Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op 15 N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie
March 13th, 2014
De beschreven vergelijkende, kwantitatieve proteomics aanpak is gericht op het verkrijgen van inzicht in de samenstelling van multiprotein complexen onder verschillende omstandigheden en wordt aangetoond door het vergelijken van genetisch verschillende stammen. Voor kwantitatieve analyse gelijke volumes van verschillende fracties van een sucrose dichtheidsgradiënt gemengd en geanalyseerd met massaspectrometrie.
Het algemene doel van deze procedure is om de samenstelling van MultiPro-complexen in thal-koordmembranen onder verschillende omstandigheden comparatief te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst thal-membranen te isoleren van lamona-cellen die zijn blootgesteld aan anaërobe omstandigheden. Vervolgens worden de th-koordmembranen gesolubiliseerd en gefractioneerd op een sucrosedichtheidsgradient.
Vervolgens worden gelijke volumes van de gewenste fracties gemengd en gescheiden op SDS-blad. Ten slotte worden de met kumasi gekleurde banden met trypsine verteerd. Uiteindelijk worden monsters geanalyseerd door kwantitatieve massaspectrometrie om veranderingen in eiwitovervloed tussen de onderzochte fracties waar te nemen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals kwantitatieve proteomische studies die een gedefinieerde hoeveelheid eiwit vergelijken, is dat in onze aanpak gelijke volumes van gefractioneerde monsters worden gecombineerd en geanalyseerd. Dit maakt het mogelijk om het migratiegedrag van eiwitten binnen de gradiënt te bestuderen, en bovendien om de samenstelling van verschillende niet-eiwitcomplexen in de derde groep membraan te analyseren. Met betrekking tot de toegepaste stammen Na het kweken van chlamydomonas rein hardy-stammen, gebruik volgens het tekstprotocol stockoplossingen van twee molaire sucrose, 10% beta DM in water en 0,5 molaire trice pH 8,0.
Om de volgende oplossingen voor sucrosedichtheidsgradienten voor te bereiden om de gradiënten op te zetten met behulp van centrifugeerbuizen van 14 bij 89 millimeter, begint u met het langzaam gieten van één milliliter 1,3 molaire oplossing, gevolgd door één milliliter 1,0 molaire oplossing. Giet vervolgens twee milliliter van elke 0,85, 0,7 0,65 en tenslotte de 0,4 molaire oplossingen. Bewaar de gradiënten een nacht in de koude kamer om anaërobe omstandigheden te induceren.
In de chlamydomonas-culturen, steek een glazen pipet in de kweekkolven en laat ze gedurende vier uur met Argonne borrelen met continue roeren en verlichting voor het isoleren van thal-koordmembranen. Na de incubatie, begin met het pellen van de cellen gedurende vijf minuten bij 2.500 keer zwaartekracht en vier graden Celsius. Plaats vervolgens de cellen opnieuw in suspensie in 30 milliliter H-een-buffer.
Herhaal de centrifugatie en plaats de cellen opnieuw in suspensie in H-een-buffer om de cellen te breken, passeer ze door een vernevelaar met een stikstof druk van 1.500 Pascal. Zorg ervoor dat de afstand tussen de keramische bal en het metaal klein genoeg is om cellen te breken.
Draai vervolgens de cellen gedurende zeven minuten bij 2.500 keer zwaartekracht en vier graden Celsius. Het supernatant moet lichtgroen van kleur zijn. Als het breken van de cellen succesvol was, plaats de cellen opnieuw in suspensie in 50 milliliter H-twee-buffer en pelle ze gedurende 10 minuten bij 32.800 keer zwaartekracht en vier graden Celsius.
Vervolgens, na het opnieuw in suspensie brengen van de cellen in 10 milliliter H-drie-buffer, gebruik een pot om de gesuspendeerde palate te homogeniseren. Volgende om thal-koordsucrose-dichtheidsgradienten voor te bereiden. Begin met 12 milliliter cellen in H-drie-buffer.
Giet vervolgens langzaam een laag van 12 milliliter H-vier-buffer en eindig met 12 milliliter H-vijf-buffer. Gebruik H-vijf om de rotor in balans te brengen en centrifugeer de gradiënten gedurende een uur bij 70.700 keer zwaartekracht. Verwijder de TH-banden uit de gradiënten en gebruik een geschikt volume H-zes-buffer om ze te verdunnen.
Centrifugeer de cellen gedurende 20 minuten bij 37.900 keer zwaartekracht en vier graden Celsius. Als de pellet niet strak is, voegt u meer H-zes-buffer toe aan de centrifugatiestap. Plaats vervolgens opnieuw in suspensie.
Suspendeer de thal-koorden in een klein volume H-zes-buffer om een fotosysteemsucrose-dichtheidsgradient te laden. Bereken eerst de hoeveelheden thal-koorden, beta DM en H-zes-buffer die voor elke gradiënt nodig zijn. Volgens deze richtlijnen zal elke gradiënt 0,8 milligram per milliliter chlorofyl bevatten in 0,9% beta DM en H-zes-buffer zal het eindvolume op 700 microliter brengen.
Om de thys te solubiliseren, bereid afzonderlijke Eloqua met Thylakoids beta DM en H-zes-buffer voor elke gradiënt. Incubeer de monsters op ijs gedurende 20 minuten en draai om en om om te mengen. Na centrifugatie van de monsters bij 14.000 keer zwaartekracht gedurende 10 minuten en vier graden Celsius.
