Name: Imaging celmembraan letsel en Subcellulaire processen die betrokken zijn in reparatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: Leer hoe je celmembraanletsel en subcellulaire reparatieprocessen visualiseert met fluorescerende kleurstoffen. Deze methode toont lysosomale exocytose en eiwittrafficking bij wondherstel in levende cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grants AR055686 en AR060836 en postdoctoraal fellowship aan AD door de Franse Vereniging van de Spierdystrofie (AFM). De cellulaire beeldvorming inrichting gebruikt in deze studie wordt ondersteund door National Institutes of Health Grants HD040677.

1. Imaging celmembraan Reparatie behulp Bulk (Glass Bead) Verwonden Met dit protocol kunt afzonderlijk markeren van de beschadigde cellen en degenen die niet te genezen. Kwantificeren van deze populaties van cellen vereist het gebruik van drie voorwaarden: 1. Test (C1) - Cellen mogen te herstellen in aanwezigheid van Ca 2 +, 2. Controle 1 (geen schade C2) - Cellen worden geïncubeerd in aanwezigheid van Ca2 +, maar niet gewond en 3. Control 2 (geen reparatie C3) - cellen zijn toegestaan ​​om te herstellen in afwezigheid van Ca 2 +. <ol><li> Kweek cellen&gt; 50% confluentie drie steriele dekglaasjes en was C1 en C2 tweemaal met CIM bij 37 ° C en C3 met PBS bij 37 ° C en overdracht dekglaasjes op silicone O-ringen. </li><li> Voeg 100 ul van voorverwarmde FITC dextran oplossing CIM van C1 en C2 of C3 PBS. </li><li> Verwonden plasmamembraan bij C1 en C3 door zacht glooiende 40 mg glazen kralen over het dekglaasje bij kamertemperatuur door het handmatig kantelen dekglaasjes terug enweer 6-8 keer onder een hoek van 30 °. Opmerking: Bij lichte blessure, zorgen de glazen kralen zijn gelijkmatig verdeeld, dus het minimaliseren van herhaling verwondingen. Om reproduceerbaarheid schade tussen monsters verbeteren, tegelijkertijd uitvoeren van de glaskraal schade van de verschillende monsters te vergelijken. </li><li> Om verdere rollen kralen; breng dekglaasjes tot een 37 ° C incubator bij omgevingstemperatuur CO2 en laat reparatie men gedurende 5 minuten. </li><li> Zonder dat de korrels rollen, het glazen kralen en FITC dextran door wassen met CIM (C1 en C2) of PBS (C3) bij 37 ° C. </li><li> Plaats coverslips terug op de O-ring en voeg 100 ul van voorverwarmde lysine fixable TRITC dextran oplossing CIM op C1 en C2 of in PBS op C3. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten bij omgevingstemperatuur CO2. </li><li> Was tweemaal met dekglaasjes voorverwarmde CIM en bevestig met 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was tweemaal met PBS en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur Hoechst kleurstof. </li><li> Wassen samples tweemaal met PBS, monteren op een dia met behulp van montage media en imago cellen met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. </li><li> Gebruik cellen van C2 naar de achtergrond rode en groene kleurintensiteit bepalen en deze waarde drempel de rode en groene kanalen voor alle monsters (C1-C3). </li><li> Score totaal aantal cellen dat a) groene (gewonden en gerepareerd) en b) rood of beide rood en groen (gewonden, maar niet te repareren) C1 en C3 monsters. </li><li> Telling&gt; 100 greens cellen voor elke voorwaarde en drukken de fractie van cellen die niet te repareren als percentage van alle cellen gewonden (groen en rood). </li></ol> 2. Live-Imaging van de kinetiek van celmembraan Reparatie Na Laser Injury <ol><li> Was de cellen met voorverwarmde CIM en zet dan het dekglaasje in CIM met FM kleurstof. </li><li> Plaats het dekglaasje in een houder in de bovenste fase incubator op 37 ° C. </li><li> Selecteer een 1-2 mm2 gebied van het celmembraan en bestralen voor &lt;, 10 msec met gepulste laser. Verzwakken het laservermogen via de software tot 40-50% van het piekvermogen. Optimale voeding laat consistent, maar niet-dodelijke verwondingen en dit moet worden bepaald door trial and error voor elk individueel instrument en cellijn wordt gebruikt. </li><li> Te repareren, afbeelding controleren elke 10 seconden in epifluorescentie en helderveld, ingaan vóór letsel en blijven voor 3-5 minuten na letsel. Opmerking: Voor geen reparatie controle, herhaalt u de stappen 2,1-2,4 met de cellen gewond bij PBS met FM-kleurstof. </li><li> Om de kinetiek van de reparatie te kwantificeren, meten cellulaire FM kleurstof fluorescentie en plot de