Name: Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Leer een celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen te meten met behulp van primaire doelcellen. Deze methode biedt een directe evaluatie van cytolytische activiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Office of Tourism, Trade, and Economic Development of Florida.

1. Preparatie van Effector CD8+ T Cellen
<ol>
	<li>Ontdooi autologe gecryopreserveerde PBMC's (2-3 flacons van 50 x 106 cellen) door de cryovial van vloeibare stikstof over te brengen naar een 37 °C waterbad.</li>
	<li>Was de cellen door de buis tot 50 ml te vullen met volledige RPMI (4 mM L-glutamine, en 100 U/ml penicilline en streptomycine, aangevuld met 10% FBS). Tel PBMC's en resuspendeer cellen in een concentratie van 5 x 106/ml in volledige RPMI.</li>
	<li>Voeg specifiek peptide (5 µg/ml) en IL-2 (10 ng/ml) toe aan PBMC's.</li>
	<li>Stel cultuur in 96 diepe welbplaat in; zaai 1 ml van celsuspensie in elke put.</li>
	<li>Vervang na 3 dagen cultuur de helft van het celcultuurmedium met vers volledige RPMI.</li>
	<li>Verzamel na 6 dagen cultuur alle PBMC's met meerkanaalspipet en breng cellen over in steriele reservoir.</li>
	<li>Tel, was en resuspendeer PBMC's bij 5 x 107/ml in de aanbevolen scheidingsbuffer in 14 ml ronde bodembuizen. Voeg menselijke CD8+ T cel verrijkingscocktail toe bij 50 µl/ml cellen. Meng en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Voeg magnetische deeltjes toe bij 150 µl/ml en incubeer gedurende 5 min.</li>
	<li>Breng de celsuspensie op 7 ml door de scheidingsbuffer toe te voegen. Ga door met immunomagnetische isolatie van onaangeroerde CD8+ T cel door de buis in de magneet te plaatsen. Na 5 min, met de buis nog steeds in de magneet, giet de cellen van belang in een nieuwe 15 ml conische buis. Neem een kleine aliquot en kleed de cellen met antilichamen tegen CD3 en CD8 in 1X PBS-2% FBS gedurende 30 min bij 4 °C. De zuiverheid van de CD8+ T cellen kan dan gemeten worden via flowcytometrie met een verwachte zuiverheid van 95% of hoger.</li>
	<li>Resuspendeer CD8+ T cellen in 450 µl met volledige RPMI.</li>
	<li>Voeg 225 µl van volledige RPMI toe in 5 schroefdopbuizen.</li>
	<li>Bereid seriële verdunningen (van 1:2 tot 1:32) voor door 225 µl van CD8+ over te brengen naar de volgende buis (zie Figuur 1 bovenpaneel).</li>
</ol>
2. Preparatie van Doelwit CD4+ T Cellen
<ol>
	<li>Ontdooi autologe gecryopreserveerde PBMC's (1 flacon van 50 x 106 cellen) door de cryovial van vloeibare stikstof over te brengen naar een 37 °C waterbad.</li>
	<li>Breng de celsuspensie over naar een 50 ml conische buis die 10 ml van RPMI bevat.</li>
	<li>Was cellen en resuspendeer PBMC's bij 5 x 107/ml met scheidingsbuffer in 14 ml ronde bodembuizen. Voeg menselijke CD4+ T cel verrijkingscocktail toe bij 50 µl/ml cellen. Meng en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Voeg magnetische deeltjes toe bij 100 µl/ml en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Breng de celsuspensie op 7 ml door de scheidingsbuffer toe te voegen. Ga door met de isolatie van CD4+ T cellen door de buis in de magneet te plaatsen. Na 5 min, met de buis nog steeds in de magneet, giet de gewenste cellen in een nieuwe 15 ml conische buis. Neem een kleine aliquot en kleed de cellen met antilichamen tegen CD3 en CD4 in 1x PBS-2% FBS gedurende 30 min bij 4 °C. De zuiverheid van de CD4+ T cellen kan dan gemeten worden via flowcytometrie met een verwachte zuiverheid van 95% of hoger.</li>
	<li>Tel CD4+ T cellen, verdeel ze in twee 15 ml conische buizen en was in warm 1x PBS.</li>
	<li>Bereid een 0.4 µM CFSE-high werkoplossing in warm PBS.</li>
	<li>Bereid een 0.04 µM CFSE-low werkoplossing voor door een portie van de 10x CFSE high werkoplossing te verdunnen in warm PBS.</li>
	<li>Resuspendeer cellen bij 20 x 106/ml van PBS (als het aantal CD4+ T cellen minder is dan 10 x 106/ml resuspendeer cellen in 0,5 ml van PBS) en kleed de helft van de CD4+ T cellen door één gelijke volume van 0.4 µM CFSE-high werkoplossing toe te voegen (finale concentratie 0.2 µM). Bijvoorbeeld, voor 1 ml cellen, voeg 1 ml van de CFSE werkoplossing toe. Kleed de resterende helft van de CD4+ door één gelijke volume van 0.04 µM CFSE-low werkoplossing toe te voegen (finale concentratie 0.02 µM). Kleed cellen gedurende 15 min bij 37 °C in 5% CO2 atmosfeer.</li>
	<li>Na de incubatie, pelleteer cellen bij 1.500 rpm gedurende 5 min en resuspendeer in 1 ml warme volledige RPMI om de labelreactie te dempen.</li>
	<li>Pulse CFSE-low CD4+ T cellen door het peptide van belang toe te voegen bij een finale concentratie van 5 µg/ml in de volledige RPMI en incubeer gedurende 45 min in 5% CO2 atmosfeer bij 37 °C.</li>
	<li>Was CFSE-high en CFSE-low CD4+ T cellen in volledige RPMI. Herhaal gedurende in totaal twee wasbeurten. Resuspendeer bij een concentratie van 2 x 105 cellen/ml elk in volledige RPMI.</li>
	<li>Meng de twee doelpopulaties bij een verhoud

