Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten
17 december 2013
Dit protocol beschrijft een gevoelige, cel-gebaseerde cytotoxiciteit assay. Door het tellen van de afname in frequentie van levende doelwit CD4+ T-cellen in aanwezigheid van een toenemend aantal effector CD8+ T-cellen, staat deze assay toe de directe beoordeling van de cytolytische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen.
Het algemene doel van deze procedure is het meten van de cytotoxische activiteit van antigeenspecifieke CD8 T-cellen met behulp van een celgebaseerde flowcytometrie-assay. Dit wordt eerst bereikt door effector CD8 T-cellen zes dagen lang te expanderen in aanwezigheid van het betreffende peptide; in de tweede stap worden target CD4 T-cellen gepulst met het betreffende peptide en vervolgens gemengd met niet-gepulste CD4 T-cellen. Vervolgens worden de effector CD8 T-cellen en target CD4 T-cellen zes uur lang gecocultiveerd bij verschillende effector-target-ratio's.
In de laatste stap worden de doding van de met peptiden beladen target CD4 T-cellen en het aantal effector CD8 T-cellen gekwantificeerd via flowcytometrie. Uiteindelijk kan de intrinsieke dodingcapaciteit van de antigeenspecifieke CD8 T-cellen, uitgedrukt in lytische eenheden, worden berekend. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van assays zoals de chromium-release assay, zijn dat deze techniek gebruikmaakt van autologe primaire targetcellen in plaats van geïmmortaliseerde cellijnen en de werkelijke targetcel.
Daarnaast zijn de aantallen effectorcellen kwantificeerbaar op het niveau van individuele cellen. Nu zal een onderzoeksassistent in mijn laboratorium de procedure demonstreren om de CD8-positieve effectorcellen te isoleren. Begin met het ontdooien van autologe cryogepreserveerde PBMC in een waterbad van 37 °C, en was de cellen vervolgens in maximaal 50 mL compleet medium.
Verdun na het tellen de pbmc tot een concentratie van 5 miljoen cellen per milliliter in completen medium en voeg vervolgens IL-2 en het peptide van belang toe aan de cultuur. Zaai daarna één milliliter van de celsuspensie in elke put van een 96-wells plaat. Vervang na drie dagen cultuur de helft van het supernatant door vers compleet medium. Gebruik na zes dagen cultuur een multichannelpipet om de cellen over te brengen naar een steriel reservoir, waarna de cellen geteld en gewassen worden.
Resuspendeer de pellet op 50 miljoen cellen per milliliter in een scheidingsbuffer en incubeer de pbmc in een ronde buis van 14 milliliter met een human CD eight positive T-cel verrijkingscocktail op 50 µL per milliliter cellen bij kamertemperatuur. Incubeer de cellen na 10 minuten gedurende nog eens vijf minuten met anti CD eight IgG-geconjugeerde magnetische deeltjes op 150 µL per milliliter, en vul de celsuspensie vervolgens aan tot zeven milliliter met extra scheidingsbuffer. Plaats de buis in de scheidingsmagneet. Giet de cellen na vijf minuten, terwijl de buis nog in de magneet staat, in een conische buis van 15 milliliter. Kleur vervolgens een klein aliquoot van de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C met antilichamen tegen CD three en CD eight in PBS aangevuld met 2% FBS.
Bevestig via flowcytometrie dat de zuiverheid van de cellen 95% CD8 positief of hoger is. Voeg nu 225 µL compleet medium toe aan vijf buisjes met schroefdop en verdun de cellen vervolgens serieel van 1:2 tot 1:32. Om de CD4 positieve doelcellen te isoleren, begint u met het ontdooien van autologe cryobewaarde PBMC in een waterbad van 37 °C.
Breng de ontdooide cellen over naar een conische buis van 50 milliliter die 10 milliliter medium bevat. Verrijk de CD4-expresserende T-cellen via scheiding met magnetische deeltjes zoals zojuist gedemonstreerd, waarbij een zuiverheid van 95% of hoger van CD4-positieve T-cellen via flowcytometrie wordt bevestigd. Verdeel de cellen na het tellen over twee conische buizen van 15 milliliter en was deze vervolgens in warme PBS; resuspendeer de pellets in PBS op een concentratie van 20 miljoen cellen per milliliter.