verandering in intensiteit (ΔF/F0) in de loop van de beeldvorming. Deze gegevens worden gemiddeld voor meer dan 10 cellen per conditie en uitgezet als gemiddelde waarde of individuele cel, zoals nodig. </li></ol> 3. Imaging Bulk (Glass Bead) Letsel Induced Lysosomal Exocytosis De volgende monsters omvatten cellen gekweekt tot&gt; 50%samenvloeiing: 1. Test (C1) - cellen toegestaan ​​te herstellen in aanwezigheid van Ca 2 +, 2. Controle 1 (C2; geen letsel) - Cellen noch gewond noch geïncubeerd met primair antilichaam, en 3. Control 2 (C3; geen reparatie) - Cellen toegestaan ​​om te herstellen in afwezigheid van Ca 2 +. <ol><li> Was dekglaasjes C1 en C2 tweemaal met CIM bij 37 ° C en C3 met PBS bij 37 ° C en overbrengen op silicone O-ringen. </li><li> Voeg 100 ul voorverwarmde lysine vastzetbaar TRITC dextran CIM van C1 en C2 en C3 in PBS op. </li><li> Verwonden plasmamembraan bij C1 en C3 zoals in stap 1.3. </li><li> Om verdere rollen kralen; breng dekglaasjes tot een 37 ° C incubator bij omgevingstemperatuur CO2 en laat reparatie men gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de glazen kralen en TRITC dextran door het wassen van de dekglaasjes in koud groeimedium en zorgt op geen rollen van de glasparels op de cellen. </li><li> Spoel tweemaal de dekglaasjes met koud kweekmedium en transfer naar de O-ringen. </li><li> Naar C1 en C3Voeg 100 ul rat anti-muis antilichaam LAMP1 koud volledig groeimedium en voeg de koude, compleet groeimedium C2. </li><li> Om antilichaambinding dekglaasjes Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Was de dekglaasjes driemaal met koud CIM en vast alle coverslips met 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en spoel 3x met CIM. </li><li> Incubeer alle dekglaasjes in 100 ui blokkerende oplossing gedurende 15 min bij KT </li><li> Incubeer alle dekglaasjes in 100 pl Alexa Fluor 488 anti-rat antilichaam gedurende 15 minuten bij 4 ° C. </li><li> Was tweemaal met PBS en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur Hoechst. </li><li> Was de cellen tweemaal met PBS, monteren op een dia met behulp van montage-media en het beeld met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. </li><li> Afbeeldingen gebruiken C2 cellen, bepalen de niet-specifieke achtergrondkleuring in het rode (TRITC dextran) en groene (Alexa Fluor 488 antilichaam) kanalen en deze gebruiken achtergrondkleuring waarden drempel de rode en groene kanalen voor alle monsters (C1-C3). &lt;/ Li&gt; <li> Gebruik&gt; 100 rode gemerkte cellen uit C1 en C3 aan de intensiteit van kleuring LAMP1 (groen) in beschadigde cellen te meten. Voor een succesvolle experiment LAMP1 kleuring in cellen C3 aanzienlijk lager dan in cellen van C1 zijn. </li></ol> 4. Live-Imaging van celmembraan Injury Getriggerd Subcellulaire Trafficking <ol><li> Fluorescent label de compartiment van rente door transfecteren geschikte reporter (bijv. CD63-GFP voor 8 lysosomen) of met behulp van fluorescerende kleurstoffen 9. </li><li> Voor de etikettering lysosomen met fluorescerende kleurstof, incubeer cellen gekweekt tot 50% confluentie in groeimedia met FITC-dextran </li><li> Laat dextran worden endocytosed 2 uur (of langer als nodig is voor voldoende endosomal labeling met dextran door de cellijn van belang) in de CO 2 incubator. </li><li> Was de cellen met voorverwarmd groeimedium en incubeer daarin gedurende 2 uur in een CO2 incubator om alleendocytose dextran ophopen in het lysosoom. </li><li> Voor beeldvorming, spoel het dekglaasje in voorverwarmde CIM en houder van een dekglaasje houder op het podium top incubator bij 37 ° C. </li><li> Voer groothoek (voor verkeer in de cel) of TIRF (verkeer aan het celoppervlak en exocytose) imaging - cellen die niet FITC gelabelde dextran kan druk lysosomen zijn ideaal voor beeldvorming van de verplaatsing en exocytose individuele lysosomen. </li><li> Uitlijnen van de TIRF lasers voor imaging microscoop: Gebruik 60X of 100X doelstelling met&gt; 1.45 NA. Stel de hoek voor het incident TIRF laserstraal met behulp van de aanpak van de fabrikant. </li><li> Verwonden celmembraan door bestraling een kleine (1-2 mm 2) regio &lt;100 msec, met de gepulste laser op 40-50% verzwakking. </li><li> Om de reactie van lysosoom controleren om schade afbeeldingscellen cel 4-6 beelden / sec gedurende minstens 2 minuten of langer, afhankelijk van de dynamiek van exocytose in de cellen van belang. </li></ol>

