Name: Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op 15 N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Leer de vergelijkende analyse van multiproteïnecomplexen in thylakoïde membranen met kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode onthult eiwitdynamiek onder anaërobe omstandigheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

MH erkent steun van de &quot;Deutsche Forschungsgemeinschaft&quot; (DFG). Auteur bijdragen: MH opgezet onderzoek, KT, JS en MT uitgevoerde onderzoek en de gegevens geanalyseerd, KT en MH schreef de krant.

1. Kweken van Chlamydomonas <ol><li> De volgende C. reinhardtii stammen werden gebruikt in de huidige studie: WT cc124, WT cw15-arg7 (celwand deficiënte en arginine auxotroph), een ΔPSI mutante stam 29 en een pgrl1 knock-out stam 4. </li><li> Alle stammen werden gekweekt in Tris-acetaat-fosfaat (TAP)-medium 30 bij 25 ° C met een constante lichtintensiteit van 20-50 uE / m 2 s en schudden bij 120 rpm. De cultuur van ΔPSI moet worden ingepakt met een aantal papieren zakdoekje voor blootstelling aan licht van &lt;5 uE / m 2 sec. </li><li> De culturen van de gelabelde stammen (ΔPSI en WT cc124, respectievelijk) bevatte 7,5 mm 15 N NH 4 Cl, terwijl de culturen voor de nonlabeled stammen (WT cw15-arg7 en pgrl1, respectievelijk) bevatte 7,5 mm 14 N NH 4 Cl. Cellen moeten groeien minstens vier generatorionen volledige vermelding en bereiken moet exponentiële groeifase gehouden. </li><li> Op de dag voordat het experiment tellen en verdun cellen tot een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml in een volume van 750 ml / stam. </li></ol> Merk op dat twee soorten discontinue sucrose dichtheidsgradiënten worden in het volgende protocol. De fotosysteem sucrose dichtheidsgradiënten volgens Takahashi et al.. 9 worden gebruikt om de verschillende fotosynthetische eiwitcomplexen van geïsoleerde en gesolubiliseerde thylakoiden tijdens gedurende de nacht centrifugatie gescheiden en de dag worden voorbereid voor (zie protocol 2) en thylakoid sucrose dichtheidsgradiënten 8 zijn in de thylakoid isolatie procedure toegepast (zie Protocol nr. 3). 2. Voorbereiding van Fotosysteem sucrose dichtheidsgradiënten <ol><li> Voor het gieten van de hellingen drie stock oplossingen nodig: <ol><li> 2 M Sucrose </li><li> 10% β-DM in H2O </li><li> 0,5 M Tricine, pH 8,0 (NaOH) </li></ol></li><li> Met behulp van deze bestanden, de voorbereiding van de volgende oplossingen: <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> Concentratie: </td><td style="width:75px;"> 1.3 M </td><td style="width:75px;"> 1,0 M </td><td style="width:75px;"> 0.85 M </td><td style="width:75px;"> 0.7 M </td><td style="width:75px;"> 0.65 M </td><td style="width:75px;"> 0.4 M </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 2 M Sucrose </td><td style="width:75px;"> 13 ml </td><td style="width:75px;"> 10 ml </td><td style="width:75px;"> 8.5 ml </td><td style="width:75px;"> 7 ml </td><td style="width:75px;"> 6,5 ml </td><td style="width:75px;"> 4 ml </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 10%46,-DM </td><td style="width:75px;"> 100 pl </td><td style="width:75px;"> 100 pl </td><td style="width:75px;"> 100 pl </td><td style="width:75px;"> 100 pl </td><td style="width:75px;"> 100 pl </td><td style="width:75px;"> 100 pl </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 0,5 M Tricine </td><td style="width:75px;"> 200 gl </td><td style="width:75px;"> 200 gl </td><td style="width:75px;"> 200 gl </td><td style="width:75px;"> 200 gl </td><td style="width:75px;"> 200 gl </td><td style="width:75px;"> 200 gl </td></tr><tr height="20"><td height="21" style="height:20px;width:94px;"> H2O </td><td style="width:75px;"> 6,7 ml </td><td style="width:75px;"> 9.7 ml </td><td style="width:75px;"> 11.2 ml </td><td style="width:75px;"> 12,7 ml </td><td style="width:75px;"> 13.2 ml </td><td style="width:75px;"> 15.7 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Gebruik 14 mm x 89 mm centrifugebuizen en giet de gradiënten zeer langzaam beginnen met de hoogste dichtheid sucrose oplossing een lagere dichtheid oplossing. </li><li> Giet slechts 1 ml elk voor de 1,3 en 1,0 M oplossingen en 2 ml voor de rest van de oplossingen. </li><li> Verlaat gradiënten nacht in de koude kamer. </li></ol> 3. Anaërobe Inductie en isolatie van thylakoïdmembranen 8 <ol><li> Voordat de isolatie van thylakoïdmembranen induceren anaerobe omstandigheden door doorborrelen met