<ol><li>Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).</li>
<li>Betts, M. R., Harari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+protective+T+cell+immune+responses+in+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV.</a> Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).</li>
<li>Roder, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+immunodeficiency+disorder+in+humans+involving+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells.</a> Nature. 284, 553-555 (1980).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J. Immunol. 171, 27-31 (2003).</li>
<li>Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+CTL+activity+by+polyoma+virus-specific+effector+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 171, 17-21 (2003).</li>
<li>Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LiveCount+Assay%3A+concomitant+measurement+of+cytolytic+activity+and+phenotypic+characterisation+of+CD8%28%2B%29+T-cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+measurement+of+the+cytotoxic+capacity+of+human+primary+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells.</a> J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).</li>
<li>Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+lytic+units+for+the+expression+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity.</a> J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%28%2B%29+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+metabolic%2C+functional%2C+and+cytolytic+differences+characterize+HIV-specific+CD8+T+cells+in+primary+and+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection.</a> Blood. 120, 3466-3477 (2012).</li>
<li>Hildemann, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+of+Antiviral+CD4%28%2B%29+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De hier beschreven assay maakt kwantificering mogelijk van de belangrijkste functie van CD8+ T-cellen: de cytolytische activiteit. De nauwkeurige meting van deze functie is van groot belang bij het karakteriseren van effectorfuncties van CD8+ T-cellen, aangezien eerdere studies een discrepantie rapporteerden tussen deze functie en de cytokinesecretie van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen10,11. Vanwege de korte incubatietijd van de cocultuur (6 uur) en het gebruik van autologe doelcellen, is er een lage mate van...

Cytolytische activiteit is de belangrijkste functie van CD8+ T-cellen, maar wordt nog steeds zelden gemeten omdat de assays die hiervoor worden gebruikt omslachtig zijn en moeilijk te standaardiseren1,2. Nauwkeurige meting van deze functie is van het grootste belang bij het karakteriseren van effectorfuncties van CD8+ T-cellen, aangezien er nog geen betrouwbare voorspellers van effectieve celgemedieerde cytotoxiciteit zijn beschreven. Hier stellen we een nieuwe functionele assay voor om de cytotoxische activiteit van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen op doelgerichte CD4+ T-cellen te meten. Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om alternatieven te bieden voor de gouden standaard, chromium-release-assay. We presenteren hier een op cellen gebaseerde assay die het hele proces van doden onthult, aangezien deze de dood van levende doelwitten meet. Deze methode is afgeleid van protocollen van flowcytometrie-gebaseerde cytotoxische assays in vivo bij muizen4,5 en in vitro bij mensen6. In dit protocol worden de antigeenspecifieke CD8+ T-cellen die in de totale CD8+ T-celpopulatie aanwezig zijn, gebruikt als effectorcellen en autologe CD4+ T-cellen worden gebruikt als doelcellen. Effectieve CD8+ T-cellen van belang worden geteld met behulp van MHCI/peptide tetramers7. De dood van doelcellen wordt berekend door de verhouding tussen peptide geladen/niet-geladen CD4+ T-cellen. We hebben eerder aangetoond dat deze methode reproduceerbaar, gevoelig, specifiek was en niet afhankelijk was van het aantal effectorcellen binnen de totale CD8+ T-celpopulatie8. Door zowel het aantal effector- als doelcellen in de cocultuur-assay te tellen, kan de intrinsieke capaciteit van CD8+ T-cellen om doelcellen te doden worden berekend en uitgedrukt in lytische eenheden9.