<ol><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li>
<li>McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound assays.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).</li>
<li>McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+introduction+of+molecules+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct introduction of molecules into cells.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).</li>
<li>Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li>
<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
<li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaiswal%2C+JK+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+events+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Celmembraan schade in vivo optreedt als gevolg van een verscheidenheid van fysiologische stressoren verschillende experimentele benaderingen zijn ontwikkeld om deze na te bootsen. Deze omvatten verwonden celmembraan van hechtende cellen door schrapen ze van de schaal of door passage van door een smalle boring spuit 9,10. Naar aanleiding van dergelijke verwondingen de cellen te genezen in suspensie en niet gehouden aan de extracellulaire matrix zoals ze normaal doen in het weefsel. Weer anderen, zoals...

Celmembraan handhaaft de integriteit van de cellen door een barrière tussen de cellen en de extracellulaire omgeving. Een chemische, elektrische of mechanische stimulus die de normale fysiologische drempel en de aanwezigheid van binnendringende pathogenen dan kan elk letsel aan het celmembraan en leiden tot een latere cellulaire respons op de schade te herstellen. Om deze verwondingen overleven de celmembraan, cellen beschikken over een efficiënt mechanisme voor reparatie. Dit mechanisme is calcium afhankelijk en gaat intracellulair verkeer van eiwitten zoals annexinen en MG53 oa evenals subcellulaire compartimenten zoals endosomen, lysosomen, Golgi afgeleide blaasjes en mitochondriën aan de benadeelde celmembraan 1-7. Toch blijft de gegevens van de sequentie van moleculaire en subcellulaire gebeurtenissen betrokken bij het herstel van beschadigde celmembraan slecht begrepen. Reparatie reactie cel kan worden gescheiden in het oorly en late reacties. Vroege reacties, die binnen seconden tot minuten tijdschaal, zijn enorm belangrijk bij het bepalen van de aard van de late reacties die leiden tot succesvol herstel van cellen of celdood. Eindpunt assays gebaseerd op bulk biochemische en cellulaire analyse hebben meegewerkt aan de totstandkoming van de betrokkenheid van de moleculaire en cellulaire processen in de reparatie. Maar vanwege de heterogeniteit en de snelheid van cellulaire reparatiereactie, eindpunt assays niet de kinetische en ruimtelijke data van de reeks gebeurtenissen die tot herstelling. Benaderingen die gecontroleerde schade van celmembraan mogelijk en laat de controle celmembraan reparatie en bijbehorende subcellulaire reacties op hoge ruimtelijke en temporele resolutie zijn ideaal voor dergelijke studies. Hier hebben dergelijke benaderingen gepresenteerd. Twee van de protocollen beschreven benaderingen van de real-time kinetiek van celmembraan reparatie en de subcellulaire responsen geassocieerd met het reparatieproces in levende cellen na laser inj bewakenUry. Ter aanvulling op deze live cell imaging gebaseerde testen, hebben eindpunt assays ook beschreven dat een populatie gebaseerd maatregel voorzien in toezicht reparatie van individuele cellen en de bijbehorende subcellulaire reacties. Om hun nut bewijzen deze benaderingen zijn gebruikt om mensenhandel en exocytose van lysosomen bewaken in reactie op celmembraan letsel.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H1387</td><td>Wordt gebruikt voor de bereiding van CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP410</td><td>Wordt gebruikt voor de bereiding van CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td></tr><tr><td>FITC dextran (Lysine fixable)</td><td>Invitrogen</td><td>D1820</td><td>2 mg/ml in CIM of PBS</td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>TRITC dextran (Lysine fixable)</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>2 mg/ml in CIM of PBS</td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% in PBS</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1/10 000 in PBS</td></tr><tr><td>FM dye</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td>1 &micro;g/&micro;l in CIM of PBS</td></tr><tr><td>FITC dextran</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>2 mg/ml in groeimedium</td></tr><tr><td>LAMP1&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-19992</td><td>1/300 in groeimedium</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>1/500 in blokkeeroplossing</td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom petridish</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Silicone O ring</td><td>Bellco</td><td>1943-33315</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip holder</td><td>Bellco</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>12001-566</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>MP1400-500H</td><td>Wordt gebruikt voor groeimedium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin/Sreptomycin</td><td>VWR</td><td>12001-350</td><td>Wordt gebruikt voor groeimedium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td></tr><tr><td>Chicken serum</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td>5% kippen serum in CIM wordt gebruikt voor blokkeeroplossing tijdens immunokleuring</td></tr><tr><td>PBS (Ca2+ en Mg2+ vrij)</td><td>VWR</td><td>12001-664</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescent microscope</td><td>Olympus America, PA</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>TIRF illuminator&nbsp;</td><td>Olympus America, PA</td><td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescent illuminator</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Photometrics, Tucson, AZ</td><td>Evolve 512 EMCCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Image acquisition and analysis software</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Slidebook 5</td><td></td></tr><tr><td>Pulsed laser</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Ablate (3iL13)</td><td></td></tr><tr><td>Stage top incubator</td><td>Tokaihit, Japan</td><td>INUBG2ASFP-ZILCS</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging celmembraan letsel en subcellulaire processen die betrokken zijn in reparatie

