Imaging celmembraan letsel en Subcellulaire processen die betrokken zijn in reparatie

Het algemene doel van het volgende experiment is om het effect van gewenste behandelingen op de reparatie van beschadigde cellen te observeren en de subcellulaire processen te bestuderen die helpen bij het repareren van beschadigde cellen. Dit wordt bereikt door cellen te beschadigen in de aanwezigheid van fluorescerende kleurstoffen die geen intacte celmembranen kunnen passeren om de kinetiek en het vermogen van beschadigde cellen om het binnendringen van deze kleurstoffen te voorkomen te beoordelen. Als tweede stap bewaken we het verschijnen van intracellulaire eiwitten op het beschadigde celmembraan, wat de mogelijkheid identificeert van een celcompartiment van belang om deel te nemen aan reparatie door te fuseren met het beschadigde celmembraan.

Vervolgens bewaken we de fusie van celcompartimenten van belang met het beschadigde celmembraan om de kinetiek van de beschadiging te volgen. Geactiveerde fusie van dit compartiment resulteert in resultaten die laten zien dat reparatie van celmembraanbeschadiging geassocieerd is met lysosomale exocytose op basis van verhoogde verschijning van lysosome geassocieerd membraaneiwit, een op het beschadigde celoppervlak en levend beeld van secretie van lysosomale inhoud door beschadigde cellen. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over celbeschadiging en -reparatie.

Bijvoorbeeld, deze kunnen worden gebruikt om te bepalen welke eiwitten en cellulaire compartimenten reageren op focale verwondingen aan het celmembraan en vervolgens hun kinetiek van de respons evalueren. Het demonstreren van de procedure zou Aurelia D vier en hamma stra twee van de postdoctorale medewerkers uit mijn laboratorium zijn. Om afzonderlijk de beschadigde cellen die genezen en die niet genezen te markeren.

Zaai de cellen op steriele dekjes voor de drie experimentele omstandigheden. Kweek de cellen tot ze meer dan 50% confluency bereiken, was vervolgens C één en C twee twee keer met CIM bij 37 graden Celsius. Was C3 met PBS bij 37 graden Celsius.

Breng vervolgens de dekjes over op siliconen O-ringen.Rings. Voeg 100 microliters voorverwarmde fitzy dextran oplossing toe in een geschikte buffer. Beschadig het plasmamembraan op C één en C3 door 40 milligram glazen kralen toe te voegen bovenop het dekje bij kamertemperatuur en het dekje handmatig te kantelen.

Slips heen en weer zes tot acht keer in een hoek van 30 graden voor lichte verwonding. Zorg ervoor dat de glazen kralen gelijkmatig verdeeld zijn, waardoor herhaalde verwondingen worden geminimaliseerd om de reproduceerbaarheid van verwondingen tussen monsters te verbeteren. Voer tegelijkertijd de glazenkralenverwonding van de verschillende te vergelijken monsters uit en vermijd verder rollen van de kralen.

Breng alle dekjes over naar een 37 graden Celsius incubator bij omgevings-CO2 en laat reparatie gedurende vijf minuten doorgaan zonder de kralen te laten rollen. Verwijder de glazen kralen en fitzy dextran door te wassen met buffer of PBS. Plaats nu de dekjes terug op de O-ring en voeg 100 microliters voorverwarmde lysine toe.

Fixable trissy dextran oplossing Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten bij omgevings-CO2. Was de dekjes twee keer met voorverwarmde CIM en fixeer met 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur na twee PBS-washes. Incubeer gedurende twee minuten in hersch-kleurstof en monteer na twee PBS-washes het monster op een schuifje met montagemedium.

Beeld de cellen vervolgens af met behulp van een epifluorescentiemicroscoop vanuit het C twee-monster. Bepaal de achtergrondrode en groene kleuringsintensiteit. Gebruik vervolgens deze waarde om de rode en groene kanalen voor alle monsters te thresholden.

Score het totale aantal cellen dat groen is. Score ook cellen die rood of zowel rood als groen zijn in de C één en C3-monsters. Tel nu meer dan 100 groene beschadigde cellen voor elke conditie en druk het aandeel cellen dat niet is gerepareerd uit als een percentage van alle beschadigde cellen.

Was de cellen die tot meer dan 50%Confluency zijn gekweekt met voorgewaarschuwde CIM en monteer het dekje in CIM met FM-kleurstof. In een houder in de stage top incubator die op 37 graden Celsius wordt gehouden. Selecteer een gebied van het celmembraan met optimaal vermogen dat consistente maar niet dodelijke verwondingen mogelijk maakt.

Belicht het monster minder dan 10 milliseconden met de gepulseerde laser om dit te bereiken. Verlaag de laservermogen via de software naar 40 tot 50%van het piekvermogen om reparatie, het verkrijgen van afbeeldingen elke twee tot 10 seconden in epi, fluorescentie en helder veld te bewaken, beginnend vóór de verwonding en doorgaande gedurende drie tot vijf minuten na de verwonding. Om de kinetiek van reparatie te kwantificeren, meet u de fluorescentie van cellulaire FM-kleurstof.

Bereken de verandering in intensiteit tijdens het beeldvormingsproces. Gemiddel de gegevens voor meer dan 10 cellen in elke conditie en plot als gemiddelde of individuele cellen waarde. Was de dekjes van C één en C twee.

Kweek preparaten met CIM bij 37 graden Celsius en was C3 met PBS bij 37 graden Celsius. Breng vervolgens de monsters over op siliconen O-ringen. Voeg 100 microliters voorverwarmde lysine fixable trissy dextran toe.

Beschadig het plasmamembraan op C één en C3 zoals eerder getoond. Vermijd vervolgens verder rollen van de kralen. Breng alle dekjes over naar een 37 graden Celsius incubator bij omgevings-CO2 en laat reparatie gedurende vijf minuten doorgaan.

Verwijder nu de glazen kralen en Trixie dextran door de dekjes te wassen in koud groeimedium, zorg ervoor dat de glazen kralen niet op de cellen rollen. Spoel de dekjes twee keer met koud groeimedium en breng ze over naar de O-ringen naar C één en C3.Voeg 100 microliters rat anti-US lamp één antilichaam toe in koud compleet groeimedium en voeg het koude complete groeimedium toe aan C twee om antilichaambinding mogelijk te maken. Incubeer dekjes gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius na drie washes met koud CIM.

Fixeer alle dekjes met