Name: Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Leer de isolatie van cardiomyocyten uit muizenharten met LOR-perfusie voor fysiologische analyse. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek naar contractiliteit en calciumtransiënten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Marc Wozniak voor het gebruik van het Ministerie van Cell en Developmental Biology videografie apparatuur. Vanderbilt University Cell Imaging Shared Resource. Dit werk wordt ondersteund door AHA subsidie ​​12PRE10950005 tot ERP, AHA subsidie ​​11GRNT7690040 naar DMB, NIH-subsidie ​​R01 HL037675 naar DMB. DMB is de Gladys P. Stahlman Stoel in Cardiovascular Research.

Zorg ervoor dat alle procedures waarbij dieren worden goedgekeurd door de bevoegde gebruik van dieren en zorg lichaam. 1 Bereid Stock Buffers in Advance <ol><li> Bereid 2 L voorraad Ca 2 + gratis Tyrode (tabel 1). Breng de pH op 7,4 met NaOH. </li><li> Bereid 2 L voorraad 1,2 mM Ca 2 + Tyrode (tabel 2). Breng de pH op 7,4 met NaOH. </li></ol> 2 Op de dag van het experiment, Bereid Perfusie, Transfer, en Spijsvertering Buffers <ol><li> Bereid 150 ml perfusie buffer in Ca 2 + gratis Tyrode (tabel 3) en filtreer door een 0,2 um filter. </li><li> Bereid 35 ml Ca2 + vrije transfer &quot;Buffer A&quot; (tabel 4) en 25 ml Ca2 + met &quot;Buffer B&quot; (Tabel 5). Filtreer elk door een 0,2 urn filter. </li><li> Bereid oplossingen van 00,06, 0,24, 0,6, en 1,2 mM Ca2 + door mengen van buffer A en B per Tabel 6. </li><li> Bereid 25 ml digestie buffer door oplossen verteringsenzymen in 25 ml perfusiebuffer (Tabel 7) op basis van het lichaamsgewicht (BW) van de muis. Filtreer door een filter voor gebruik 0,2 micrometer. </li></ol> 3 Experimentele Setup <ol><li> Monteer een constante stroom Langendorff-apparaat, in de handel verkrijgbaar of met een peristaltische pomp, leidingen en een warmtewisselaar met een stroomsnelheid van 3 ml toestaan ​​/ min perfusievloeistof verwarmd tot 37 ° C. Een eenvoudig schema is te vinden in de evaluatie in 2011 door Bell et al 18. </li><li> Stel circulerend waterbad temperatuur (~ 47 ° C) van de Langendorff inrichting zodat uitstroom uit de canule bij 37 ° C met een stroomsnelheid van 3 ml / min. </li><li> Run 70% ethanol via het perfusie systeem gedurende 15 min, gevolgd door 100 ml type I ultrazuiver water. Ren perfusie buffer door de system voor 5 min, terwijl het elimineren van luchtbellen. </li><li> Steriliseer alle chirurgische instrumenten met een gewenste methode. </li><li> Maak canule door het aanbrengen van een kort stuk (ongeveer 3 mm) van PE-50 slang aan het uiteinde van een 23 G Luer-adapter stub. Heat tip buis een lip waarover de aorta worden geplaatst creëren. </li></ol> 4 Cardiomyocyte Isolatie <ol><li> Injecteer muis met 0,2 ml heparine-oplossing (1000 IU / ml), via intraperitoneale injectie. </li><li> Na 5 min, verdoven muis met isofluorane. Wanneer deze volledig verdoofd (geen reactie op sterke voet snuifje), spray op de borst met 70% EtOH. Open de kist, snel accijnzen het hart, zorg dat u de aorta, en de plaats in 4 ° C perfusie buffer niet te beschadigen. Met gebogen pincet te begrijpen en op te heffen onder het hart. Dit creëert ruimte om bijlagen achter het hart met fijne schaar knippen. </li><li> Canule het hart door voorzichtig grijpen de rand van de aorta met twee paar fijne tang en voorzichtig trekken aan de openinng van de aorta boven de rand van de canule. Zorg ervoor dat de punt van de canule niet voorbij de aortaklep en in het ventrikel, zoals deze perfusie van het hart zal remmen via de kransslagaders. </li><li> Bevestig de aorta aan de canule door binden een lus van 5-0 zijden hechtdraad rondom de aorta direct boven de rand van de canule. </li><li> Opmerking: De stappen 4.2 tot 4.4 moet zo snel mogelijk voor de beste kwaliteit van de spijsvertering worden afgerond. </li><li> Opmerking: Het hart kan rechtstreeks op de canule reeds aan de Langendorff Apparaten met stromend perfusie buffer worden opgehangen. Echter, opknoping het hart op een canule aan een kleine spuit perfusiebuffer onder een dissectie microscoop werd gevonden het meest succesvol zijn. Hierdoor kan een kleine hoeveelheid van de perfusie buffer te worden geduwd door, kijken voor clearing van kransslagaders en het waarborgen van het hart goed is aangesloten op de canule. De canule wordt vervolgens opgehangen aan de Langendorff perfusie met stromend