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

Het vermogen van beschadigde cellen te genezen is een fundamenteel cellulair proces, maar cellulaire en moleculaire mechanismen betrokken bij genezing beschadigde cellen worden slecht begrepen. Hier assays zijn beschreven om het vermogen en de kinetiek van genezing van gekweekte cellen na gelokaliseerde schade controleren. Het eerste protocol beschrijft een eindpunt gebaseerde benadering van celmembraan herstel vermogen van honderden cellen tegelijkertijd te beoordelen. Het tweede protocol beschrijft een real-time imaging benadering om de kinetiek van celmembraan reparatie in individuele cellen na gelokaliseerde letsel met een gepulste laser controleren. Als genezing beschadigde cellen betreft handel in specifieke eiwitten en subcellulaire compartimenten om de plaats van het letsel, de derde protocol beschrijft het gebruik van bovenstaande eindpunt gebaseerde benadering van een dergelijke handel event (lysosomale exocytose) in honderden cellen gewond gelijktijdig beoordelen en het laatste protocol beschrijft het gebruik van gepulste laser letsel met TIRF microskopie aan de dynamiek van de individuele subcellulaire compartimenten in beschadigde cellen bij hoge ruimtelijke en temporele resolutie monitoren. Terwijl de protocollen Hier wordt de toepassing van deze benaderingen het verband tussen celmembraan reparatie en lysosomale exocytose in gekweekte spiercellen bestuderen, kunnen ze worden toegepast als zodanig voor andere hechtende gekweekte cellen en subcellulaire compartiment keuze.

Protocollen hier beschreven voor de enkele-cell imaging zijn om het vermogen en de kinetiek van celmembraan reparatie (Protocollen 1 en 2) en de subcellulaire mensenhandel en fusie van lysosomen tijdens de reparatie te controleren (Protocollen 3 en 4). Protocol nr. 1 toont een bulk test waarmee markering alle beschadigde cellen en het identificeren van die beschadigde cellen die niet te repareren. De resultaten in Figuur 1 laten zien dat, terwijl de niet-beschadigde cellen <...

Het genezingsproces beschadigde cellen omvat handel specifieke eiwitten en subcellulaire compartimenten aan de plaats van celmembraan schade. Dit protocol beschrijft assays deze processen volgen.

Imaging celmembraan letsel en Subcellulaire processen die betrokken zijn in reparatie

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om het effect van gewenste behandelingen op het herstel van beschadigde cellen te observeren en om de subcellulaire processen te bestuderen die helpen bij het herstellen van beschadigde cellen. Dit wordt bereikt door cellen te beschadigen in aanwezigheid van fluorescerende kleurstoffen die intacte celmembranen niet kunnen passeren, om zo de kinetiek en het vermogen van beschadigde cellen om de instroom van deze kleurstoffen te voorkomen te beoordelen. Als tweede stap monitoren we de verschijning van intracellulaire eiwitten bij het beschadigde celmembraan, wat het vermogen van een relevant cellulair compartiment identificeert om deel te nemen aan het herstel door te fuseren met het beschadigde celmembraan.Vervolgens monitoren we de fusie van relevante cellulaire compartimenten met het beschadigde celmembraan om de kinetiek van de beschadiging te volgen. De resultaten van de getriggerde fusie van dit compartiment laten zien dat het herstel van de celmembraanbeschadiging geassocieerd is met lysosomale exocytose, gebaseerd op de toegenomen aanwezigheid van lysosome associated membrane protein 1 aan het beschadigde celoppervlak en live-i

imaging-cell-membrane-injury-subcellular-processes-involved

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een gedetailleerd protocol is beschreven voor de beeldvorming van de real-time vorming van DNA-herstel complexen...