<table><tbody><tr><td>EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit</td><td>Stamcel</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human CD8+ T Cell Enrichment Kit</td><td>Stamcel</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit - Voor Flow Cytometry</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Far Red LIVE/DEAD fixable dode cel</td><td>Invitrogen</td><td>L10120</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td>557943</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 Anti-Human CD4 Antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>317435</td><td></td></tr><tr><td>PerCP anti-human CD8 Antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>344707</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium 1x</td><td>VWR</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100x Oplossing</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovien serum - Gold, hitte-geïnactiveerd</td><td>PAA</td><td>A15-252</td><td></td></tr><tr><td>96-wells platen; Behandeld; U-bodem; met deksel</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>25 ml steriele polystyreen, individueel verpakte reservoirs</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>96-wells U-bodem, steriele 2 ml diepe putjes platen</td><td>Thermo Scientific</td><td>275743</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 (v126), onderzoekskwaliteit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-096</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep Buffer, scheidingsbuffer</td><td>Stamcel</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Polypropyleen Conische Buiskoppeling</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>14 ml ronde bodembuiskoppeling, polypropyleen</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>De Big Easy EasySep Magneet</td><td>Stamcel</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>VWR</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96-wells; V-bodem plaat met deksel</td><td>Fisher</td><td>12-565-481</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde oplossing, ACS reagens, 37 wt % in H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml microbuisje met schroefdop, conisch</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td></td></tr></tbody></table>

celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytische activiteit van CD8+ T-cellen wordt zelden geëvalueerd. We beschrijven hier een nieuwe cel-gebaseerde assay om de capaciteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen om CD4+ T-cellen te doden die beladen zijn met hun cognate peptide te meten. Doel-CD4+ T-cellen worden verdeeld in twee populaties, gelabeld met twee verschillende concentraties CFSE. Eén populatie wordt gepulseerd met het peptide van belang (CFSE-low) terwijl de andere ongepulseerd blijft (CFSE-high). Gepulseerde en ongepulseerde CD4+ T-cellen worden gemengd in een gelijke verhouding en geïncubeerd met een toenemend aantal gezuiverde CD8+ T-cellen. De specifieke doding van autologe doel-CD4+ T-cellen wordt geanalyseerd door middel van flowcytometrie na co-cultuur met CD8+ T-cellen die de antigeen-specifieke effector CD8+ T-cellen bevatten, gedetecteerd door peptide/MHCI tetrameerkleuring. De specifieke lysis van doel-CD4+ T-cellen gemeten bij verschillende effector versus doel verhoudingen, maakt het mogelijk om lytische eenheden, LU30/106 cellen, te berekenen. Deze eenvoudige en duidelijke assay maakt een nauwkeurige meting van de intrinsieke capaciteit van CD8+ T-cellen mogelijk om doel-CD4+ T-cellen te doden.

Het schema in Figuur 1 vat de assay samen. Gezuiverde CD8+ T-cellen (effectorcellen) werden geresuspendeerd in 450 µl compleet RPMI en er werden seriële verdunningen uitgevoerd door 225 µl CD8+ T-cellen toe te voegen aan de volgende buis die 225 µl medium bevatte (bovenste paneel). Gezuiverde CD4+ T-cellen (doelcellen) werden geteld, verdeeld over twee buizen en gekleurd met twee verschillende concentraties CFSE (hoog en laag) zoals beschreven in het protocol. CFSE-low CD4+ T-cellen werden gepulseerd met...

