Name: Imaging celmembraan letsel en Subcellulaire processen die betrokken zijn in reparatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: Leer hoe je celmembraanletsel en subcellulaire reparatieprocessen visualiseert met fluorescerende kleurstoffen. Deze methode toont lysosomale exocytose en eiwittrafficking bij wondherstel in levende cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grants AR055686 en AR060836 en postdoctoraal fellowship aan AD door de Franse Vereniging van de Spierdystrofie (AFM). De cellulaire beeldvorming inrichting gebruikt in deze studie wordt ondersteund door National Institutes of Health Grants HD040677.

1. Imaging celmembraan Reparatie behulp Bulk (Glass Bead) Verwonden Met dit protocol kunt afzonderlijk markeren van de beschadigde cellen en degenen die niet te genezen. Kwantificeren van deze populaties van cellen vereist het gebruik van drie voorwaarden: 1. Test (C1) - Cellen mogen te herstellen in aanwezigheid van Ca 2 +, 2. Controle 1 (geen schade C2) - Cellen worden geïncubeerd in aanwezigheid van Ca2 +, maar niet gewond en 3. Control 2 (geen reparatie C3) - cellen zijn toegestaan ​​om te herstellen in afwezigheid van Ca 2 +. <ol><li> Kweek cellen&gt; 50% confluentie drie steriele dekglaasjes en was C1 en C2 tweemaal met CIM bij 37 ° C en C3 met PBS bij 37 ° C en overdracht dekglaasjes op silicone O-ringen. </li><li> Voeg 100 ul van voorverwarmde FITC dextran oplossing CIM van C1 en C2 of C3 PBS. </li><li> Verwonden plasmamembraan bij C1 en C3 door zacht glooiende 40 mg glazen kralen over het dekglaasje bij kamertemperatuur door het handmatig kantelen dekglaasjes terug enweer 6-8 keer onder een hoek van 30 °. Opmerking: Bij lichte blessure, zorgen de glazen kralen zijn gelijkmatig verdeeld, dus het minimaliseren van herhaling verwondingen. Om reproduceerbaarheid schade tussen monsters verbeteren, tegelijkertijd uitvoeren van de glaskraal schade van de verschillende monsters te vergelijken. </li><li> Om verdere rollen kralen; breng dekglaasjes tot een 37 ° C incubator bij omgevingstemperatuur CO2 en laat reparatie men gedurende 5 minuten. </li><li> Zonder dat de korrels rollen, het glazen kralen en FITC dextran door wassen met CIM (C1 en C2) of PBS (C3) bij 37 ° C. </li><li> Plaats coverslips terug op de O-ring en voeg 100 ul van voorverwarmde lysine fixable TRITC dextran oplossing CIM op C1 en C2 of in PBS op C3. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten bij omgevingstemperatuur CO2. </li><li> Was tweemaal met dekglaasjes voorverwarmde CIM en bevestig met 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was tweemaal met PBS en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur Hoechst kleurstof. </li><li> Wassen samples tweemaal met PBS, monteren op een dia met behulp van montage media en imago cellen met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. </li><li> Gebruik cellen van C2 naar de achtergrond rode en groene kleurintensiteit bepalen en deze waarde drempel de rode en groene kanalen voor alle monsters (C1-C3). </li><li> Score totaal aantal cellen dat a) groene (gewonden en gerepareerd) en b) rood of beide rood en groen (gewonden, maar niet te repareren) C1 en C3 monsters. </li><li> Telling&gt; 100 greens cellen voor elke voorwaarde en drukken de fractie van cellen die niet te repareren als percentage van alle cellen gewonden (groen en rood). </li></ol> 2. Live-Imaging van de kinetiek van celmembraan Reparatie Na Laser Injury <ol><li> Was de cellen met voorverwarmde CIM en zet dan het dekglaasje in CIM met FM kleurstof. </li><li> Plaats het dekglaasje in een houder in de bovenste fase incubator op 37 ° C. </li><li> Selecteer een 1-2 mm2 gebied van het celmembraan en bestralen voor &lt;, 10 msec met gepulste laser. Verzwakken het laservermogen via de software tot 40-50% van het piekvermogen. Optimale voeding laat consistent, maar niet-dodelijke verwondingen en dit moet worden bepaald door trial and error voor elk individueel instrument en cellijn wordt gebruikt. </li><li> Te repareren, afbeelding controleren elke 10 seconden in epifluorescentie en helderveld, ingaan vóór letsel en blijven voor 3-5 minuten na letsel. Opmerking: Voor geen reparatie controle, herhaalt u de stappen 2,1-2,4 met de cellen gewond bij PBS met FM-kleurstof. </li><li> Om de kinetiek van de reparatie te kwantificeren, meten cellulaire FM kleurstof fluorescentie en plot de