Nadat is vastgesteld dat de cellen beschermd zijn tegen licht, worden de CD4-positieve T-cellen in twee groepen verdeeld: één helft wordt gekleurd met een vers bereide CFSE-high werkoplossing tot een eindconcentratie van 0,2 millimolair en de andere helft met een vers bereide CFSE-low werkoplossing tot een eindconcentratie van 0,04 millimolair, gedurende 15 minuten bij 37 °C in 5% CO2. Aan het einde van de kleurperiode worden de cellen gecentrifugeerd en de pellets geresuspendeerd in één milliliter warm compleet medium om de labelingsreactie te stoppen. De CFSE-low CD4-positieve T-cellen worden vervolgens gepulseerd met het peptide van belang in compleet medium tot een eindconcentratie van vijf microgram per milliliter, gedurende 45 minuten in de celcultuurincubator.
Was na de incubatie zowel de CFSE-hoge als de CFSE-lage T-celpopulaties. Was beide cel-suspensies twee keer met incompleet medium en resuspendeer ze vervolgens in incompleet medium tot een concentratie van 200.000 cellen per milliliter. Meng daarna de twee doelpopulaties in een verhouding van één-op-één CFSE-hoog ten opzichte van CFSE-laag.
Voeg nu 100 µL van de gemengde target CD4-positieve T-cellen toe aan elke put van een 96-wells plaat met ronde bodem, en zaai vervolgens 1 µL van elke CD8-positieve T-cel-suspensie in dubbelvoud voor een eindvolume van 200 µL per put. Meet de basale apoptose door drie putten enkel met targetcellen te zaaien, en incubeer vervolgens de co-cultuur gedurende zes uur in de celkweekincubator. Nadat de incubatie is voltooid, worden de cellen overgebracht naar een V-bottom 96-wells plaat en wordt elke put gedurende 15 minuten gekleurd met PE-geconjugeerde peptide MHC-tetrameren.
Was de cellen in de celkweekincubator met PBS aangevuld met 2%FBS en kleur de cellen vervolgens gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht, nadat de cellen zijn gewassen. Resuspendeer de pellets opnieuw in 100 microliters 2%formaline in PBS en analyseer de cellen via flowcytometrie. Na co-cultuur worden de cellen geanalyseerd en gegated zoals gedemonstreerd in deze dot plots.
De ratio van levensvatbare CFSE-high versus CFSE-low targetcellen, niet-gepulst of peptide-gepulst, wordt geanalyseerd via een kleine forward-by-side scatter-gate. Levensvatbare cellen worden geselecteerd op basis van live-dead negatief en CD4-positieve T-cellen worden uitgezet tegen CFSE om de ratio van CFSE-low versus CFSE-high cellen te analyseren. Vervolgens wordt een grotere forward-by-side scatter-gate gemaakt om het totale aantal dode of levende effector- en targetcellen te tellen. Na de incubatie van zes uur worden CD8-positieve, tetrameer-positieve T-cellen en CFSE-low CD4-positieve T-cellen uitgezet om de ratio van effector- versus targetcellen te analyseren.
Het totaal aantal effector CD8-positieve T-cellen wordt vervolgens bepaald door gating op de CD8-positieve tetrameer-positieve cellen. Het totaal aantal targetcellen wordt bepaald door gating op de CD4-positieve T-cellen, CFSE-laag en live/dead-positieve en -negatieve cellen. De targetratio van CFSE-lage ten opzichte van CFSE-hoge cellen is één op één.
Wanneer de CD4-positieve doelcellen worden gekweekt in afwezigheid van effectorcellen, neemt deze ratio drastisch af. Wanneer de CFSE-low positieve pulse-cellen worden geïncubeerd met de totale populatie CD8-positieve T-cellen die antigeenspecifieke CD8-positieve effector T-cellen bevat.