Dit protocol beschrijft een gevoelige, cel-gebaseerde cytotoxiciteit assay. Door het tellen van de afname in frequentie van levende doelwit CD4+ T-cellen in aanwezigheid van een toenemend aantal effector CD8+ T-cellen, staat deze assay toe de directe beoordeling van de cytolytische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen.

Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de cytotoxische activiteit van antigeenspecifieke CD8 T-cellen met behulp van een celgebaseerde flowcytometrie-assay. Dit wordt eerst bereikt door effector CD8 T-cellen zes dagen lang te expanderen in aanwezigheid van het betreffende peptide; in de tweede stap worden target CD4 T-cellen gepulst met het betreffende peptide en vervolgens gemengd met niet-gepulste CD4 T-cellen. Vervolgens worden de effector CD8 T-cellen en target CD4 T-cellen zes uur lang gecocultiveerd bij verschillende effector-target-ratio's.In de laatste stap worden de doding van de met peptiden beladen target CD4 T-cellen en het aantal effector CD8 T-cellen gekwantificeerd via flowcytometrie. Uiteindelijk kan de intrinsieke dodingcapaciteit van de antigeenspecifieke CD8 T-cellen, uitgedrukt in lytische eenheden, worden berekend. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van assays zoals de chromium-release assay, zijn dat deze techniek gebruikmaakt van autologe primaire targetcellen in plaats van geïmmortaliseerde cellijnen en de werkelijke targetcel.Daarnaast zijn de aantallen effectorcellen kwantificeerbaar op het niveau van individuele cellen. Nu zal een onderzoeksassistent in mijn laboratorium de procedure demonstreren om de CD8-positieve effectorcellen te isoleren. Begin met het ontdooien van autologe cryogepreserveerde PBMC in een waterbad van 37 °C, en was de cellen vervolgens in maximaal 50 mL compleet medium.Verdun na het tellen de pbmc tot een concentratie van 5 miljoen cellen per milliliter in completen medium en voeg vervolgens IL-2 en het peptide van belang toe aan de cultuur. Zaai daarna één milliliter van de celsuspensie in elke put van een 96-wells plaat. Vervang na drie dagen cultuur de helft van het supernatant door vers compleet medium. Gebruik na zes dagen cultuur een multichannelpipet om de cellen over te brengen naar een steriel reservoir, waarna de cellen geteld en gewassen worden.Resuspendeer de pellet op 50 miljoen cellen per milliliter in een scheidingsbuffer en incubeer de pbmc in een ronde buis van 14 milliliter met een human CD eight positive T-cel verrijkingscocktail op 50 µL per milliliter cellen bij kamertemperatuur. Incubeer de cellen na 10 minuten gedurende nog eens vijf minuten met anti CD eight IgG-geconjugeerde magnetische deeltjes op 150 µL per milliliter, en vul de celsuspensie vervolgens aan tot zeven milliliter met extra scheidingsbuffer. Plaats de buis in de scheidingsmagneet. Giet de cellen na vijf minuten, terwijl de buis nog in de magneet staat, in een conische buis van 15 milliliter. Kleur vervolgens een klein aliquoot van de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C met antilichamen tegen CD three en CD eight in PBS aangevuld met 2% FBS.Bevestig via flowcytometrie dat de zuiverheid van de cellen 95% CD8 positief of hoger is. Voeg nu 225 µL compleet medium toe aan vijf buisjes met schroefdop en verdun de cellen vervolgens serieel van 1:2 tot 1:32. Om de CD4 positieve doelcellen te isoleren, begint u met het ontdooien van autologe cryobewaarde PBMC in een waterbad van 37 °C.Breng de ontdooide cellen over naar een conische buis van 50 milliliter die 10 milliliter medium bevat. Verrijk de CD4-expresserende T-cellen via scheiding met magnetische deeltjes zoals zojuist gedemonstreerd, waarbij een zuiverheid van 95% of hoger van CD4-positieve T-cellen via flowcytometrie wordt bevestigd. Verdeel de cellen na het tellen over twee conische buizen van 15 milliliter en was deze vervolgens in warme PBS; resuspendeer de pellets in PBS op een concentratie van 20 miljoen cellen per milliliter.Nadat is vastgesteld dat de cellen beschermd zijn tegen licht, worden de CD4-positieve T-cellen in twee groepen verdeeld: één helft wordt gekleurd met een vers bereide CFSE-high werkoplossing tot een eindconcentratie van 0,2 millimolair en de andere helft met een vers bereide CFSE-low