verandering in intensiteit (ΔF/F0) in de loop van de beeldvorming. Deze gegevens worden gemiddeld voor meer dan 10 cellen per conditie en uitgezet als gemiddelde waarde of individuele cel, zoals nodig. </li></ol> 3. Imaging Bulk (Glass Bead) Letsel Induced Lysosomal Exocytosis De volgende monsters omvatten cellen gekweekt tot&gt; 50%samenvloeiing: 1. Test (C1) - cellen toegestaan ​​te herstellen in aanwezigheid van Ca 2 +, 2. Controle 1 (C2; geen letsel) - Cellen noch gewond noch geïncubeerd met primair antilichaam, en 3. Control 2 (C3; geen reparatie) - Cellen toegestaan ​​om te herstellen in afwezigheid van Ca 2 +. <ol><li> Was dekglaasjes C1 en C2 tweemaal met CIM bij 37 ° C en C3 met PBS bij 37 ° C en overbrengen op silicone O-ringen. </li><li> Voeg 100 ul voorverwarmde lysine vastzetbaar TRITC dextran CIM van C1 en C2 en C3 in PBS op. </li><li> Verwonden plasmamembraan bij C1 en C3 zoals in stap 1.3. </li><li> Om verdere rollen kralen; breng dekglaasjes tot een 37 ° C incubator bij omgevingstemperatuur CO2 en laat reparatie men gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de glazen kralen en TRITC dextran door het wassen van de dekglaasjes in koud groeimedium en zorgt op geen rollen van de glasparels op de cellen. </li><li> Spoel tweemaal de dekglaasjes met koud kweekmedium en transfer naar de O-ringen. </li><li> Naar C1 en C3Voeg 100 ul rat anti-muis antilichaam LAMP1 koud volledig groeimedium en voeg de koude, compleet groeimedium C2. </li><li> Om antilichaambinding dekglaasjes Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Was de dekglaasjes driemaal met koud CIM en vast alle coverslips met 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en spoel 3x met CIM. </li><li> Incubeer alle dekglaasjes in 100 ui blokkerende oplossing gedurende 15 min bij KT </li><li> Incubeer alle dekglaasjes in 100 pl Alexa Fluor 488 anti-rat antilichaam gedurende 15 minuten bij 4 ° C. </li><li> Was tweemaal met PBS en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur Hoechst. </li><li> Was de cellen tweemaal met PBS, monteren op een dia met behulp van montage-media en het beeld met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. </li><li> Afbeeldingen gebruiken C2 cellen, bepalen de niet-specifieke achtergrondkleuring in het rode (TRITC dextran) en groene (Alexa Fluor 488 antilichaam) kanalen en deze gebruiken achtergrondkleuring waarden drempel de rode en groene kanalen voor alle monsters (C1-C3). &lt;/ Li&gt; <li> Gebruik&gt; 100 rode gemerkte cellen uit C1 en C3 aan de intensiteit van kleuring LAMP1 (groen) in beschadigde cellen te meten. Voor een succesvolle experiment LAMP1 kleuring in cellen C3 aanzienlijk lager dan in cellen van C1 zijn. </li></ol> 4. Live-Imaging van celmembraan Injury Getriggerd Subcellulaire Trafficking <ol><li> Fluorescent label de compartiment van rente door transfecteren geschikte reporter (bijv. CD63-GFP voor 8 lysosomen) of met behulp van fluorescerende kleurstoffen 9. </li><li> Voor de etikettering lysosomen met fluorescerende kleurstof, incubeer cellen gekweekt tot 50% confluentie in groeimedia met FITC-dextran </li><li> Laat dextran worden endocytosed 2 uur (of langer als nodig is voor voldoende endosomal labeling met dextran door de cellijn van belang) in de CO 2 incubator. </li><li> Was de cellen met voorverwarmd groeimedium en incubeer daarin gedurende 2 uur in een CO2 incubator om alleendocytose dextran ophopen in het lysosoom. </li><li> Voor beeldvorming, spoel het dekglaasje in voorverwarmde CIM en houder van een dekglaasje houder op het podium top incubator bij 37 ° C. </li><li> Voer groothoek (voor verkeer in de cel) of TIRF (verkeer aan het celoppervlak en exocytose) imaging - cellen die niet FITC gelabelde dextran kan druk lysosomen zijn ideaal voor beeldvorming van de verplaatsing en exocytose individuele lysosomen. </li><li> Uitlijnen van de TIRF lasers voor imaging microscoop: Gebruik 60X of 100X doelstelling met&gt; 1.45 NA. Stel de hoek voor het incident TIRF laserstraal met behulp van de aanpak van de fabrikant. </li><li> Verwonden celmembraan door bestraling een kleine (1-2 mm 2) regio &lt;100 msec, met de gepulste laser op 40-50% verzwakking. </li><li> Om de reactie van lysosoom controleren om schade afbeeldingscellen cel 4-6 beelden / sec gedurende minstens 2 minuten of langer, afhankelijk van de dynamiek van exocytose in de cellen van belang. </li></ol>