argon 4 uur. Het borrelen kan worden uitgevoerd door een glazen pipet kweken kolven onder constant mengen van de kweek met een magnetische roerstaaf. </li><li> Begin met de isolatie van thylakoïdmembranen door pelleteren van de cellen gedurende 5 minuten bij 2500 xg, resuspendeer in H1 buffer (0,3 M sucrose, 25 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM MgCl2). (Let op dat bij het starten met de isolatie van thylakoïdmembranen monsters shOuld worden bewaard op ijs om eiwitafbraak te voorkomen, worden alle centrifugeren stappen uit bij 4 ° C en het werken met handschoenen wordt sterk aanbevolen om keratine besmetting te voorkomen.) </li><li> Pellet cellen gedurende 5 minuten bij 2500 xg, resuspendeer in H1 buffer. </li><li> Breken cellen met twee passages door een verstuiver met een stikstofdruk van 1500 hPa (voor stammen zonder celwand doen slechts een passage). </li><li> Spin down cellen gedurende 7 minuten bij 2500 x g. (Na deze stap wordt het supernatant moet licht groen, indien niet, het breken van de cellen was niet succesvol.) </li><li> Resuspendeer cellen in H2 buffer (0,3 M sucrose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) en pellet cellen gedurende 10 min bij 32.800 x g. </li><li> Resuspendeer cellen in H3 buffer (1,8 M sucrose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) en homogeniseer pellet met een potter (geen groene deeltjes moeten aan het eind van deze bewerkingsstap blijven). </li><li> Bereid thylakoid sucrose dichtheidsgradiënten in bades (25 mm x 89 mm) door te beginnen bij de bodem met een laag van 12 ml H3 buffer met cellen, giet een middenlaag van 12 ml H4-buffer (1,3 M sucrose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA ( pH 8,0)) en bovendien 12 ml H5 buffer (0,5 M sucrose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)). Wees voorzichtig bij het gieten van de hellingen en voorkomen dat het mengen van de drie lagen. </li><li> Evenwicht te brengen met H5 buffer en centrifugeer thylakoid sucrose dichtheidsgradiënten 1 uur bij 70.700 x g. </li><li> Verwijder thylakoid bands uit de thylakoid sucrose dichtheidsgradiënten en verdun ze met een geschikt volume H6 buffer (5 mM HEPES (pH 7,5) 10 mM EDTA (pH 8,0)). </li><li> Spin down cellen bij 37.900 xg gedurende 20 minuten. Indien de pellet niet strak is meer H6 buffer vereist voor deze centrifugatie stap. </li><li> Resuspendeer thylakoiden in een klein volume H6 buffer en ga verder met de bepaling van de concentratie chlorofyl. </li></ol> 4. Bepaling van chlorofylconcentratie 31 </sup&gt; <ol><li> De bepaling van de hoeveelheid chlorofyl wordt uitgevoerd met 80% aceton. </li><li> Meng 995 ul 80% aceton en 5 ul van thylakoiden in H6 buffer (verdunning 1:200). </li><li> Vortex gedurende enkele seconden tot er geen groene deeltjes blijven en dan spin down op 14.1 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Neem de bovenstaande vloeistof en meet de extinctie bij 663,6 en 646,6 nm en 750 nm respectievelijk. </li><li> Bereken de hoeveelheid chlorofyl met de volgende formules: <ol><li> C Chl a [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6-0,00255 * E 646,6) * verdunningsfactor </li><li> C Chl b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6-0,00491 * E 663,6) * verdunningsfactor </li><li> C Chl [mg / ml] = C Chl a + C Chl b </li></ol></li></ol> 5. Laden van Fotosysteem sucrose dichtheidsgradiënten <ol><li> Bereken de hoeveelheden thylakoiden, β-DM en H6 buffer die nodig zijnVoor elke gradiënt: <ol><li> Elke gradiënt moet worden geladen met een totaal volume van 700 pi met 0,8 mg / ml chlorofyl in 0,9% β-DM (oplossen β-DM in H2O), vult het resterende volume H6 buffer. </li></ol></li><li> Voor het oplosbaar bereiden verschillende fracties met thylakoiden, β-DM en H6 buffer voor elke helling. </li><li> Verlaat monsters gedurende 20 minuten op ijs met regelmatig mengen (omkeren) om de paar minuten (oplosbaarmakingsstap). </li><li> Centrifugeer bij maximale snelheid (14.000 x g) gedurende 10 min bij 4 ° C. (Na centrifugatie dient de pellet klein en witachtig terwijl de supernatant donkergroene.) </li><li> Laad supernatant op de hellingen. </li><li> Schalen met H6 buffer en draaien met ultracentrifuge bij 134.470 xg gedurende de nacht (14 uur) bij 4 ° C. (Houd er rekening mee dat de succesvolle scheiding van fotosynthetische complexen met behulp van fotosysteem sucrose dichtheidsgradiënten zoals gepresenteerd in dit protocol alleen wordt