buffer. </li><li> Perfusehet hart met Ca2 + vrij perfusie buffer bij een stroomsnelheid van 3 ml / min voor 2-3 minuten. </li><li> Schakel over naar de spijsvertering buffer enzym en perfuse voor 7-10 min, zal het hart zachter en lichter van kleur worden. </li><li> Opmerking: Digestion kan worden ingesteld op basis van enzymactiviteit en grootte van het hart. </li><li> Zodra hart is tastbaar slappe, verwijder het hart van de canule en plaats in een steriele p60 schotel met buffer A (Ca 2 + gratis transfer buffer). </li><li> Verwijder atria en grote vaten. Verwijder rechterventrikel indien gewenst. Met forceps, scheid de hartkamer in kleine stukjes. Pipetteer meerdere malen met een steriele 5 ml pipet overdracht verder verspreiden cellen. </li><li> Filter de celsuspensie in een 50 ml conische buis door een 250 um nylon mesh filter. </li><li> Om de schorsing op pellet voor ongeveer 10 minuten. </li><li> Breng de pellet in de 0,06 mM Ca 2 +-oplossing. Laat cellen tot pellet gedurende 10 minuten. Gezonde cellen zullen pellet, terwijl de meeste dode cellen zal drijven. </li&gt; <li> Zuig het supernatant, en breng de pellet aan de 0,24 mM Ca 2 +-oplossing. </li><li> Herhaal 10 min incubatie, aspiratie en overgedragen en de overige twee Ca2 + oplossingen tot cellen in 1,2 mM oplossing. Op dit punt zou een meerderheid van de cellen staafvormige myocyten. </li></ol> 5 Meten en calciumhuishouding Transients <ol><li> Opmerking: Zowel contractiliteit en calcium transiënten kunnen gelijktijdig worden gemeten. </li><li> Bereid Fura-2:00 oplossing suspenderen in watervrij DMSO tot een concentratie van 1 ug / ul. Fura-2:00 oplossing kan worden bewaard in een exsiccator bij -20 ° C. </li><li> Belasting 1 ml van zwevende cellen met 1 pl Fura-02:00. Laat cellen om te zitten in het donker 10 min daarna aspireren supernatant. Tweemaal spoelen met Ca2 + Tyrode&#39;s oplossing, waardoor cellen pellet in het donker gedurende 10 min tussen wasbeurten. </li><li> Plaats een glas dekglaasje in een stadium inzetstuk dat verwarmd pe toestaatrfusion / aspiratie en elektrode pacing met een myocyte veld stimulator. Plaats stadium insert op omgekeerde microscoop ingesteld voor fluorescentie meting, het toevoegen van een druppel olie op de lens als het gebruiken van een olie-immersie objectief. </li><li> Opgezet verwarmd zwaartekracht perfusie met 1,2 mM Ca 2 + Tyrodes oplossing dus oplossing op het podium bereikt 37 ° C. Bevestig streven naar vacuüm. Bevestig elektroden. </li><li> Zet de microscoop systeem, en open de ratiometrische fluorescentie en mobiele dimensionering data-acquisitie software. </li><li> Voeg een paar druppels Fura-02:00 beladen cellen het stadium insert, tijdelijk blokkeren perfusie om gezonde cellen bezinken. </li><li> Gebruik 40X objectief gewenste cel te lokaliseren. Een gezonde cel zou moeten zijn staafvormige en niet spontaan samentrekkende. Het moet zichtbaar en uniform contract wanneer cel wordt gestimuleerd met 5-20 V. </li><li> Opmerking: Fysiologische analyse vereist een hoge kwaliteit vertering. Het is mogelijk om cellen die er gezond uitzien, maar niet per jaar hebben<html> ce goed voor fysiologische analyse. Spijsvertering protocol kan verfijning nodig om hoge kwaliteit, gezond myocytes krijgen. Bovendien kunnen mutante of zieke harten aanpassingen aan het protocol vereist. </li><li> Adjust lensrotatie en diafragma veranderen zodat gewenste cel wordt horizontaal opgesteld op het scherm en de achtergrond niet zichtbaar is. </li><li> Lijn edge detectie bars aan elk uiteinde van myocyte en pas drempel. Lijn sarcomeer detectie op een deel van de cel met uniforme sarcomeren. Hoe langer je kunt deze bar te maken, des te nauwkeuriger het wiskundige model van de sarcomeer lengte te zijn, zolang het niet op twee populaties van sarcomeren. </li><li> Pace cellen op 2 Hz en 5-20 V voor 10-15 seconden voordat de opname. </li><li> Record tracing. Omgevingslicht moet worden geminimaliseerd voor de beste calcium voorbijgaande opname. </li></ol> 6 Analyse <ol><li> Analyseer sporen met behulp ratiometrisch fluorescentie en cel dimensionering data-acquisitie software. </li></ol>titel &quot;&gt; 7. Verdere studies <ol><li> Dit protocol geeft overmaat cellen die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van andere experimenten inclusief: fixatie en immunokleuring evaluatie direct drugseffecten korte termijn cultuur en atomic force microscopie. </li></ol>