<ol><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li>
<li>McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound assays.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).</li>
<li>McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+introduction+of+molecules+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct introduction of molecules into cells.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).</li>
<li>Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li>
<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
<li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaiswal%2C+JK+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+events+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Celmembraan schade in vivo optreedt als gevolg van een verscheidenheid van fysiologische stressoren verschillende experimentele benaderingen zijn ontwikkeld om deze na te bootsen. Deze omvatten verwonden celmembraan van hechtende cellen door schrapen ze van de schaal of door passage van door een smalle boring spuit 9,10. Naar aanleiding van dergelijke verwondingen de cellen te genezen in suspensie en niet gehouden aan de extracellulaire matrix zoals ze normaal doen in het weefsel. Weer anderen, zoals...

Celmembraan handhaaft de integriteit van de cellen door een barrière tussen de cellen en de extracellulaire omgeving. Een chemische, elektrische of mechanische stimulus die de normale fysiologische drempel en de aanwezigheid van binnendringende pathogenen dan kan elk letsel aan het celmembraan en leiden tot een latere cellulaire respons op de schade te herstellen. Om deze verwondingen overleven de celmembraan, cellen beschikken over een efficiënt mechanisme voor reparatie. Dit mechanisme is calcium afhankelijk en gaat intracellulair verkeer van eiwitten zoals annexinen en MG53 oa evenals subcellulaire compartimenten zoals endosomen, lysosomen, Golgi afgeleide blaasjes en mitochondriën aan de benadeelde celmembraan 1-7. Toch blijft de gegevens van de sequentie van moleculaire en subcellulaire gebeurtenissen betrokken bij het herstel van beschadigde celmembraan slecht begrepen. Reparatie reactie cel kan worden gescheiden in het oorly en late reacties. Vroege reacties, die binnen seconden tot minuten tijdschaal, zijn enorm belangrijk bij het bepalen van de aard van de late reacties die leiden tot succesvol herstel van cellen of celdood. Eindpunt assays gebaseerd op bulk biochemische en cellulaire analyse hebben meegewerkt aan de totstandkoming van de betrokkenheid van de moleculaire en cellulaire processen in de reparatie. Maar vanwege de heterogeniteit en de snelheid van cellulaire reparatiereactie, eindpunt assays niet de kinetische en ruimtelijke data van de reeks gebeurtenissen die tot herstelling. Benaderingen die gecontroleerde schade van celmembraan mogelijk en laat de controle celmembraan reparatie en bijbehorende subcellulaire reacties op hoge ruimtelijke en temporele resolutie zijn ideaal voor dergelijke studies. Hier hebben dergelijke benaderingen gepresenteerd. Twee van de protocollen beschreven benaderingen van de real-time kinetiek van celmembraan reparatie en de subcellulaire responsen geassocieerd met het reparatieproces in levende cellen na laser inj bewakenUry. Ter aanvulling op deze live cell imaging gebaseerde testen, hebben eindpunt assays ook beschreven dat een populatie gebaseerd maatregel voorzien in toezicht reparatie van individuele cellen en de bijbehorende subcellulaire reacties. Om hun nut bewijzen deze benaderingen zijn gebruikt om mensenhandel en exocytose van lysosomen bewaken in reactie op celmembraan letsel.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H1387</td><td>Wordt gebruikt voor de bereiding van CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP410</td><td>Wordt gebruikt voor de bereiding van CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td></tr><tr><td>FITC dextran (Lysine fixable)</td><td>Invitrogen</td><td>D1820</td><td>2 mg/ml in CIM of PBS</td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>TRITC dextran (Lysine fixable)</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>2 mg/ml in CIM of PBS</td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% in PBS</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1/10 000 in PBS</td></tr><tr><td>FM dye</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td>1 &micro;g/&micro;l in CIM of PBS</td></tr><tr><td>FITC dextran</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>2 mg/ml in groeimedium</td></tr><tr><td>LAMP1&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-19992</td><td>1/300 in groeimedium</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>1/500 in blokkeeroplossing</td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom petridish</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Silicone O ring</td><td>Bellco</td><td>1943-33315</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip holder</td><td>Bellco</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>12001-566</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>MP1400-500H</td><td>Wordt gebruikt voor groeimedium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin/Sreptomycin</td><td>VWR</td><td>12001-350</td><td>Wordt gebruikt voor groeimedium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td></tr><tr><td>Chicken serum</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td>5% kippen serum in CIM wordt gebruikt voor blokkeeroplossing tijdens immunokleuring</td></tr><tr><td>PBS (Ca2+ en Mg2+ vrij)</td><td>VWR</td><td>12001-664</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescent microscope</td><td>Olympus America, PA</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>TIRF illuminator&nbsp;</td><td>Olympus America, PA</td><td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescent illuminator</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Photometrics, Tucson, AZ</td><td>Evolve 512 EMCCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Image acquisition and analysis software</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Slidebook 5</td><td></td></tr><tr><td>Pulsed laser</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Ablate (3iL13)</td><td></td></tr><tr><td>Stage top incubator</td><td>Tokaihit, Japan</td><td>INUBG2ASFP-ZILCS</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging celmembraan letsel en subcellulaire processen die betrokken zijn in reparatie