Naarmate de ratio afneemt, beginnen de CFSE-lage CD4-positieve peptide-gepulste targetcellen live/dead-positief te worden. Verdunning van de effectorcellen resulteert daardoor in een herstel van de CFSE-ratio en uiteindelijk in een herstel van het aantal levensvatbare peptide-gepulste CFSE-lage CD4-positieve target T-cellen. Het percentage specifieke lysis kan vervolgens worden uitgezet als een functie van de effector-targetratio op een logaritmische schaal. Zoals in de grafiek wordt aangetoond, wordt er een lineaire regressie berekend op basis van de plot en wordt de vergelijking van de trendlijn gebruikt om de lytische eenheden te berekenen.
Dit is het aantal CD8-positieve effector T-cellen dat nodig is om 30% van 1 miljoen target CD4-positieve T-cellen te doden om de intrinsieke cytolytische capaciteit van de antigeenspecifieke CD8-positieve T-cellen te bepalen en om de resultaten tussen donoren te vergelijken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u cytometrie gebruikt om de toxische activiteit van antigeenspecifieke CD T-cellen te meten. Deze techniek kan ook eenvoudig worden aangepast voor uw eigen F-celtype.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een gevoelige, celgebaseerde cytotoxiciteitstest om de cytotoxische activiteit van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen te meten. Door de afname van levende target CD4+ T-cellen in aanwezigheid van effector CD8+ T-cellen te beoordelen, biedt deze assay een directe evaluatie van de cytolytische activiteit.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Cytotoxiciteitstesten
- Flowcytometrie
Achtergrond
- CD8+ T-cellen spelen een cruciale rol in de immuunrespons tegen pathogenen.
- Het meten van hun cytotoxische activiteit is essentieel voor het begrijpen van de immuunfunctie.
- Deze assay maakt gebruik van primaire doelcellen, wat de fysiologische relevantie vergroot.
- Doorstroomcytometrie maakt een nauwkeurige kwantificering van celpopulaties mogelijk.
Doel van de studie
- Om de cytotoxische activiteit van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen te evalueren.
- Om de lytische eenheden van deze T-cellen tegen target CD4+ T-cellen te bepalen.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het beoordelen van de functionaliteit van T-cellen.
Gebruikte methoden
- Expansie van effector CD8+ T-cellen in aanwezigheid van specifieke peptiden.
- Pulseren van doelwit CD4+ T-cellen met het peptide van belang.
- Co-cultiveren van effector- en doelwit T-cellen in verschillende ratio's.
- Kwantificeren van celpopulaties en cytotoxische activiteit met behulp van flowcytometrie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van de cytotoxische activiteit van CD8+ T-cellen.
- Kwantificering van lytische eenheden op basis van de doding van doelcellen.
- Aantoonde de effectiviteit van het gebruik van primaire doelcellen.
- Bood inzicht in de dynamiek van T-cel-gemedieerde cytotoxiciteit.
Conclusies
- Deze assay is een waardevolle tool voor het bestuderen van T-celcytotoxiciteit.
- Het biedt een fysiologisch relevantere benadering vergeleken met geïmmortaliseerde cellijnen.