<ol><li>Babick, A. P., Dhalla, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Subcellular+Remodeling+in+Cardiac+Dysfunction+due+to+Congestive+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Principles+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Role of Subcellular Remodeling in Cardiac Dysfunction due to Congestive Heart Failure.</a> Medical Principles and Practice. 16, 81-89 (2007).</li>
<li>Nogami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje-Related+Arrhythmias+Part+I%3A+Monomorphic+Ventricular+Tachycardias%5BTitle%5D)+AND+%22Pacing+and+Clinical+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Purkinje-Related Arrhythmias Part I: Monomorphic Ventricular Tachycardias.</a> Pacing and Clinical Electrophysiology. 34, 624-650 (2011).</li>
<li>Clancy, R. M., Kapur, R. P., Molad, Y., Askanase, A. D., Buyon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohitologic+Evidence+Supports+Apoptosis%2C+IgG+Deposition%2C+and+Novel+Macrophage%2FFibroblast+Crosstalk+in+the+Pathologic+Cascade+Leading+to+Congenital+Heart+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Immunohitologic Evidence Supports Apoptosis, IgG Deposition, and Novel Macrophage/Fibroblast Crosstalk in the Pathologic Cascade Leading to Congenital Heart Block.</a> Arthritis and Rheumatism. 50, 173-182 (2004).</li>
<li>Splawski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaV1.2+Calcium+Channel+Dysfunction+Causes+a+Multisystem+Disorder+Including+Arrhythmia+and+Autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CaV1.2 Calcium Channel Dysfunction Causes a Multisystem Disorder Including Arrhythmia and Autism.</a> Cell. 119, 19-31 (2004).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+Metabolism+of+Intact+Muscle+Cells+Isolated+from+Adult+Rat+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Morphology and Metabolism of Intact Muscle Cells Isolated from Adult Rat Heart.</a> Circulation Research. 26, 679-687 (1970).</li>
<li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luteolin+Inhibits+Apoptosis+and+Improves+Cardiomyocyte+Contractile+Function+through+the+PI3K%2FAkt+pathway+in+Simulated+Ischemia%2FReperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Luteolin Inhibits Apoptosis and Improves Cardiomyocyte Contractile Function through the PI3K/Akt pathway in Simulated Ischemia/Reperfusion.</a> Pharmacology. 88, 149-158 (2011).</li>
<li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+Regulation+of+Murin+Cardiomyocyte+Contractility+by+Nanomolar+%28-%29-Epigallocatechin-3-Gallate+the+Major+Green+Tea+Catechin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Coordinated Regulation of Murin Cardiomyocyte Contractility by Nanomolar (-)-Epigallocatechin-3-Gallate the Major Green Tea Catechin.</a> Molecular Pharmacology. 82, 993-1000 (2012).</li>
<li>Claycomb, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HL-1+cells%3A+A+cardiac+muscle+cell+line+that+contracts+and+retains+phenotypic+characteristics+of+the+adult+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">HL-1 cells: A cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 95, 2979-2984 (1998).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Genetic+Manipulation+of+Adult+Cardiac+Myocytes+for+Confocal+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging.</a> J Vis Exp. (31), e1433(2009).</li>
<li>Vainio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neronostatin%2C+a+Novel+Peptide+Encoded+by+Somatostatin+Gene%2C+Regulates+Cardiac+Contractile+Function+and+Cardiomyocytes+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neronostatin, a Novel Peptide Encoded by Somatostatin Gene, Regulates Cardiac Contractile Function and Cardiomyocytes Survival.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 4572-4580 (2012).</li>
<li>Park, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mechanisms+for+caspase+inhibition+protecting+cardiac+function+wth+chronic+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Novel mechanisms for caspase inhibition protecting cardiac function wth chronic pressure overload.</a> Basic Research in Cardiology. , 108(2013).</li>
<li>Novaes, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Trypanosoma+cruzi+infection+on+myocardial+morphology%2C+single+cardiomyocyte+contractile+function+and+exercise+tolerance+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Effects of Trypanosoma cruzi infection on myocardial morphology, single cardiomyocyte contractile function and exercise tolerance in rats.</a> International Journal of Experimental Pathology. 92, 299-307 (2011).</li>
<li>Weltman, N. Y., Wang, D., Redetzke, R. A., Gerdes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longstanding+Hyperthyroidism+is+Associated+with+Normal+or+Enhanced+Intrinsic+Cardiomyocyte+Function+despite+Decline+in+Global+Cardiac+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Longstanding Hyperthyroidism is Associated with Normal or Enhanced Intrinsic Cardiomyocyte Function despite Decline in Global Cardiac Function.</a> PLoS One. 7, e46655(2012).</li>
<li>Papanicolaou, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+heart+function+and+maintained+response+to+cardiac+stresses+in+a+genetic+model+of+cardiomyocyte-targeted+deficiency+of+cyclooxygenase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Preserved heart function and maintained response to cardiac stresses in a genetic model of cardiomyocyte-targeted deficiency of cyclooxygenase-2.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49, 196-209 (2010).</li>
<li>Despa, S., Lingrel, J. B., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2FK%2B-ATPase+a2-isoform+preferntially+modulates+Ca2%2B+transients+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+release+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Na+/K+-ATPase a2-isoform preferntially modulates Ca2+ transients and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in cardiac myocytes.</a> Cardiovascular Research. 95, 480-486 (2012).</li>
<li>Touchberry, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF23+is+a+novel+regulator+of+intracellular+calcium+and+cardiac+contractility+in+addition+to+cardiac+hypertophy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FGF23 is a novel regulator of intracellular calcium and cardiac contractility in addition to cardiac hypertophy.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. , (2013).</li>
<li>Helmes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titin+Determines+the+Frank-Starling+Relation+in+Early+Diastole%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Titin Determines the Frank-Starling Relation in Early Diastole.</a> The Journal of General Physiology. 121, 97-110 (2003).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 940-950 (2011).</li>
<li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. (58), e3302(2011).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Isolatie van kwaliteit hartspiercellen vereist een zekere mate van oefening en optimalisatie. Dit protocol bevat de belangrijkste stappen die sterk kan invloed hebben op de uitkomst van de spijsvertering. Deze moeten zorgvuldig worden overwogen bij het uitvoeren en oplossen van problemen met het protocol. De tijd vanaf verwijdering van het hart infusen en perfusie moet worden geminimaliseerd, bij voorkeur minder dan vijf minuten. Spoelen van het hart onmiddellijk in ijskoud perfusie buffer na het verwijderen van de muis...