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

Het vermogen van beschadigde cellen te genezen is een fundamenteel cellulair proces, maar cellulaire en moleculaire mechanismen betrokken bij genezing beschadigde cellen worden slecht begrepen. Hier assays zijn beschreven om het vermogen en de kinetiek van genezing van gekweekte cellen na gelokaliseerde schade controleren. Het eerste protocol beschrijft een eindpunt gebaseerde benadering van celmembraan herstel vermogen van honderden cellen tegelijkertijd te beoordelen. Het tweede protocol beschrijft een real-time imaging benadering om de kinetiek van celmembraan reparatie in individuele cellen na gelokaliseerde letsel met een gepulste laser controleren. Als genezing beschadigde cellen betreft handel in specifieke eiwitten en subcellulaire compartimenten om de plaats van het letsel, de derde protocol beschrijft het gebruik van bovenstaande eindpunt gebaseerde benadering van een dergelijke handel event (lysosomale exocytose) in honderden cellen gewond gelijktijdig beoordelen en het laatste protocol beschrijft het gebruik van gepulste laser letsel met TIRF microskopie aan de dynamiek van de individuele subcellulaire compartimenten in beschadigde cellen bij hoge ruimtelijke en temporele resolutie monitoren. Terwijl de protocollen Hier wordt de toepassing van deze benaderingen het verband tussen celmembraan reparatie en lysosomale exocytose in gekweekte spiercellen bestuderen, kunnen ze worden toegepast als zodanig voor andere hechtende gekweekte cellen en subcellulaire compartiment keuze.

Protocollen hier beschreven voor de enkele-cell imaging zijn om het vermogen en de kinetiek van celmembraan reparatie (Protocollen 1 en 2) en de subcellulaire mensenhandel en fusie van lysosomen tijdens de reparatie te controleren (Protocollen 3 en 4). Protocol nr. 1 toont een bulk test waarmee markering alle beschadigde cellen en het identificeren van die beschadigde cellen die niet te repareren. De resultaten in Figuur 1 laten zien dat, terwijl de niet-beschadigde cellen <...

Het genezingsproces beschadigde cellen omvat handel specifieke eiwitten en subcellulaire compartimenten aan de plaats van celmembraan schade. Dit protocol beschrijft assays deze processen volgen.