bereikt wanneer using vers geïsoleerde thylakoiden, omdat een voorspelling voor het oplosbaar en complexe scheiding is moeilijk om bij het werken met thylakoidmembranen die eerder zijn ingevroren te maken.) </li></ol> 6. Fractionering van Fotosysteem sucrose dichtheidsgradiënten <ol><li> Neem foto&#39;s van de hellingen. </li><li> Doorboren gat in de bodem van de buis met behulp van een naald en fractioneren gradiënten in 500 pl buizen. Alternatief kan de fractionering worden uitgevoerd met een 96-putjesplaat (microtiterplaat). </li><li> Bij gebruik van een microplaat, bepalen absorptie van verschillende gradiënt fracties bij 675 nm. (Bij deze stap monsters kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende enkele weken.) </li></ol> 7. SDS-PAGE en Immunodetectie (Let op: alleen voor de vergelijking van WT versus ΔPSI een western blot analyse is uitgevoerd om de fracties voor de volgende MS-analyse te selecteren. Voor het experiment WT vs pgrl1 fracties werden gekozen na de absorptie in de verschillende fracties.) <ol><li> Afzonderlijke 30 pi van elke fractie uit WT en ΔPSI gradiënt op een 13% SDS polyacrylamidegel 32. </li><li> Voer western blot analyse 33 met de volgende antilichamen: ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, CAS 6, de PSI subunit PSAD 32 en de PSII kern subunit D1. Gebruik alle antilichamen met een verdunning van 1:1.000 (voor verbeterde chemiluminescentie detectietechniek), behalve de D1 antilichaam, die moet worden gebruikt met een verdunning van 1:10.000. </li><li> Op basis van de resultaten van de immunodetectie, neem de piekfracties van ANR1, PGRL1 en PSAD voor WT en ΔPSI (hier fracties 6 en 13, respectievelijk), meng 30 ul van fractie 6 van WT en ΔPSI en doe hetzelfde met fractie 13 uit zowel preparaten en scheiden ze weer op een 13% SDS-polyacrylamide gel. </li><li> Voor de kwantitatieve vergelijking van WT versus pgrl1 nemen de CEF-supercomplex fracties bepaald door de absorptie in de verschillende gradiëntfracties en meng 30 pl van beide monsters, gevolgd door scheiding op een 13% SDS polyacrylamidegel. </li><li> Vlekken de eiwitbanden met Coomassie-oplossing (85% fosforzuur, 757 mM ammoniumsulfaat, 1,2% Coomassie brilliant blue, 20% methanol) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of gedurende de nacht bij 4 ° C. </li><li> Om niet-specifieke kleuring te verwijderen, wassen meerdere malen met DDH 2 O. </li><li> Snijd de rijstroken in 1 mm gel stukken en ga verder met de in-gel spijsvertering. (Als alternatief, monsters kunnen worden gedroogd een paar minuten in een vacuüm centrifuge en opgeslagen voor een paar weken voordat u verder gaat met de in-gel spijsvertering.) </li></ol> 8. In-gel Spijsvertering (Gewijzigd van Shevchenko et al.. 35) Let op om alle buffers en oplossingen kort voor gebruik bereiden en te nemen glazen flessen voor buffers met acetonitril (ACN). &lt;br /&gt; LET OP! Werken met ACN kan schadelijk zijn; meer informatie kan worden gedownload van: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013). <ol><li> Was gelstukken met&gt; 10 volumina DDH 2 O (-200 pl) gedurende 30 sec. </li><li> Incubeer de gelstukken met 300 pi 25 mM NH 4 HCO 3 gedurende 15 minuten onder schudden, verwijdert vloeistof. </li><li> Incubeer de gelstukken met 300 pi 25 mM NH 4 HCO 3 in 50% ACN (bereid door ACN en 50 mM NH 4 HCO 3 in een verhouding van 1:1) gedurende 15 minuten onder schudden, verwijdert vloeistof. </li><li> Als de gel stukken zijn nog steeds blauw, herhaal dan de NH 4 HCO 3 en NH 4 HCO 3 / ACN wast tot de meeste van de Coomassie wordt verwijderd. (Hoewel het grootste deel van Coomassie kleuring moet worden verwijderd, is het niet nodig de gelstukken volledig destain.) </li><li> Voeg 100 ul van ACN aan de gel stukken gedurende 5 minuten uitdrogen. De gel stukken moeten krimpennd kijken helemaal wit. </li><li> Verwijder zoveel ACN mogelijk en ga verder met trypsine spijsvertering. Als alternatief kunnen monsters worden bewaard bij -20 ° C gedurende enkele weken. </li><li> Voeg 10-20 ul per band van 20 ng / ul trypsine in 10% ACN / 25 mM NH 4 HCO 3 (vers verdund), blijven monsters op ijs. </li><li> Na 30 min, controleren of alle oplossing werd geabsorbeerd en voeg meer trypsine buffer, indien nodig. Gel stukken moet volledig bedekt met trypsine buffer. Blijf monsters op ijs. </li><li> Verlaat gel stukken voor nog eens 90 minuten op ijs te verzadigen met trypsine. (Kritische stap: De opbrengst van tryptische