Cardiomyocyten zorgen voor de samentrekkingskracht van het hart. Elke myocyt bevat georganiseerde cytoskelet- en contractiele elementen die essentieel zijn voor samentrekking. Het hart bevat niet alleen cardiomyocyten, maar ook fibroblasten, bindweefsel en gemodificeerde myocyten zoals Purkinje-vezels. Veranderingen in een of meer van deze celtypen kunnen worden waargenomen bij hartfalen, waardoor het moeilijk wordt om de uiteindelijke oorzaak van hartdisfunctie te bepalen. Verminderde ventrikelcontractiliteit van een falend hart wordt voorafgegaan door verschillende graden van bouw van bindweefsel en hypertrofie en disfunctie van de cardiomyocyten1. Aritmieën kunnen worden veroorzaakt door disfunctie in de geleidende cellen2, fibrose die de hartgeleiding onderbreekt3 of veranderingen in de expressie van ionenkanalen in cardiomyocyten1,4. Inderdaad, deze problemen bestaan vaak op een ingewikkelde manier naast elkaar.
Het isoleren en bestuderen van cardiomyocyten maakt het mogelijk om contractiele en elektrische disfunctie van individuele myocyten te onderzoeken in de context van de algehele hartfunctie. Technieken om individuele hartmyocyten te isoleren werden meer dan 40 jaar geleden ontwikkeld in een poging om de fysiologie van deze 'workhorse'-cel van het hart beter te bestuderen. Isolatietechnieken zijn verbeterd om de opbrengst en kwaliteit van cellen te verhogen, met de cruciale ontwikkeling van coronaire perfusie via canuletie van de aorta, voor het eerst uitgevoerd in 19705. Dit artikel beschrijft cardiomyocyte-isolatie gevolgd door meting van contractiliteit en calciumtransienten met behulp van ratiometrische fluorescentie en software voor gegevensverwerving voor celdimensionering. In zowel genetische als omgevingsmodellen van hartaandoeningen biedt het gebruik van dit protocol sleutelinformatie over celcontractiliteit, sarcomeercontractiliteit en relaxatie, calciumtransienten en cytoskeletdisrupsie. Dit systeem wordt vaak gebruikt om het effect van geneesmiddelen op geïsoleerde cardiomyocyten te testen6,7. We gebruiken het systeem om contractiliteit en calciumtransienten van cardiomyocyten te vergelijken tussen wildtype muizen en muizen met een mutatie die leidt tot dilateerde cardiomyopathie.
Het bestuderen van individuele hartmyocyten heeft tal van voordelen boven andere gebruikelijke methoden om hartanatomie en fysiologie te bestuderen. Echocardiografie en elektrocardiografie geven informatie over de contractiele functie en elektrische geleiding van het hart als geheel. Geen van deze methoden verklaart de oorzaak of aard van de disfunctie onder het niveau van het hele orgaan. Het meten van contractiliteit van individuele cardiomyocyten met behulp van randdetectie en sarcomeerlengte-algoritmen kan aantonen dat veranderingen binnen de contractiele cel van het hart aanwezig zijn binnen globale hartdisfunctie. Het meten van calciumtransienten toont de invloed van veranderingen in ionenstroom op cellulair niveau op contractiele disfunctie of aritmieën aan.
Naast het aanvullen van studies van het hele orgaan, biedt dit protocol cellen die gemakkelijk kunnen worden gekleurd voor subcellulaire componenten. Het is mogelijk om cytoskeletaal veranderingen te zien door weefselsecties van het hele hart te kleuren; echter, men kan alleen een dwarsdoorsnede van cellen visualiseren. Een hele cardiomyocyte is dikker dan de typische weefselsectie, en gezien de rangschikking en lengte van de cardiomyocyten, is het moeilijk om hele cellen in een enkele sectie te zien. Geïsoleerde cardiomyocyten kunnen onmiddellijk worden gefixeerd en gekleurd voor een verscheidenheid aan cytoskeletal elementen en ionenkanalen. Confocale beelden kunnen worden samengesteld tot z-stacks van de volledige dikte van de cel. Bovendien stelt het kleuren van geïsoleerde hartmyocyten het mogelijk om componenten te kleuren die onmogelijk te visualiseren zijn in secties, zoals de membraaninvaginaties die bekend staan als t-tubuli.
Er bestaan gekweekte cellijnen van hartmyocyten, waarvan sommige vergelijkbare transcriptieprofielen en fenotypische kenmerken hebben als hartmyocyten. Sommige, zoals de HL-1-cellijn, behouden zelfs enige sarcomeerorganisatie en rudimentaire contractiele capaciteit8. Ondanks deze eigenschappen missen gekweekte cellen de 'box car'-vorm en t-tubulusstructuur van cardiomyocyten en hebben ze minder sarcomeerorganisatie. Deze componenten zijn essentieel voor de functie van cardiomyocyten in vivo. Bovendien staat het gebruik van gekweekte cellen genetische manipulatie toe, maar niet in vivo fysiologische manipulatie. Geïsoleerde cardiomyocyten behouden hun cellulaire organisatie lang genoeg om te bestuderen, maar kunnen nog steeds gemakkelijk worden geïmager en zelfs worden getransduceerd9.
Geïsoleerde cardiomyocyten zijn uiterst veelzijdig en bieden een substraat om cellen uit verschillende experimentele omstandigheden identiek te analyseren. Isolatie en fysiologische analyse van myocyten zijn door talloze laboratoria gebruikt voor een verscheidenheid aan experimenten, waaronder het bestuderen van het effect van geneesmiddelen6,7 of kleine moleculen10, omgevingsstressors11, infectie12, ziekte13 of genetische mutatie14,15 op contractiliteit en/of calciumtransienten en het bestuderen van de regulatie van contractiliteit en calciumvrijlating binnen een cardiomyocyte15-17. Met toepassing van een van deze stressoren, zouden veranderingen in hartfunctie kunnen worden veroorzaakt door een willekeurige combinatie van veranderingen in de cardiomyocyten zelf en veranderingen in de omringende omgeving van het hart, zoals littekens, veranderingen in geleidbaarheid of veranderingen in de extracellulaire matrix. Dit is een ideaal protocol voor het beantwoorden van onderzoeksvragen over individuele myocytstructuur en -functie in de context van hartfalen van elke oorzaak.
Hoewel het talloze voordelen heeft ten opzichte van andere technieken, is fysiologische analyse van geïsoleerde cardiomyocyten niet ideaal voor elke onderzoeksvraag. Isolatie is een terminale procedure, dus cardiomyocyten kunnen alleen op één moment in het leven van de muis worden beoordeeld. Dit kan gedeeltelijk worden overwonnen door gebruik te maken van cohorten en het opofferen van individuele muizen tijdens het verloop van de ontwikkel