Imaging celmembraan letsel en Subcellulaire processen die betrokken zijn in reparatie

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om het effect van gewenste behandelingen op het herstel van beschadigde cellen te observeren en om de subcellulaire processen te bestuderen die helpen bij het herstellen van beschadigde cellen. Dit wordt bereikt door cellen te beschadigen in aanwezigheid van fluorescerende kleurstoffen die intacte celmembranen niet kunnen passeren, om zo de kinetiek en het vermogen van beschadigde cellen om de instroom van deze kleurstoffen te voorkomen te beoordelen. Als tweede stap monitoren we de verschijning van intracellulaire eiwitten bij het beschadigde celmembraan, wat het vermogen van een relevant cellulair compartiment identificeert om deel te nemen aan het herstel door te fuseren met het beschadigde celmembraan.Vervolgens monitoren we de fusie van relevante cellulaire compartimenten met het beschadigde celmembraan om de kinetiek van de beschadiging te volgen. De resultaten van de getriggerde fusie van dit compartiment laten zien dat het herstel van de celmembraanbeschadiging geassocieerd is met lysosomale exocytose, gebaseerd op de toegenomen aanwezigheid van lysosome associated membrane protein 1 aan het beschadigde celoppervlak en live-imaging van de secretie van lysosomale inhoud door beschadigde cellen. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over celbeschadiging en -herstel.Deze kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om te bepalen welke eiwitten en cellulaire compartimenten reageren op focale beschadigingen van het celmembraan en om vervolgens de kinetiek van deze respons te evalueren. De procedure wordt gedemonstreerd door Aurelia D vier en hamma stra twee, postdoctorale onderzoekers uit mijn laboratorium, om afzonderlijk de beschadigde cellen te markeren die genezen en diegene die niet genezen.Zaai de cellen uit op steriele dekglasjes voor de drie experimentele condities. Kweek de cellen totdat ze een confluentie van meer dan 50% bereiken, en was vervolgens C één en C twee twee keer met CIM bij 37 °C. Was C3 met PBS bij 37 °C.Breng vervolgens de dekglasjes over op siliconen O-ringen. Voeg 100 µL voorverwarmde fitzy-dextraanoplossing in een geschikte buffer toe. Beschadig het plasmamembraan van C1 en C3 door 40 mg glaskralen op het dekglasje aan te brengen bij kamertemperatuur en het dekglasje handmatig te kantelen.Schuif zes tot acht keer heen en weer onder een hoek van 30 graden voor een milde beschadiging. Zorg ervoor dat de glaskralen gelijkmatig zijn verspreid, waardoor herhaalde beschadigingen worden geminimaliseerd om de reproduceerbaarheid van de beschadiging tussen monsters te verbeteren. Voer de beschadiging met glaskralen van de verschillende te vergelijken monsters gelijktijdig uit, om verder rollen van de kralen te voorkomen.Plaats alle dekglasjes in een incubator van 37 °C bij omgevings-CO2 en laat het herstel vijf minuten doorgaan zonder de kraaltjes te laten rollen. Verwijder de glaskraaltjes en het fitzy dextran door te wassen met buffer of PBS. Plaats de dekglasjes vervolgens terug op de O-ring en voeg 100 µL voorverwarmde lysine toe.Incubeer de fixeerbare trissy-dextranoplossing gedurende vijf minuten bij 37 °C bij omgevings-CO2. Was de dekglasjes twee keer met voorverwarmd CIM en fixeer met 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur na twee PBS-wassingen. Incubeer twee minuten in hersch-kleurstof en monteer het monster na twee PBS-wassingen op een objectglas met behulp van monteermedium.Beeld vervolgens de cellen van de C2-stalen af met een epifluorescentiemicroscoop. Bepaal de intensiteit van de rode en groene achtergrondkleuring. Gebruik deze waarde vervolgens om de rode en groene kanalen voor alle stalen te thresholden.Tel het totaal aantal groene cellen. Tel daarnaast de cellen die rood zijn of zowel rood als groen in de C- en C3-monsters. Tel vervolgens meer dan 100 groene beschadigde cellen voor elke conditie en druk het aandeel cellen dat niet is hersteld uit als een percentage van alle beschadigde cellen.Was de cellen die tot meer dan 50% confluentie zijn gegroeid met voorverwarmd CIM en monteer het dekglas in CIM met FM-kleurstof. Plaats dit in een houder in de stage-top incubator bij 37 °C. Selecteer een regio van het celmembraan met een optimaal vermogen dat consistente maar niet-lethale beschadiging mogelijk maakt.Bestraal