënten gedurende één uur bij 70.700 ×g. Verwijder de TH-banden uit de gradiënten en gebruik een passend volume H six buffer om deze te verdunnen.

Centrifugeer de cellen 20 minuten bij 37.900 ×g bij vier graden Celsius. Als de pellet niet compact is, voeg dan meer H six-buffer toe aan de centrifugatiestap. Resuspendeer vervolgens.

Suspendeer de thylakoiden in een klein volume H6-buffer om een sucrose-dichtheidsgradiënt voor fotosystemen te laden. Bereken eerst de benodigde hoeveelheden thylakoiden, beta-DM en H6-buffer voor elke gradiënt. Volgens deze richtlijnen bevat elke gradiënt 0,8 mg/mL chlorofyl in 0,9% beta-DM, waarbij H6-buffer wordt gebruikt om het uiteindelijke volume aan te vullen tot 700 µL.

Om de thylakoïden te solubiliseren, bereidt u voor elke gradiënt afzonderlijk een Eloqua met Thylakoids bèta DM en een H zes buffer. Incubeer de monsters 20 minuten op ijs en keer ze elke paar minuten om om te mengen. Centrifugeer de monsters vervolgens 10 minuten bij 14.000 ×g en 4 °C.

De pellet moet klein en witachtig zijn, en het supernatant zal donkergroen zijn. Breng het supernatant over op de gradiëntbalans met H six buffer en ultracentrifugeer dit bij 134.470 ×g gedurende 14 uur bij 4 °C. Maak na de centrifugatie foto's van de gradiënten voordat u overgaat tot fractionering.

Gebruik een naald om een gaatje in de bodem van de buis te prikken en verzamel de fracties in buisjes van 500 µL. Alternatief kan een proces met een 96-wellplaat worden gebruikt. De monsters voor SDS-PAGE bij gel-digestie en massaspectrometrie worden voorbereid volgens het tekstprotocol zoals hier getoond, waarbij de resultaten van immuno-bloedanalyse fractie zes van het wild type en fractie 13 van delta PS one worden gebruikt.

Piekfracties van A en R1 zijn in deze figuur gekozen voor de analyse van componenten van het cyclische elektronentransport supercomplex. Er worden relatieve eiwitratio's getoond, weergegeven als wildtype over delta PS1 14N over 15N, voor diverse PS1-kern- en lichtogstende eiwitten van PS1, alsook voor eiwitten die zijn toegewezen aan het cyclische elektronentransport supercomplex. De verschillen in abundantie van NDR1 en CAS in fractie 6 en 13 van het wildtype en delta PS1 suggereren dat zij nieuwe componenten van dit complex zijn. Hier worden de resultaten getoond voor de kwantitatieve vergelijking van dit cyclische elektronentransport supercomplex tussen het wildtype en een PGL1-knockoutstam. Interessant is dat HCF136, cytochroom B6, cytochroom B6F subunit 4 en PETC verrijkt lijken te zijn in het wildtype, terwijl FTSH2, cytochroom F en PET O verrijkt lijken te zijn in PGL1.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u de samenstelling van MultiPro-complexen in thylakoïdmembranen onder verschillende omstandigheden kunt vergelijken. Houd er rekening mee dat voor de succesvolle preparatie van thylakoïdmembranen en de isolatie van de cyclische elektronenstroom het disruptieproces van supercomplexcellen, het homogeniseren van cellen en de isolatie van thylakoïdmembranen de kritieke stappen zijn. Bovendien moeten de sucrose-dichtheidsgradiënten gedurende ten minste 12 uur worden gecentrifugeerd om een volledige scheiding van de fotosynthetische complexen te bereiken.