Imaging mismatch repair en cellulaire reacties op DNA-schade in Bacillus subtilis</em

Hier beschreven worden protocollen die worden gebruikt om het dynamische proces van MG53-gemedieerde celmembraan te herstellen in zijn geheel dieren en op cellulair niveau te visualiseren. Deze methoden kunnen worden toegepast op de celbiologie van de plasma membraan opnieuw sluiten en regeneratieve geneeskunde te onderzoeken.

Visualisatie van MG53-gemedieerde celmembraan Reparatie gebruik In vivo En In vitro Systemen

Beeldvorming van levende cellen blootgesteld aan de lipofiele kleurstof FM1-43 maakt nauwkeurige bepaling van de kinetiek waarmee poriënvormende toxines worden verwijderd uit de plasmamembraan. Dit is een gevoelige test die kan worden gebruikt om vereisten voor Ca 2 +, sphingomyelinase en andere factoren plasmamembraan reparatie beoordelen.

Wonen Imaging Assay voor het beoordelen van de Rollen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; En sphingomyelinase in de Reparatie van Pore-vormende Toxine Wonden

Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

Het doel van dit protocol is te beschrijven hoe laser microirradiation voor het opwekken van verschillende soorten DNA-beschadiging, met inbegrip van relatief eenvoudige strand einden en complexe schade, aan de studie van DNA schade signalering en reparatie factor montage op schade sites in vivo .

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

Confocale fluorescentie microscopie en laser micro-bestraling aanbod tools voor inducerende DNA-beschadiging en het toezicht op de reactie van DNA reparatie eiwitten in geselecteerde sub nucleaire gebieden. Deze techniek is onze kennis van schade detectie, signalering en werving aanzienlijk vooruitgegaan. Dit manuscript toont deze technologieën te onderzoeken van een- en tweepersoonskamers strand break repair.

Toepassing van Laser-Micro-bestraling voor onderzoek van enkele en dubbele Strand Break Repair in zoogdiercellen

Cell membrane verwonding via twee-foton laser is een veelgebruikte methode voor de beoordeling van de membraan opnieuw verzegelen vermogen en kan worden toegepast op meerdere celtypes. Hier beschrijven we een protocol voor in vitro live-imaging membraan daarvan in dysferlinopathy patiënten cellen na twee-foton laser van het baarmoederslijmvlies.

Cell Membrane Repair Assay met behulp van een Laser van het twee-foton microscoop

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

De door straling veroorzaakte DNA-schaderespons die wordt geactiveerd door neutronenmixstraal die wordt gebruikt in de boorneutronvangtherapie (BNCT) is nog niet volledig vastgesteld. Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor het detecteren van door straling geïnduceerde foci (RIF) van reparatie-eiwitten door immunofluorescentie kleuring in menselijke darmkankercellijnen na bestraling met de neutronen gemengde straal.

Immunofluorescentie beeldvorming van DNA Schade en Reparatie Foci in human Colon Kankercellen

Dit artikel introduceert essentiële stappen van immunostaining en chromatine immunoprecipitatie. Deze protocollen worden vaak gebruikt om DNA-schadegerelateerde cellulaire processen te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren.

Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade

De thermoplasmonische punctiemethode integreert confocale microscopie, optische pincetten en gouden nanodeeltjes om eiwitreacties te bestuderen tijdens plasmamembraanherstel in cellen en gigantische unilamellaire blaasjes. De techniek maakt een snelle en gelokaliseerde membraanpunctie mogelijk, waardoor de belangrijkste eiwitten en hun functionele rol in de ingewikkelde plasmamembraanreparatiemachines kunnen worden geïdentificeerd.

Een thermoplasmonische benadering voor het onderzoeken van plasmamembraanherstel in levende cellen en modelmembranen

Leer hoe je celmembraanletsel en subcellulaire reparatieprocessen visualiseert met fluorescerende kleurstoffen. Deze methode toont lysosomale exocytose en eiwittrafficking bij wondherstel in levende cellen.

Imaging celmembraan letsel en Subcellulaire processen die betrokken zijn in reparatie

Meer video's verkennen