de sample voor minder dan 10 milliseconden met de gepulseerde laser om dit te bereiken. Verzwak het laservermogen via de software tot 40 tot 50% van het piekvermogen om te monitoren, te herstellen en elke twee tot 10 seconden beelden te verkrijgen in epi-, fluorescentie- en brightfield-modus, beginnend vóór de beschadiging en voortdurend gedurende drie tot vijf minuten na de beschadiging. Meet de cellulaire FM-kleurstoffluorescentie om de kinetiek van het herstel te kwantificeren.Bereken de verandering in intensiteit tijdens het proces van beeldvorming. Bereken het gemiddelde van de gegevens voor meer dan 10 cellen per conditie en zet deze uit als gemiddelde waarden of als waarden van individuele cellen. Was de dekglasjes van C een en C twee.Bereid de culturen voor met CIM bij 37 °C en was C3 met PBS bij 37 °C. Breng de monsters vervolgens over op siliconen O-ringen. Voeg 100 µL voorverwarmde lysine fixable trissy dextran toe.Beschadig het plasmamembraan op C1 en C3 zoals eerder getoond. Voorkom vervolgens dat de kralen verder gaan rollen. Plaats alle dekglasjes in een incubator van 37 °C bij een omgevingsconcentratie CO2 en laat het herstel vijf minuten lang doorgaan.Om de glaskralen en Trixie-dextran te verwijderen, worden de dekglasjes gewassen in koud groeimedium, waarbij erop wordt gelet dat de glaskralen niet over de cellen rollen. Spoel de dekglasjes twee keer met koud groeimedium en breng ze over naar de O-ringen in C1 en C3. Voeg 100 µL rat anti-US lamp 1-antilichaam toe in koud compleet groeimedium en voeg het koude complete groeimedium toe aan C2 om antilichaambinding mogelijk te maken. Incubeer de dekglasjes 30 minuten bij 4 °C, gevolgd door drie wasbeurten met koud CIM.Fixeer alle dekglasjes met 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Spoel vervolgens drie keer met CIM. Incubeer daarna alle dekglasjes in 100 µL blokkeringsoplossing gedurende 15 minuten, gevolgd door 100 µL 488 anti-rat antilichaam gedurende 15 minuten.Was tweemaal met PBS en incubeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur in her stain na twee PBS-wasbeurten. Monteer de monsters op een objectglas en maak vervolgens beelden van de monsters met een epifluorescentiemicroscoop met beelden van C two-cellen. Bepaal de aspecifieke achtergrondkleuring in de rode en groene kanalen.Gebruik deze waarden voor de achtergrondkleuring om de rode en groene kanalen voor alle monsters te thresholden. Gebruik de meer dan 100 rood gelabelde cellen van C1 en C3 om de intensiteit van de lamp1-kleuring in beschadigde cellen te meten. In een geslaagd experiment zal de lamp1-kleuring van de cellen uit C3 significant lager zijn dan in de cellen uit C1. Om lysosomen met fluorescerende kleurstof te labelen, worden de cellen die tot 50% confluentie zijn gegroeid in groeimedium met FITC-dextran geïncubeerd.Laat het dextran gedurende twee uur endocyteren in de celcultuurincubator. Was de cellen met voorverwarmd groeimedium en incubeer deze hierin gedurende twee uur in een CO2-incubator, zodat al het geëndocyteerde dextran zich in het lysosoom kan ophopen vóór de beeldvorming. Spoel het dekglas in voorverwarmd CIM en monteer dit in CIM op een dekglashouder in de incubator op de objecttafel bij 37 graden Celsius.Selecteer cellen die geen dichtbevolkte met fitzy-dextran gelabelde lysosomen hebben voor beeldvorming. De beweging en exocytose van individuele lysosomen. Neem wide-field beelden op van de lysosoombeweging door de gehele cel.Verkrijg alternatieve beelden van turf voor beweging aan het celoppervlak en om hun exocytose te monitoren. Beschadig het celmembraan door bestraling, zoals eerder beschreven, om de respons van lysosomen op celbeschadiging te monitoren; beeld de cellen af met vier tot zes frames per seconde gedurende ten minste twee minuten of langer, afhankelijk van de dynamiek van de exocytose in de betreffende cellen. In deze bulkassay worden alle beschadigde cellen gemarkeerd en worden de cellen die niet hersteld zijn geïdentificeerd, terwijl de onbeschadigde cellen ongemarkeerd blijven.De cellen die beschadigd zijn door glaskralen in aanwezigheid van fitzy-dextran worden groen gelabeld wanneer de cellen zich mogen herstellen in aanwezigheid van calcium. De meeste beschadigde cellen slagen erin om te herstellen en worden niet gemarkeerd door trissy-dextran wanneer de cellen zich mogen herstellen. In afwezigheid van calcium worden