peptiden aanzienlijk toe met toenemende incubatietijden op ijs, waarschijnlijk door langzame diffusie van het enzym in de matrix polyacrylamide Er moet een kleine overmaat oplossing te hebben die de gelstukken te voorkomen dat de stukken. vallen droog tijdens de nachtelijke incubatie.) </li><li> Digest bij 37 ° C gedurende 4-6 uur. Voor experimenten diemaximale peptide herstel, verteren &#39;s nachts. </li><li> Na vertering spin down verkorte buffer. </li><li> Sonificeer buizen gedurende 5 min naar peptiden en centrifugeer weer elueren. </li><li> Verzamel supernatant en overbrengen naar een nieuwe buis. </li><li> Voer peptide extractie met 80 ul van 30% ACN / 1% mierenzuur (FA) in een sonische bad gedurende 15 minuten. </li><li> Voer extractie met 80 ul van 30% ACN / 1% FA in een sonisch bad gedurende 15 minuten. </li><li> Voer extractie met 80 ul van 70% ACN / 1% FA in een sonisch bad gedurende 15 minuten. </li><li> Centrifuge weer en het zwembad supernatant met voorafgaande eluaat. (FA dient om trypsine te inactiveren en verhoging peptide oplosbaarheid.) </li><li> Droge peptide oplossing volledig in een vacuüm centrifuge. (Op dit punt monsters kunnen worden bewaard gedurende enkele weken -20 ° C alvorens MS-analyse.) </li><li> Hersuspenderen peptiden in 6 pl MS buffer (5% ACN, 0,1 v / v FA, water) en ultrasone trillingen gedurende 2-5 minuten. </li><li> Centrifugeer monsters op maximum snelheid gedurende 5 min aan fijn materiaal te verwijderen. </li><li> Gebruik 4 pl supernatant voor massaspectrometrische analyse. </li></ol> 9. MS-Data Analysis met &quot;Proteomatic&quot; De data-analyse werd uitgevoerd met de open-source software &quot;Proteomatic&quot; (die http://www.proteomatic.org/ kan worden gedownload), een platform waarmee de generatie en de voltooiing van de MS / MS data evaluatie pijpleidingen, door gebruik te maken gratis en commerciële software 36. In het kort worden de instellingen die hieronder worden beschreven en meer gedetailleerde informatie kan worden gevonden in 6,26. <ol><li> Identificatie en kwantificering van MS-gegevens Identificatie en kwantificering van eiwitten van de experimenten WT versus ΔPSI werden gedaan met OMSSA (versie 2.1.4 37) en qTrace 26 respectievelijk beschreven 6,26. Voor de MS-analyse van gegevens uit het experiment WT vs pgrl1 de volgende bijgewerkte pijpleiding werd gebruikt:<ol><li> Naast OMSSA 37 werden eiwitten ook geïdentificeerd met X! Tandem (versie 2013/02/01 38). Beide algoritmes werden door te zoeken tegen een database gegenereerd door het combineren van de JGI Chlamydomonas gen modeldatabase versie 4.3 met de AUGUSTUS databaseversie 10,2 alsook tegen een gezamenlijke database van de NCBI toegepaste databases BK000554.2 en NC_001638.1. </li><li> MS 2 identificatie van peptiden werd uitgevoerd met behulp van een doel-decoy benadering 39. Een valstrik voor elk eiwit is gemaakt door willekeurig schuifelen tryptische peptiden met behoud van de redundantie van nonproteotypic peptiden. </li><li> Statistische validatie van de peptiden werd uitgevoerd met de software qvality (versie 0.3.3 40) met een achterste foutkans (PEP) drempel van minder dan 0,01 en de resultaten werden gefiltreerd met een precursor massatolerantie van 5 dpm. </li><li> Peptiden uit OMSSA en X! Tandem runs werden samengevoegd en gekwantificeerd met qTrace <sup&gt; 26 toepassing van de volgende filter stappen: vereisen MS 2 identificatie, voeg eiwit naam / groep informatie en vereisen beide zus peptiden. </li></ol></li></ol> Om te onderzoeken of proteïne verhoudingen significant verschillend ten opzichte van elkaar in de gemengde CEF-supercomplex fracties van WT en pgrl1, werd statistische analyse uitgevoerd toepassing van SPSS software (versie 21). De subeenheden van het cytochroom b 6 / f complex getest tegen elkaar en de eiwitten FNR, FTSH2 en HCF136 tegen de PSI subeenheden. De peptide verhoudingen van elke scan telling per eiwit van alle vier herhalingen werden getest op een normale verdeling met de Shapiro-Wilks test. Aangezien het peptide populaties niet normaal verdeeld (p &lt;0,001), werden niet-parametrische statistieken uitgevoerd. Eerst werd de Kruskal-Wallis-test toegepast beoordeling van een aanzienlijke afwijking tussen groepen. Alleen als deze test voorspelde significant verschils tussen groepen werd verder onderzoek uitgevoerd om significante verschillen tussen twee onafhankelijke groepen voorspellen met de Mann-Whitney U-test.