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>EM Science</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot;2H2O</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanedione-monoxime (BDM)</td><td>Sigma</td><td>B-0753</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T-0625</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A-7030</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1-088-823</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1-088-882</td><td></td></tr><tr><td>Protease XIV</td><td>Sigma</td><td>P-5147</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>401586D</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>Butler Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Teflabs</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>DMSO &ndash; anhydrous</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>IonOptix cell pacing and fluorescent analysis system</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 &mu;m nylon mesh filter</td><td>Sefar America</td><td>Lab Pak 03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>23 G Luer-stub adaptor</td><td>Becton Dickinson</td><td>1482619E</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 tubing</td><td>Becton Dickinson</td><td>427410</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en fysiologische analyse van de muis cardiomyocyten

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocyten, de werkpaardcel van het hart, bevatten uiterst georganiseerde cytoskelet- en contractiele elementen die de contractiekracht genereren die wordt gebruikt om bloed te pompen. Individuele cardiomyocyten werden voor het eerst meer dan 40 jaar geleden geïsoleerd om de fysiologie en structuur van hartspier beter te bestuderen. Technieken zijn snel verbeterd om enzymatische spijsvertering via coronaire perfusie te omvatten. Meer recentelijk heeft het analyseren van de contractiliteit en calciumflux van geïsoleerde myocyten een essentieel hulpmiddel opgeleverd in de cellulaire en subcellulaire analyse van hartfalen. Echocardiografie en EKG's geven alleen informatie over het hart op orgaanniveau. Cardiomyocytcellen kweeksystemen bestaan, maar cellen ontbreken fysiologisch essentiële structuren zoals georganiseerde sarcomeren en t-tubuli die nodig zijn voor myocytfunctie in het hart. In het hier gepresenteerde protocol worden cardiomyocyten geïsoleerd via Langendorff-perfusie. Het hart wordt uit de muis verwijderd, gemonteerd via de aorta op een canule, geperfundeerd met verteringsenzymen en cellen worden blootgesteld aan toenemende calciumconcentraties. Rand- en sarcomeerdetectiesoftware wordt gebruikt om de contractiliteit te analyseren, en een calciumbindende fluorescerende kleurstof wordt gebruikt om calciumtransienten van elektrisch gestimuleerde cardiomyocyten te visualiseren; waardoor het begrip van de rol die cellulaire veranderingen spelen in hartdisfunctie toeneemt. Traditioneel gebruikt om de effecten van geneesmiddelen op cardiomyocyten te testen, gebruiken we dit systeem om myocyten van WT-muizen en muizen met een mutatie die dilateerde cardiomyopathie veroorzaakt te vergelijken. Dit protocol is uniek in zijn vergelijking van levende cellen van muizen met bekende hartfunctie en bekende genetica. Veel experimentele omstandigheden worden betrouwbaar vergeleken, inclusief genetische of omgevingsmanipulatie, infectie, medicamenteuze behandeling en meer. Naast fysiologische gegevens kunnen geïsoleerde cardiomyocyten gemakkelijk worden gefixeerd en gekleurd voor cytoskeletal elementen. Het isoleren van cardiomyocyten via perfusie is een uiterst veelzijdige methode, nuttig bij het bestuderen van cellulaire veranderingen die gepaard gaan met of leiden tot hartfalen in een verscheidenheid van experimentele omstandigheden.

Wanneer de contractiliteit en voorbijgaande traces verzameld (figuur 2), zijn gegevens gemakkelijk geanalyseerd met de juiste software. De gehele tracing of delen daarvan kunnen worden gemiddeld (figuur 3). Contractiliteit kunnen worden geanalyseerd op verschillende manieren. Systolische functie, kan men de omvang van de contractie met fractionele verkorting of snelheid van contractie tijd tot piek verkorten en contractie snelheid beoordelen. Diastolische functie kan eveneens worden gea...

Individuele cardiomyocyten van wilde type en mutante muizen kunnen uit het hart worden geïsoleerd om hun contractiliteit en calciumtransienten te bestuderen. Dit maakt het mogelijk om de bijdrage van cellulaire disfunctie aan hartdisfunctie, van welke oorzaak dan ook, te karakteriseren.