werkoplossing tot een eindconcentratie van 0,04 millimolair, gedurende 15 minuten bij 37 °C in 5% CO2. Aan het einde van de kleurperiode worden de cellen gecentrifugeerd en de pellets geresuspendeerd in één milliliter warm compleet medium om de labelingsreactie te stoppen. De CFSE-low CD4-positieve T-cellen worden vervolgens gepulseerd met het peptide van belang in compleet medium tot een eindconcentratie van vijf microgram per milliliter, gedurende 45 minuten in de celcultuurincubator.Was na de incubatie zowel de CFSE-hoge als de CFSE-lage T-celpopulaties. Was beide cel-suspensies twee keer met incompleet medium en resuspendeer ze vervolgens in incompleet medium tot een concentratie van 200.000 cellen per milliliter. Meng daarna de twee doelpopulaties in een verhouding van één-op-één CFSE-hoog ten opzichte van CFSE-laag.Voeg nu 100 µL van de gemengde target CD4-positieve T-cellen toe aan elke put van een 96-wells plaat met ronde bodem, en zaai vervolgens 1 µL van elke CD8-positieve T-cel-suspensie in dubbelvoud voor een eindvolume van 200 µL per put. Meet de basale apoptose door drie putten enkel met targetcellen te zaaien, en incubeer vervolgens de co-cultuur gedurende zes uur in de celkweekincubator. Nadat de incubatie is voltooid, worden de cellen overgebracht naar een V-bottom 96-wells plaat en wordt elke put gedurende 15 minuten gekleurd met PE-geconjugeerde peptide MHC-tetrameren.Was de cellen in de celkweekincubator met PBS aangevuld met 2%FBS en kleur de cellen vervolgens gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht, nadat de cellen zijn gewassen. Resuspendeer de pellets opnieuw in 100 microliters 2%formaline in PBS en analyseer de cellen via flowcytometrie. Na co-cultuur worden de cellen geanalyseerd en gegated zoals gedemonstreerd in deze dot plots.De ratio van levensvatbare CFSE-high versus CFSE-low targetcellen, niet-gepulst of peptide-gepulst, wordt geanalyseerd via een kleine forward-by-side scatter-gate. Levensvatbare cellen worden geselecteerd op basis van live-dead negatief en CD4-positieve T-cellen worden uitgezet tegen CFSE om de ratio van CFSE-low versus CFSE-high cellen te analyseren. Vervolgens wordt een grotere forward-by-side scatter-gate gemaakt om het totale aantal dode of levende effector- en targetcellen te tellen. Na de incubatie van zes uur worden CD8-positieve, tetrameer-positieve T-cellen en CFSE-low CD4-positieve T-cellen uitgezet om de ratio van effector- versus targetcellen te analyseren.Het totaal aantal effector CD8-positieve T-cellen wordt vervolgens bepaald door gating op de CD8-positieve tetrameer-positieve cellen. Het totaal aantal targetcellen wordt bepaald door gating op de CD4-positieve T-cellen, CFSE-laag en live/dead-positieve en -negatieve cellen. De targetratio van CFSE-lage ten opzichte van CFSE-hoge cellen is één op één.Wanneer de CD4-positieve doelcellen worden gekweekt in afwezigheid van effectorcellen, neemt deze ratio drastisch af. Wanneer de CFSE-low positieve pulse-cellen worden geïncubeerd met de totale populatie CD8-positieve T-cellen die antigeenspecifieke CD8-positieve effector T-cellen bevat.Naarmate de ratio afneemt, beginnen de CFSE-lage CD4-positieve peptide-gepulste targetcellen live/dead-positief te worden. Verdunning van de effectorcellen resulteert daardoor in een herstel van de CFSE-ratio en uiteindelijk in een herstel van het aantal levensvatbare peptide-gepulste CFSE-lage CD4-positieve target T-cellen. Het percentage specifieke lysis kan vervolgens worden uitgezet als een functie van de effector-targetratio op een logaritmische schaal. Zoals in de grafiek wordt aangetoond, wordt er een lineaire regressie berekend op basis van de plot en wordt de vergelijking van de trendlijn gebruikt om de lytische eenheden te berekenen.Dit is het aantal CD8-positieve effector T-cellen dat nodig is om 30% van 1 miljoen target CD4-positieve T-cellen te doden om de intrinsieke cytolytische capaciteit van de antigeenspecifieke CD8-positieve T-cellen te bepalen en om de resultaten tussen donoren te vergelijken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u cytometrie gebruikt om de toxische activiteit van antigeenspecifieke CD T-cellen te meten. Deze techniek kan ook eenvoudig worden aangepast voor uw eigen F-celtype.