De auteurs verklaren geen concurrerende financieel belang.

Verschillende kwantitatieve proteomics studies met behulp van stabiele isotopen zijn gepubliceerd in de laatste jaren. In deze experimenten gewoonlijk twee verschillende monsters worden vergeleken, waarvan een monster wordt gelabeld met een stabiele isotoop. Daarna eiwitten of peptiden uit beide monsters worden gecombineerd in gelijke ratio en verder samen verwerkt 48. Dergelijke studies vaak van plan om bepaalde geïsoleerde cellulaire compartimenten (bv chloroplasten, mitochondriën, of thylakoidmemb...

Fotosynthetische processen thylakoidmembranen planten en algen kan functioneren in een lineaire en cyclische modus. Tijdens lineaire elektronenstroom (LEF) fotosysteem I (PSI), fotosysteem II (PSII) en cytochroom b 6 / f uiteindelijk elektronen overdragen van water NADP + 1, leidt tot de generatie van NADPH en ATP 2. Daarentegen cyclische elektronenstroom (CEF), bekend onder verschillende milieuomstandigheden achtige toestand 2 en 3 anaërobe omstandigheden 4, bepaalt het re-reductie van geoxideerd SIP door het injecteren van elektronen terug in de elektronen transportketen wordt geïnduceerd. Dit proces kan zowel in de stroma van het cytochroom b 6 / f complex 1 of de plastoquinone zwembad 5 genereert en ATP, maar geen NADPH 2. Het doel van het huidige protocol is een massaspectrometrie (MS) gebaseerd m aantonenMETHODE voor de vergelijkende, kwantitatieve analyse van multiprotein complexen thylakoidmembranen van Chlamydomonas reinhardtii inzicht in de samenstelling van deze complexen krijgen onder verschillende omstandigheden (zoals geïllustreerd door vergelijking van genetisch verschillende stammen). Deze benadering werd toegepast in een publicatie van Terashima et al.. In 2012 met een Ca2 +-afhankelijke regulering van CEF in C. reinhardtii gemedieerd door een multi-eiwitcomplex waaronder de eiwitten CAS, ANR1 en PGRL1 6. De procedure wordt toegelicht door relatief analyse van de samenstelling van de CEF-supercomplex twee genetisch verschillende stammen, waardoor maken van etikettering een van de twee stammen met zware stikstof (15 N). In het kort, het protocol omvat de voorbereiding van thylakoïdmembranen, gevolgd door detergens en fractionering van fotosynthetische complexen in een sucrosegradiënt dichtheid. Na fractionering van de gradiënt, geselecteerd fracties van twee stammen worden gemengd op basis van gelijke omvang, door SDS-PAGE gevolgd door in-gel-digestie en daaropvolgende kwantitatieve MS analyse. Zoals hierboven vermeld, wordt CEF geïnduceerd onder verschillende omgevingsomstandigheden en een publicatie uit 2010 toont de isolatie van een functionele CEF-supercomplex van staat 2 vergrendelde cellen van C. reinhardtii 7, die werd uitgevoerd door het scheiden van opgeloste thylakoidmembranen op een sucrose dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie bij. Verschillend van Iwai et al.. 7, de gepresenteerde protocol beschrijft de isolatie van de CEF-supercomplex van anaërobe gegroeid C. reinhardtii culturen door het volgen van een alternatieve procedure. Dit omvat veranderingen in de thylakoid isolatieprotocol en verschillen betreffende de solubilisatiestap en de scheiding van eiwitcomplexen door ultracentrifugatie. In het huidige protocol, thylakoïdmembranenworden geïsoleerd door toepassing van de procedure gepubliceerd door Chua en Bennoun 8, terwijl de buffers gebruikt thylakoid voorbereiding door Iwai et al.. bevatte 25 mM Mes, 0,33 M sucrose, 5 mM MgCl2, 1,5 mM NaCl (pH 6,5) zoals beschreven 9. De solubilisatie werd uitgevoerd met 0.7-0.8% detergens (n-tridecyl-β-D-maltoside) gedurende 30 min op ijs bij Iwai en medewerkers, terwijl het oplosbaar hier beschreven methode is gebaseerd op het gebruik van 0,9% detergens (n -Dodecyl-β-D-maltoside (β-DM)) en is uitgevoerd voor slechts 20 minuten op ijs. Beide groepen die 0,8 mg chlorofyl per ml voor de solubilisatie van de respectievelijke wasmiddel. Voor de scheiding van fotosynthetische complexen van opgeloste thylakoidmembranen Iwai et al.. Toegepast sucrose concentraties van 0,1-1,3 M, terwijl de auteurs van dit protocol gebruikte concentraties variërend 0,4-1,3 M. Het laatste verschil is de centrifugeersnelheid, wat lager is dan aan de earlier publicatie. Oplossen van thylakoidmembranen met ionogene detergentia gevolgd door sucrose dichtheidsgradiënt fractionering reeds toegepast in talloze studies variërend van 1980 tot heden 7, 9-14 en tevens de toepassing van metabolisch merken van eiwitten is een wijdverspreide methode op het proteomics. De beschreven aanpak geldt de 15 N metabolisch merken van een van de twee vergeleken stammen door kweken in de aanwezigheid van zware stikstof als enige stikstofbron in de vorm van 15 N NH4Cl, die is opgenomen in alle aminozuren leidt tot een massale verschuiven afhankelijk van de aminozuursequentie van het peptide. Bij het ​​analyseren van een mengsel van 14 N en 15 N binnen een MS draaien, kan deze massa verschuiving worden gebruikt om het monster herkomst te bepalen voor elk peptide en peptide relatieve abundanties kan worden berekend die relatieve abundanties van de overeening eiwit 15. Talrijke kwantitatieve proteomics studies op C. reinhardtii beschikbaar die een bepaalde hoeveelheid eiwit vergelijken veranderingen in het proteoom tussen experimentele omstandigheden (bijvoorbeeld veranderingen in het proteoom door nutriënten, 16-19 of lichte belasting 20,21) geanalyseerd. Vergeleken bij deze studies de momenteel weergegeven benadering gelijke volumes van monsters worden gecombineerd en geanalyseerd. Deze opstelling laat het migratiegedrag van proteïnen in de gradiënt en bovendien de samenstelling van verschillende complexen met betrekking tot de onderzochte stammen te analyseren. Deze werkwijze wordt toegelicht door hoofdzakelijk concentreren op drie eiwitten: De eerste kandidaat is de chloroplast gelokaliseerde eiwitten calcium sensor CAS, dat werd aangetoond dat het betrokken foto-acclimatisatie in C. reinhardtii 22. Calcium wordt beschouwd als een belangrijk signaaling ion voor trajecten die worden geactiveerd door verschillende biotische en abiotische stress uiteindelijk leidt tot veranderingen in genexpressie en celfysiologie 23 en er werd voorgesteld dat chloroplasten kunnen bijdragen tot cellulaire Ca 2 +-signalen via de CAS eiwit 22,24,25. Het tweede eiwit is ANR1 (anaërobe reactie 1 6), een eiwit dat werd opgenomen onder anoxische groeiomstandigheden wordt geïnduceerd in C. reinhardtii 26. Met name CAS en ANR1 werden geïdentificeerd als subeenheden van de CEF-supercomplex en bovendien met behulp van omgekeerde genetische technieken werd aangetoond dat beide eiwitten functioneel bijdragen aan CEF in vivo 6, steun voor de rol functionele subeenheden van het eiwitcomplex. Het derde eiwit is het eiwit thylakoid PGR5-Like 1 (PGRL1), dat werd aangetoond dat het betrokken in CEF Chlamydomonas 4,27 en 5,28 in Arabidopsis en ook identified in het werk van Iwai et al.. 7 Wildtype (WT) versus (vs) een ΔPSI 29 stam vertoont een deletie van de PSAB gen codeert voor een essentiële fotosysteem I subeenheid, die ook deel uitmaakt van het: Deze benadering wordt door tonen de resultaten van twee experimenten worden gepresenteerd CEF-supercomplex en WT versus een pgrl1 knock-out stam 4. Voor elk van deze experimenten is de kwantitatieve samenstelling van de CEF-supercomplex tussen 15 N en een 14 N-gemerkte stam vergeleken.