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

De doelen van dit protocol zijn het gebruik van LOR-perfusie om hartspiercellen te isoleren uit volwassen muizenharten met een bekende genetica en het analyseren van de contractiliteit en calciumtransiënten van deze myocyten. Na een injectie met heparine wordt het hart verwijderd uit een geanestheseerde muis. Het hart wordt snel via de aorta gemonteerd op een canule die is verbonden met een spuit met perfusiebuffer.De aorta is vastgezet. Een hechtdraad en buffer worden langzaam geperfuseerd om de coronaire arteriën te spoelen. De canule wordt vervolgens gemonteerd op een LOR-apparaat met een stromende perfusiebuffer.Het hart wordt verteerd met een calciumvrije oplossing van collagenase en protease totdat het voelbaar zacht is. De linker ventrikel wordt in de calciumvrije buffer geplaatst en gedispergeerd met een pincet en voorzichtig pipetteren. Nadat de oplossing door een gaas is gefiltreerd, worden de cellen geleidelijk blootgesteld aan hogere calciumconcentraties om dode cellen te verwijderen en ervoor te zorgen dat de myocyten calciumtolerant zijn.Gezonde cellen zijn staafvormig, terwijl dode cellen deze vorm missen. De myocyten worden vervolgens geladen met RA two A, een radiometrische calciumbindende kleurstof, en op de tafel van de microscoop geplaatst. Voor de analyse worden de cellen elektrisch gepaced terwijl de contractiliteit wordt gemeten aan de hand van de sarcomeerlengte en edge detection, en calciumtransiënten worden gemeten door de spectrale verschuiving van de met RA two geladen cellen te analyseren.Gedilateerde cardiomyopathie wordt veroorzaakt door een verscheidenheid aan mutaties. Het begrijpen van het mechanisme achter deze hartaandoening kan echter moeilijk zijn. Het isoleren van cardiomyocyten stelt ons in staat om de contractiliteit en calciumtransiënten van de Contractal cell of the heart, Calcium Free, And 1.2 millimolar te analyseren.Calciumtyro-oplossingen kunnen vooraf worden bereid op de dag van de isolatie. Bereid de calciumvrije perfusiebuffer voor enzymatische digestie, de digestiebuffer en de transferbuffers A en B volgens het beschreven protocol. Filtreer alle oplossingen voor gebruik door een 0,2 micron filter.Maak transferbuffers één tot en met vier met toenemende calciumconcentraties door buffers A en B te mengen volgens het beschreven protocol. Stel de stroomsnelheid van een LOR-apparaat in op drie milliliter per minuut en stel de temperatuur van het circulerende waterbad zo in dat de uitstroom uit de canulepunt ongeveer 37 °C is. Laat gedurende 15 minuten 70% ethanol door het systeem lopen, gevolgd door honderd milliliter water, waarbij u er zeker van bent dat alle luchtbellen uit het systeem zijn verwijderd.Maak vóór uw eerste isolatie een canule door een kort stuk PE 50-slang aan de punt van een 20 3G luer-stubadapter te bevestigen en verhit de punt van de slang om een kleine lip te vormen. Bevestig de canule aan een kleine luer-lockspuit gevuld met perfusiebuffer. Zorg ervoor dat de canule volledig met buffer is gevuld.Injecteer een muis met 200 heparin via een IP-injectie. Begin met het laten lopen van profusiebuffer door het L endorf, zodat dit volledig door het systeem is gestroomd voordat het hart wordt bevestigd. Anestheseer de muis na vijf minuten met isofluorine.Zorg ervoor dat de muis volledig is geanestheseerd door middel van een stevige bilaterale knijptest bij de tenen. Open de borstkas door onder het borstbeen en langs beide zijden van de ribbenkast te snijden; exciseer het hart snel, waarbij u er zorg voor draagt dat zoveel mogelijk van de aorta aan het hart bevestigd blijft. Plaats het hart onmiddellijk in ijs.Koude perfusiebuffer, werk zo snel mogelijk onder een dissectiemicroscoop om eventueel extra weefsel te verwijderen. Werk voorzichtig om overtollig vet te verwijderen zonder de onderliggende aorta te beschadigen. Trim de aorta tot direct onder de eerste vertakkingen.Grijp met twee paren fijne pincetten voorzichtig de rand van de aorta vast en trek deze zachtjes over de punt van de canule. Zorg ervoor dat de punt van de canule niet door de aortaklep in de linker ventrikel gaat. Zet de aorta vast met een kleine lus van 5.0 hechtmateriaal.Duw voorzichtig een kleine hoeveelheid perfusiebuffer door de canule en let erop dat de kransslagaders bloedvrij worden. Verwijder de canule uit de spuit en bevestig deze aan het L endorf-apparaat met stromende perfusiebuffer. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd.Laat de perfusiebuffer twee tot drie minuten door het hart stromen. Perfuseer tot de vloeistof van bloedig naar helder gaat; schakel vervolgens de stroom over naar de digestiebuffer en digereer gedurende zeven tot 10 minuten. Nadat de buffer de longen heeft gevuld, kan de flow worden gerecycled zodra het hart palpabel is.Slaap, verwijder uit de canule en plaats in een P 60 schaal met Buffer a. Verwijder de atria, grote vaten en de rechterventrikel en breng deze over naar een tweede schaal met buffer a. Gebruik hiervoor een pincet.Scheid de linker ventrikel voorzichtig in kleine stukjes. Als het hart voldoende is verteerd, zou het weefsel gemakkelijk moeten scheiden. Pipetteer voorzichtig meerdere keren met een steriele transferpipette van 5 ml om de cellen verder te verspreiden. Gebruik een steriele transferpipette om de oplossing met cellen en weefsel door een nylonmazig filter van 250 micron in een conische buis van 50 ml over te brengen.Laat de cellen ongeveer 10 minuten bezinken. Levende cellen zullen naar de bodem zakken in het pellet en dode cellen zullen drijven. Breng het pellet over naar de 0,06 millimolair calcium transferbuffer.Laat dit 10 minuten staan, aspireer het supernatant dat de dode cellen bevat en breng de pellet over naar de 0,24 millimolair calciumoplossing. Herhaal het pelleten, aspireren en overbrengen via oplossingen met een toenemende calciumconcentratie totdat de cellen zijn gepellet in de 1,2 millimolair calcium transferbuffer. Op dit punt zal de pellet veel gezonde staafvormige cellen bevatten die niet spontaan contraheren om cellen met minder of geen kleurstof te laden.Overbreng 1 mL van de resupendeerde cellen naar een Eppendorf-buisje van 1 mL. Voeg 1 µL van 1 mM fira two in watervrije DMSO toe. Meng door het buisje voorzichtig te keren.Laat de cellen 15 tot 20 minuten in het donker bezinken. Nadat de cellen zijn neergeslagen, wordt er gewassen door het supernatant af te zuigen en 1,2 millimolair calciumtyro-oplossing toe te voegen. Meng en laat de cellen nogmaals vijf tot 10 minuten bezinken. Herhaal vervolgens de wasstap.Stel de omgekeerde microscoop in voor gegevensverzameling. Plaats eerst een glazen dekglas op een objecttaal-inzetstuk dat is ontworpen voor perfusie-aspiratie en voor elektrische pacing van cellen. Bij gebruik van een olie-objectief wordt een druppel olie op de 40 x lens geplaatst, waarna het inzetstuk op de microscoop wordt geplaatst.Bevestig de elektroden. Stel een door zwaartekracht aangedreven, verwarmde perfusie in van 1,2 millimolair calcium tyro-oplossing en sluit de aspiratie aan op het vacuüm. Zet de microscoop en het celpacer-systeem aan.Open de Ion Wizard-software. Plaats een paar druppels van enkele of twee geladen cellen op het objectglas terwijl de perfusiestroom wordt geblokkeerd. Herstel de perfusie om gezonde cellen te laten bezinken; hierbij zullen veel van de resterende dode cellen worden weggespoeld.Gebruik het oculair om een gezonde staafvormige cel te lokaliseren die spontaan samentrekt bij een stimulatie van 5 tot 20 volt; cellen die reeds samentrekken moeten worden vermeden vanwege membraanlekkage. Schakel de visuele weergave over naar de camera. Pas de rotatie van de lens aan zodat de cel in het venster zichtbaar is.Pas het diafragma aan zodat het grootste deel van de achtergrond wordt verwijderd. Plaats de marker voor de sarcomerenmeting over een gebied van de cel met uniforme sarcomeren. Pas indien nodig de grootte van het kader aan om er zeker van te zijn dat de marker, indien gewenst, geen verschillende populaties overlapt.Lijn ook de balken voor randdetectie uit. Begin met het stimuleren (pacen) van de cellen 10 tot 15 seconden voordat het experiment start. Start de opname.Analyseer de traceringen van de sarcomere verkorting en de URA twee-ratio met de Ion Wizard-software. Mogelijke vergelijkingen tussen wild-type en knockout cardiomyocyten voor contractiliteitsanalyse omvatten de fractionele verkorting, de tijd tot maximale verkorting en de tijd tot 50% relaxatie, evenals de basislijn, de piek, de tijd tot de piek en de tijd tot 50% van de basislijn voor de twee-ratio's om de calciumflux te beoordelen. De cellen die met dit protocol zijn geproduceerd, zijn ideaal voor vele andere experimenten en procedures, waaronder kleuring van subcellulaire componenten en kortstondige kweek.Nu u deze video heeft bekeken, zou u in staat moeten zijn om cardiomyocyten te isoleren uit wild-type en knockout-muizen en om de contractiliteit en calciumtransiënten van deze cellen te analyseren. Veel succes met uw experiment.