de meeste beschadigde cellen ook rood gelabeld door het trissy-dextran.Dit experiment beoordeelt de kinetiek van het herstel van het celmembraan door de instroom van FM-kleurstof in de cel te monitoren. Wanneer ze worden geïncubeerd in FM-kleurstof, vertonen intacte cellen weinig tot geen intracellulaire kleuring. Na lokale laserschade aan het celmembraan begint FM-kleurstof de cel binnen te dringen en zich te binden aan endomembranen, wat leidt tot een plotselinge toename van de FM-kleurstof fluorescentie, aangezien het vermogen van het celmembraan om te herstellen na laserschade afhankelijk is van calcium.Een cel die beschadigd is in de aanwezigheid van calcium is in staat tot herstel, waardoor de instroom van de FM-kleurstof binnen een minuut na de beschadiging stopt. Daarentegen slaagt een cel die zich in afwezigheid van calcium mag herstellen er niet in om te herstellen, wat resulteert in een voortdurende instroom van kleurstof en bijgevolg een continue toename van de FM-fluorescentie, zelfs vier minuten na de beschadiging. Celmembraanherstel leidt dus tot een plateau in de FM-kleuring.Terwijl het uitblijven van celmembraanherstel leidt tot een continue instroom van kleurstof die geen plateau bereikt. De methode met glasparels voor bulkbeschadiging kan worden gebruikt om de translocatie van blaasjes en eiwitten naar het celoppervlak als reactie op beschadiging te monitoren. Hierbij worden de cellen beschadigd in aanwezigheid van trisy-dextran.Zo worden de niet-beschadigde cellen niet rood gelabeld, terwijl alle beschadigde cellen wel rood gelabeld zijn. Merk op dat niet-beschadigde cellen die niet zijn behandeld met het primaire antilichaam een achtergrondniveau van labeling vertonen voor cell surface lamp one. Wanneer cellen echter beschadigd raken en herstellen in de aanwezigheid van calcium, ondergaan lysosomen exocytose, waardoor er een verhoogd niveau van lamp one-kleuring optreedt op het oppervlak van de beschadigde cellen.Deze toename in de labeling van lamp one op het celoppervlak is veel lager in cellen die mogen herstellen in afwezigheid van calcium. Zowel het kwantificeren van het aantal cellen met een hoge kleuring van lamp one op het celoppervlak, als het meten van het niveau van de lamp one-kleuring op individuele beschadigde cellen, bieden maatstaven voor het vermogen van de cel om beschadigingsgetriggerde lysosomale exocytose te ondergaan.Dit experiment monitort direct de kinetiek, aard en locatie van individuele lysosoomfusie. Als reactie op beschadiging van het celmembraan worden de cellen beschadigd door een gepulste laser en worden lysosomen aan het celoppervlak in beeld gebracht via turf-imaging, wat het mogelijk maakt om de door beschadiging getriggerde exocytose van lysosomen in individuele cellen te monitoren. Deze figuur toont een cel die in het linkerpaneel wordt gevisualiseerd met fasecontrastmicroscopie en in het middelste paneel met turf-microscopie.Het rechterpaneel toont de turf-afbeelding van dezelfde cel 105 seconden na beschadiging. Hier wordt getoond hoe de beschadiging de rekrutering van een lysosoom naar het celmembraan triggerde, gevolgd door exocytose. Dit lysosoom is niet zichtbaar op de turf-afbeelding vóór de beschadiging, maar na de beschadiging bereikt het lysosoom het celmembraan en wordt het detecteerbaar.Naarmate het blaasje dichter bij het celmembraan komt, wordt het sterker geëxciteerd door de TIRF-verlichting, waardoor de fluorescentie van de lysosomale DExT-streng een maximale waarde bereikt. Wanneer de fusieporie opent, leidt dit tot neutralisatie van de lysosomale pH en daarmee tot het opheffen van de quenching van de DExT-strengfluorescentie. Vervolgens wordt de DExT-streng uit het blaasje naar de buitenkant van de cel afgegeven, waardoor de fluorescentie zich lateraal verspreidt en de fluorescentie van het blaasje geleidelijk afneemt; diverse door beschadiging getriggerde responsen van de lysosomen kunnen hiermee worden gemeten.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u de capaciteit van cellen om te herstellen van grote focale letsels kunt monitoren en hoe u subcellulaire compartimenten en eiwitten kunt monitoren die reageren op en helpen bij het herstelproces. Verdere experimenten met verschillende vitale labels, compartimenten of eiwitten kunnen worden uitgevoerd om de respons op letsel en de betrokkenheid bij het herstel van IND-cellen te monitoren.