<table><tbody><tr><td>Chemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>AppliChem</td><td>A0662</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>AppliChem</td><td>A2300</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Acetonitril Optigrade voor LC-MS</td><td>Diagonal</td><td>9340</td><td>Schadelijk, werk met handschoenen. Zie protocoltekst voor verdere voorzorgsmaatregelen. https://www.diagonal.de/</td></tr><tr><td>Ammoniumchloride 15N</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>39466-62-1</td><td>http://www.isotope.com/cil/index.cfm</td></tr><tr><td>Ammoniumchloride 14N</td><td>AppliChem</td><td>A0988</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Ammoniumwaterstoffosfaat&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3583</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfaat&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3598</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Coomassie briljantblauw R-250</td><td>Fisher Scientific</td><td>10041653</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-maltoside</td><td>AppliChem</td><td>A0819</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AppliChem</td><td>A2937</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Mierenzuur&nbsp;&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3858</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>AppliChem</td><td>A4425</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>AppliChem</td><td>A2954</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Fosforzuur</td><td>AppliChem</td><td>A0989</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Dikaliumboorwaterstoffosfaat&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Kaliumdiwaterstoffosfaat&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1043</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>AppliChem</td><td>A1551</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>AppliChem</td><td>A1125</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A2264</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr><tr><td>Trypsine (sequentiegrad gemodificeerd) en Trypsine buffer</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>http://www.promega.de/</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vernevelder (BioNeb cell disruptor)</td><td>Glas-Col</td><td></td><td>http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75</td></tr><tr><td>Centrifugebuizen (14 mm x 89 mm)&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>voor bereiding van Takahashi stijl gradients
http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Centrifugebuizen 25 mm x 89 mm </td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>voor bereiding van thylakoïde isolatie gradients.
http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Fuchs-Rosenthal celtellingskamer</td><td>Diagonal</td><td>449/72</td><td>https://www.diagonal.de/</td></tr><tr><td>Homogenisator (Potter) 50 ml&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>10618242</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td></tr><tr><td>Pistool voor homogenisator</td><td>Fisherbrand</td><td>105252220</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>website: http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Overig</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antilichamen&nbsp;</td><td>Agrisera</td><td></td><td>http://www.agrisera.com/en/index.html</td></tr></tbody></table>