cell-based-flow-cytometry-assay-to-measure-cytotoxic-activity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Celgebaseerde flowcytometrie-assay om de cytotoxische activiteit te meten

This video demonstrates an in vitro technique to measure the cytotoxic ability of cytokine-induced killer (CIK) cells against cancer cells. Upon co-culturing target cancer cells with CIK cells, the dead cancer cells are identified using a fluorescent viability dye and are quantified using flow cytometry, estimating the cytotoxic effect of CIK cells.

An In Vitro Assay to Study the Cytotoxic Capability of Cytokine-Induced Killer Cells

This video demonstrates the lytic activity of natural killer cells against fluorescently-stained target cells. The method enables NK cell-induced cytotoxicity measurement by staining dead cells and using a flow cytometer to quantify live and dead target cells.

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

This video showcases an apoptosis assay in cancer cells induced by pre-activated effector T cells. By co-culturing these cells with cancer cells marked with fluorescent nuclei, a caspase-cleavable fluorogenic substrate is added. Apoptotic cancer cells will display a different color in their nuclei, leading to dual fluorescence. This dual fluorescence is indicative of cancer cells undergoing apoptosis.

An In Vitro Assay for Studying the Cytotoxicity of Pre-Activated CD8+ T Cells against Cancer Cells

We beschrijven een single-cell high-throughput assay voor cytotoxiciteit van T-cellen te meten wanneer geïncubeerd met tumor doelcellen. Deze werkwijze gebruikt een dichte, elastomeer reeks sub-nanoliter wells (~ 100.000 putjes / array) ruimtelijk beperken de T-cellen en doelcellen met gedefinieerde verhoudingen en is gekoppeld met fluorescentie microscopie effector-target conjugatie en daaropvolgende apoptose controleren.

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

De volbloed cytotoxiciteit assay (WCA) is een cytotoxiciteit assay ontwikkeld door het opnemen van high-throughput cell technologie voor plaatsbepaling met fluorescentie microscopie en geautomatiseerde beeldverwerking. Hier beschrijven we hoe lymfoomcellen behandeld met een anti-CD20 antilichaam kan worden geanalyseerd real-time in humaan volbloed kwantitatieve cellulaire cytotoxiciteit analyse.

Real-time cytotoxiciteitsassays in humaan volbloed

Een eenvoudige en betrouwbare werkwijze is beschreven om een ​​set van NK celfuncties zoals degranulatie cytokine en chemokine productie in verschillende NK cel subsets te analyseren.

Flowcytometrie-gebaseerde test voor het toezicht op NK celfuncties

Dit werk beschrijft een geavanceerd werkproces voor de nauwkeurige en snelle bepaling van het NK (Natural Killer) celgetal en de NK celcytotoxiciteit in menselijke bloedmonsters.

Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

Een stroom cytometry gebaseerde methode om kwantitatief de cytotoxische activiteit van menselijke natural killer cellen wordt hier weergegeven.

Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit

Hier beschrijven we een methode voor het maken van dubbele emulsiedruppeltjes die één T-cel en een kankerdoelcel inkapselen om celdoding op eencellig niveau te onderzoeken. Deze methode maakt dubbele kwantificering mogelijk van zowel cytotoxische moleculen als apoptose van doelcellen binnen een grote populatie T-cellen.

Op druppels gebaseerde cytotoxiciteitstest om chimere antigeenreceptor-T-cellen op eencellig niveau te beoordelen

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde in vitro. workflow voor consistente meting van natuurlijke, chimere antigeenreceptor-gemedieerde en antistofafhankelijke cytotoxiciteit van menselijke natuurlijke moordenaars met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie.

Kwantificatie van NK-cel cytotoxiciteit versterkt door chimerische antigeenreceptoren en therapeutische antilichamen met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie

Leer een celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen te meten met behulp van primaire doelcellen. Deze methode biedt een directe evaluatie van cytolytische activiteit.

Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

Meer video's verkennen