imaging-cell-membrane-injury-subcellular-processes-involved

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een gedetailleerd protocol is beschreven voor de beeldvorming van de real-time vorming van DNA-herstel complexen...

Imaging mismatch repair en cellulaire reacties op DNA-schade in Bacillus subtilis</em

Hier beschreven worden protocollen die worden gebruikt om het dynamische proces van MG53-gemedieerde celmembraan te herstellen in zijn geheel dieren en op cellulair niveau te visualiseren. Deze methoden kunnen worden toegepast op de celbiologie van de plasma membraan opnieuw sluiten en regeneratieve geneeskunde te onderzoeken.

Visualisatie van MG53-gemedieerde celmembraan Reparatie gebruik In vivo En In vitro Systemen

Beeldvorming van levende cellen blootgesteld aan de lipofiele kleurstof FM1-43 maakt nauwkeurige bepaling van de kinetiek waarmee poriënvormende toxines worden verwijderd uit de plasmamembraan. Dit is een gevoelige test die kan worden gebruikt om vereisten voor Ca 2 +, sphingomyelinase en andere factoren plasmamembraan reparatie beoordelen.

Wonen Imaging Assay voor het beoordelen van de Rollen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; En sphingomyelinase in de Reparatie van Pore-vormende Toxine Wonden

Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

Het doel van dit protocol is te beschrijven hoe laser microirradiation voor het opwekken van verschillende soorten DNA-beschadiging, met inbegrip van relatief eenvoudige strand einden en complexe schade, aan de studie van DNA schade signalering en reparatie factor montage op schade sites in vivo .

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

Confocale fluorescentie microscopie en laser micro-bestraling aanbod tools voor inducerende DNA-beschadiging en het toezicht op de reactie van DNA reparatie eiwitten in geselecteerde sub nucleaire gebieden. Deze techniek is onze kennis van schade detectie, signalering en werving aanzienlijk vooruitgegaan. Dit manuscript toont deze technologieën te onderzoeken van een- en tweepersoonskamers strand break repair.

Toepassing van Laser-Micro-bestraling voor onderzoek van enkele en dubbele Strand Break Repair in zoogdiercellen

Cell membrane verwonding via twee-foton laser is een veelgebruikte methode voor de beoordeling van de membraan opnieuw verzegelen vermogen en kan worden toegepast op meerdere celtypes. Hier beschrijven we een protocol voor in vitro live-imaging membraan daarvan in dysferlinopathy patiënten cellen na twee-foton laser van het baarmoederslijmvlies.

Cell Membrane Repair Assay met behulp van een Laser van het twee-foton microscoop

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer fluorescentie gebaseerde bepaling dat de maatregelen van het plasma-membraan opnieuw verzegelen efficiëntie door fluorimetrische en imaging analyses in levende cellen. Deze test kan worden gebruikt voor het screenen van drugs of doelgenen die regelen plasmamembraan opnieuw verzegelen in zoogdiercellen.

High-throughput meting van plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen

Dit artikel introduceert essentiële stappen van immunostaining en chromatine immunoprecipitatie. Deze protocollen worden vaak gebruikt om DNA-schadegerelateerde cellulaire processen te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren.

Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade

De thermoplasmonische punctiemethode integreert confocale microscopie, optische pincetten en gouden nanodeeltjes om eiwitreacties te bestuderen tijdens plasmamembraanherstel in cellen en gigantische unilamellaire blaasjes. De techniek maakt een snelle en gelokaliseerde membraanpunctie mogelijk, waardoor de belangrijkste eiwitten en hun functionele rol in de ingewikkelde plasmamembraanreparatiemachines kunnen worden geïdentificeerd.

Een thermoplasmonische benadering voor het onderzoeken van plasmamembraanherstel in levende cellen en modelmembranen

Leer hoe je celmembraanletsel en subcellulaire reparatieprocessen visualiseert met fluorescerende kleurstoffen. Deze methode toont lysosomale exocytose en eiwittrafficking bij wondherstel in levende cellen.

Imaging celmembraan letsel en Subcellulaire processen die betrokken zijn in reparatie

Meer video's verkennen