een nieuwe aanpak voor de vergelijkende analyse van de multiprotein complexen gebaseerd op<sup&gt; 15</sup&gt; n metabole labeling en kwantitatieve massaspectrometrie

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

De geïntroduceerde protocol voorziet in een instrument voor de analyse van multiprotein complexen in de thylakoidmembraan, door de onthulling van inzichten in complexe samenstelling onder verschillende omstandigheden. In dit protocol de benadering wordt aangetoond door de samenstelling van het eiwitcomplex belast cyclische elektronenstroom (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, geïsoleerd uit genetisch verschillende stammen. De werkwijze omvat het isoleren van thylakoïdmembranen, gevolgd door fasescheiding in multiprotein complexen sucrose dichtheidsgradiënt centrifugatie, SDS-PAGE, immunodetectie en vergelijkende, kwantitatieve massaspectrometrie (MS) op basis van differentiële metabolisch merken (14 N / 15 N) van de geanalyseerde stammen. Reinigingsmiddel oplosbaar thylakoidmembranen worden geladen op sucrose dichtheidsgradiënten op gelijke concentratie chlorofyl. Na ultracentrifugeren worden de gradiënten gescheiden in fracties, die worden geanalyseerd door massa-spectrometry op basis van gelijk volume. Deze aanpak maakt het onderzoek naar de samenstelling binnen de gradiënt fracties en bovendien om de migratie gedrag van verschillende eiwitten te analyseren, in het bijzonder gericht op ANR1, CAS, en PGRL1. Bovendien is deze werkwijze blijkt uit de resultaten bevestigen met immunoblotting alsmede door ondersteuning van de bevindingen uit eerdere studies (identificatie en PSI-afhankelijke migratie van proteïnen die eerder beschreven deel van de CEF-supercomplex zoals PGRL1, FNR, en CYT f). Met name deze aanpak is toepasbaar op een breed scala aan vragen waarop dit protocol kan worden vastgesteld en bijvoorbeeld gebruikt voor vergelijkende analyses van multi-eiwitcomplex samenstelling geïsoleerd uit verschillende milieu-omstandigheden te pakken.

De geïntroduceerde kwantitatieve proteomics aanpak is gericht op de samenstelling van multiprotein complexen karakteriseren thylakoidmembranen blijkt uit de vergelijkende analyse van CEF-supercomplex componenten in genetisch verschillende C. reinhardtii stammen. De beschreven methode is met succes door Terashima et al.. 6 is toegepast en omvat de isolatie van thylakoïdmembranen van anaërobe gegroeid culturen, gevolgd door reinigingsmiddel oplosbaar. Vervolgens worden de monsters geladen op e...

De beschreven vergelijkende, kwantitatieve proteomics aanpak is gericht op het verkrijgen van inzicht in de samenstelling van multiprotein complexen onder verschillende omstandigheden en wordt aangetoond door het vergelijken van genetisch verschillende stammen. Voor kwantitatieve analyse gelijke volumes van verschillende fracties van een sucrose dichtheidsgradiënt gemengd en geanalyseerd met massaspectrometrie.

Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Het algemene doel van deze procedure is om de samenstelling van MultiPro-complexen in thal-cordmembranen onder verschillende omstandigheden vergelijkend te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst thal-membranen te isoleren uit lamona-cellen die zijn blootgesteld aan anaerobe omstandigheden. Vervolgens worden de th-cordmembranen gesolubiliseerd en gefractioneerd op een sucrose-dichtheidsgradiënt.Vervolgens worden gelijke volumes van de gewenste fracties gemengd en gescheiden via SDS-PAGE. Ten slotte worden de met kumasi gekleurde banden gedigesteerd met trypsine. Uiteindelijk worden de monsters geanalyseerd met kwantitatieve massaspectrometrie om veranderingen in de eiwitabondantie tussen de onderzochte fracties waar te nemen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals kwantitatieve proteomische studies waarbij een gedefinieerde hoeveelheid eiwit wordt vergeleken, is dat in onze benadering gelijke volumes van gefractioneerde monsters worden gecombineerd en geanalyseerd. Dit maakt het mogelijk om het migratiegedrag van eiwitten binnen de gradiënt te bestuderen en bovendien de samenstelling van verschillende niet-eiwitcomplexen in het derde

a-new-approach-for-comparative-analysis-multiprotein-complexes-based

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Massaspectrometrie heeft bewezen een waardevol instrument voor het analyseren van grote eiwitcomplexen worden. Deze methode maakt het mogelijk inzicht in de samenstelling, de stoichiometrie en de algemene structuur van multi-subunit assemblages. We beschrijven hier, stap-voor-stap hoe u een structurele massaspectrometrie analyse uit te voeren, en karakteriseren macromoleculaire structuren.

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Wij presenteren een variatie van de QUICK (kwantitatieve Immunoprecipitatie combinatie met Knockdown) benadering die eerder werd onderscheid te maken tussen echte en valse eiwit-eiwit interacties. Onze aanpak is gebaseerd...

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

We beschrijven hier een nieuwe, robuuste en efficiënte tandem affinity-zuivering (TAP) methode voor de expressie, isolatie en karakterisering van eiwitcomplexen uit eukaryote cellen. Dit protocol kan worden gebruikt voor de biochemische karakterisering van discrete complexen, evenals voor de identificatie van nieuwe interactoren en post-translationele modificaties die hun functie reguleren.

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

Gecombineerd voorloper isotopische labeling en isobare tagging (cPILOT) is een kwantitatieve proteomics strategie die steekproef multiplexing mogelijkheden van isobarisch labels verbetert. Dit protocol beschrijft de toepassing van cPILOT op weefsels van de ziekte van Alzheimer muismodel en wildtype controles.

Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

De architectuur van eiwitcomplexen is essentieel voor hun functie. Diverse massaspectrometrische technieken combineren bewezen krachtige te bestuderen van hun vergadering. Wij bieden protocollen voor chemische dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie en laten zien hoe deze complementaire technieken helpen ophelderen van de architectuur van multi subeenheid eiwit assemblages.

Chemische dwarsbinding en massaspectrometrie van Intact eiwitcomplexen te bestuderen de architectuur van multi subeenheid eiwit assembly's combineren

Dit manuscript beschrijft het protocol voor Bimolecular complementatie affiniteit zuivering (BiCAP). Deze nieuwe methode vergemakkelijkt de specifieke isolatie en downstream proteomic karakterisering van elk twee interacterende eiwitten, terwijl met uitzondering van VN-complexvorm individuele eiwitten evenals complexen gevormd met concurrerende bindende partners.

Ontleden multi signalering eiwitcomplexen door Bimolecular complementatie affiniteit zuivering (BiCAP)

De Spectrometrie van de massa (MS) heeft ontpopt als een belangrijk instrument voor het onderzoek naar de structuur en de dynamiek van macromoleculaire assemblages. Hier, wij op basis van MS om te ondervragen eiwit complexvorming en ligand bindende benaderingen worden geïntegreerd.

Analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-Ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie

Het beschreven protocol biedt een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-analyse van weefselmonsters met behulp van twee benaderingen: labelgebaseerde en labelvrije kwantificering. Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten, terwijl een labelvrije aanpak kosteneffectiever is en wordt gebruikt om honderden monsters van een cohort te analyseren.

Uitgebreide workflow van op massaspectrometrie gebaseerde Shotgun Proteomics van weefselmonsters

De experimentele procedures voor het uitvoeren van covalente etikettering op basis van diethylpyrocarbonaat met massaspectrometrische detectie worden beschreven. Diethylpyrocarbonaat wordt eenvoudig gemengd met het eiwit- of eiwitcomplex van belang, wat leidt tot de wijziging van oplosmiddeltoegankelijke aminozuurresiduen. De gemodificeerde residuen kunnen worden geïdentificeerd na proteolytische vergisting en vloeistofchromatografie/massaspectrometrieanalyse.

Covalente etikettering met diethylpyrocarbonaat voor het bestuderen van eiwitstructuur in hogere orde door massaspectrometrie

Hier presenteren we een protocol voor de verrijking van endogene fosfoproteïnefosfatasen en hun interagerende eiwitten uit cellen en weefsels en hun identificatie en kwantificering door op massaspectrometrie gebaseerde proteomica.

Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

Leer de vergelijkende analyse van multiproteïnecomplexen in thylakoïde membranen met kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode onthult eiwitdynamiek onder anaërobe omstandigheden.

Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op 15 N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal

Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op

Meer video's verkennen