De pellet moet klein en witachtig zijn, en het supernatant zal donkergroen zijn. Laad het supernatant op de gradiënten in balans met H-zes-buffer en ultracentrifugeer gedurende 14 uur bij 134.470 keer zwaartekracht en vier graden Celsius. Na het centrifugeren, neem foto's van de gradiënten om vervolgens te fraczioneren.
Gebruik een naald om een gat in de bodem van de buis te prikken en verzamel fracties in buisjes van 500 microliter. Of een 96-wellsplaatproces. De monsters voor SDS-blad in gel vertering en massaspectrometrie volgens het tekstprotocol zoals hier getoond, met behulp van de resultaten van immunobloedanalyse fractie zes van wild type en fractie 13 van delta PS een.
Piekfracties van A en R een werden gekozen voor analyse van cyclische elektronenstroomsupercomplexcomponenten in deze figuur. Relatieve eiwitverhoudingen afgebeeld als wild type over delta PS een 14 N over 15 N voor verschillende PS een kern- en lichtverzamelende eiwitten van PS een, evenals voor eiwitten toegewezen aan het cyclische elektronenstroomsupercomplex, tonen de verschillen in abundantie van a NR een en CAS in fractie zes en 13 van wild type en delta PS een. Hier zijn de resultaten voor de kwantitatieve vergelijking van dit cyclische elektronenstroomsupercomplex tussen de wild type en een PG L een knock-out-stam. Interessant is dat HCF 1 36, cytochroom B zes, cytochroom B zes F-subeenheid vier en PET C verrijkt lijken te zijn in de wild type, terwijl FTSH twee, cytochroom F en PET O verrijkt lijken te zijn in PG L een.
Na het bekijken van deze video
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een vergelijkende analyse van de samenstelling van MultiPro-complexen in thal-koordmembranen onder verschillende omstandigheden. De methodologie omvat het isoleren van thal-membranen van lamona-cellen die zijn blootgesteld aan anaërobe omstandigheden en het analyseren van de eiwitsamenstelling door middel van massaspectrometrie.
Belangrijkste Studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Proteomics
- Celbiologie
- Massaspectrometrie
Achtergrond
- Het begrijpen van multi-eiwitcomplexen is cruciaal voor het verduidelijken van cellulaire functies.
- Verschillende omgevingsomstandigheden kunnen de eiwitsamenstelling beïnvloeden.
- Massaspectrometrie is een krachtig hulpmiddel voor kwantitatieve proteomische analyse.
- Vergelijkende studies kunnen inzichten opleveren in genetische variaties.
Doel van het onderzoek
- Om de samenstelling van MultiPro-complexen in thal-koordmembranen te analyseren.
- Om veranderingen in eiwitovervloed onder verschillende omstandigheden waar te nemen.
- Om een kwantitatieve proteomische aanpak te gebruiken voor gedetailleerde inzichten.
Gebruikte methoden
- Isolatie van thal-membranen uit lamona-cellen.
- Fractionering van membranen op een sucrosedichtheidsgradiënt.
- Mengen van gelijke volumes van gewenste fracties.
- Analyse van monsters door kwantitatieve massaspectrometrie.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van variaties in eiwitovervloed tussen fracties.
- Inzichten in de samenstelling van multi-eiwitcomplexen.
- Demonstratie van de effectiviteit van de vergelijkende proteomische aanpak.
- Belichting van de impact van anaërobe omstandigheden op de eiwitsamenstelling.
Conclusies
- De studie verduidelijkt met succes de samenstelling van MultiPro-complexen.
- Kwantitatieve massaspectrometrie is effectief voor proteomische analyse.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van eiwitdynamiek onder verschillende omstandigheden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Comparative analysis of multiprotein complexes using 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry enables precise interrogation of protein complex composition under varying genetic or environmental conditions. This approach enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking at early discovery and preclinical inflection points. The method supports portfolio decisions by providing robust, quantitative insights into protein complex dynamics relevant to disease models and functional pathway analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative comparison of protein complex composition across genetic backgrounds or conditions.
- Supports mechanistic de-risking by revealing novel or condition-specific complex components.
- Facilitates functional target validation through direct measurement of protein abundance and migration behavior.
- Provides data for prioritizing targets based on complex stability and composition.
Screening & Assay Development
- Prepares validated membrane protein complexes for downstream screening workflows.
- Standardizes sample input using equal chlorophyll concentrations and fraction volumes.
- Delivers reproducible, quantitative mass spectrometry outputs for assay development.
- Enables reliable detection of protein abundance shifts in response to perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein complex composition data with disease-relevant or stress-induced states.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by confirming complex integrity under model conditions.
- Provides mechanistic insights that inform risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust comparative analysis of protein complexes, supporting both hypothesis-driven and exploratory research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on protein complex assembly and component migration under defined conditions.
- Screening: Provides standardized, quantitative readouts suitable for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers mass spectrometry-based quantitative measurements for cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects protein complex composition to functional outcomes in disease or stress models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow adaptable to diverse protein complexes and experimental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across comparative proteomics studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by clarifying complex composition early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in membrane protein isolation, metabolic labeling, and quantitative mass spectrometry.
- Demands access to ultracentrifugation and high-resolution mass spectrometry infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptable to various model systems and environmental or genetic perturbations.
- Dependent on careful control of input concentrations and fractionation parameters for reproducibility.