- De methode kan worden toegepast in diverse immunologische studies.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze assay maakt directe meting van de cytotoxische activiteit van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen mogelijk met behulp van primaire autologe doelcellen, wat fysiologisch relevante gegevens oplevert voor de validatie van immunotherapiedoelen. Door de intrinsieke dodoctoxiciteit te kwantificeren als lytische eenheden (LU30/106 cellen), ondersteunt het de mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase en informeert het go/no-go-beslissingen in ontwikkelingspijplijnen voor T-cel-engagers of vaccins. De methode verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door de effectorfunctie te koppelen aan een gedefinieerde peptide/MHC-specificiteit, waardoor de afhankelijkheid van surrogaatmarkers wordt verminderd.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Meet antigeenspecifieke cytotoxische activiteit om de functionele relevantie van TCR- of CAR-constructen tegen gedefinieerde peptide/MHC-doelen te valideren.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van autologe primaire CD4+ T-cellen, waardoor artefacten van geïmmortaliseerde lijnen worden vermeden en de relevantie van de interactie met het doelwit wordt verbeterd.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt titratie van effector-naar-doelwitverhoudingen mogelijk om lytische eenheden te berekenen, wat kwantitatieve vergelijkingen tussen donoren of condities ondersteunt.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert dosisafhankelijke doding-curves via flowcytometrie, wat gestandaardiseerde read-outs mogelijk maakt voor hit-bevestiging in screeningscampagnes.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van CFSE-verdunning voor gemultiplexte target-discriminatie, waardoor gelijktijdige tracking van gepulseerde en ongepulseerde populaties in één assay mogelijk is.
- Wetenschappelijke waarde: Vereist peptide/MHC-tetrameerkleuring om antigeenspecifieke effectoren te isoleren, wat waarborgt dat de gemeten activiteit de werkelijke specificiteit weerspiegelt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt in vitro cytotoxisch potentieel met immunologische relevantie door gebruik te maken van fysiologisch overeenkomende autologe doelcellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de longitudinale beoordeling van de potentie van T-celproducten tijdens de productie of preklinische optimalisatie.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt directe vergelijking van de cytolytische activiteit tussen therapeutische kandidaten mogelijk met behulp van gestandaardiseerde LU30-metrieken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het continuüm van discovery tot preklinisch onderzoek, waarbij vroege targetvalidatie wordt gekoppeld aan de functionele beoordeling van effectorcellen voorafgaand aan de leadidentificatie en preklinische werkzaamheidstesten.
- Discovery Biology: Bevestigt dat antigeenspecifieke CD8+ T-cellen over een intrinsieke cytotoxische functie beschikken, los van markerexpressie of cytokinesecretie.
- Screening: Levert kwantitatieve, ratio-afhankelijke lysedata die geschikt zijn voor assay-standaardisatie en interlaboratorium-reproduceerbaarheid.
- Analytics: Maakt gebruik van flowcytometrie om levensvatbare doelpopulaties en tetrameer-positieve effectoren te kwantificeren, waardoor cytotoxische gebeurtenissen op single-cell resolutie kunnen worden geanalyseerd.
- Translationeel onderzoek: Maakt gebruik van primaire autologe targets om in vitro bevindingen te koppelen aan fysiologische relevantie, ter ondersteuning van risico-gecorrigeerde voortgang.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een modulair, aanpasbaar platform voor het meten van cytotoxische activiteit in diverse antigeenspecifieke T-celmodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt directe meting van de doding van doelcellen, waardoor mechanistische ambiguïteit in programma's voor immuno-oncologie en infectieziekten wordt verminderd.
- Operationele waarde: Standaardiseert cytotoxische read-outs via CFSE-labeling en flowcytometrie, wat de reproduceerbaarheid van assays over verschillende locaties verbetert.
- Strategische waarde: Informeert de potentiebeoordeling en criteria voor lotvrijgave voor T-celtherapieën via kwantificeerbare LU30-outputs.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van kandidaten mogelijk door de intrinsieke cytotoxische capaciteit tussen modaliteiten of donoren te vergelijken.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de isolatie en expansie van primaire T-cellen, en de configuratie van flowcytometrie, inclusief tetrameerkleuring.
- Afhankelijk van de toegang tot peptide/MHC-tetrameren en de optimalisatie van CFSE-labeling voor de discriminatie van doelcellen.
- Vereist een gestandaardiseerde titratie van effector-tegen-doelcel en incubatietijden voor een betrouwbare LU30-berekening.
- Omvat een zorgvuldige gating-strategie om levende/dode, CD4+/CD8+ en tetrameer-positieve populaties te onderscheiden.
- Beperkt tot autologe systemen; allogene toepassingen vereisen HLA-matching en kunnen variabiliteit introduceren.