isolation-and-physiological-analysis-of-mouse-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Primaire muis cardiomyocytkweken is een van de cruciale instrumenten voor het onderzoek myofibrillar inrichting en functie. Het volgende protocol beschrijft de isolatie en de cultuur van primaire cardiomyocyten van neonatale muis harten. De resulterende cardiomyocytkweken kunnen vervolgens worden gebruikt voor een verscheidenheid van biomechanische, biochemische en celbiologische assays.

Isolatie en cultuur van de Neonatale Mouse Cardiomyocytes

Hier beschrijven we de isolatie van volwassen muis cardiomyoctyes met behulp van een Langendorff perfusie-systeem. De resulterende cellen Ca2 +-tolerante, elektrisch rustende en kan gekweekt en getransfecteerd met adeno-of lentivirussen om genexpressie te manipuleren. Hun functionaliteit kan ook worden geanalyseerd met behulp van het MMSYS systeem en patch clamp technieken.

Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes

We beschrijven een betrouwbare methode voor het isoleren van volwassen muis hartspiercellen. Dit protocol geeft een consistent resultaat voor de cultuur van functionele volwassen hartspiercellen uit verschillende genetisch gemodificeerde muizen.

Isolatie en cultuur van de volwassen muis Cardiomyocytes voor mobiele Signalering en<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrofie

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze methode voor de reproduceerbare isolatie en langdurige kweek van volwassen muis-cardiomyocyten met een hoge opbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid.

Isolatie, Cultuur en Transductie van Adult Mouse Cardiomyocytes

Het algemene doel van dit artikel is op de standaardisering van het protocol voor de isolatie, karakterisering en differentiatie van cardiale stamcellen (CSCs) vanuit het hart van de volwassen muis. Hier beschrijven we een dichtheid kleurovergang centrifugeren methode om te isoleren lymfkliertest CSCs en uitgewerkte methoden voor CSC cultuur, proliferatie en differentiatie in cardiomyocytes.

Isolatie, karakterisering en differentiatie van cardiale stamcellen van het hart volwassen muis

Dit protocol wordt gebruikt om enkelvoudige atriale cardiomyocyten van het volwassen muis hart te isoleren met behulp van een Brok digestie benadering. Deze aanpak wordt gebruikt om te isoleren van rechts of links atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van Atrium myocyten elektrofysiologie in Patch-clamp studies.

Isolatie van atriale Myocyten van volwassen muizen

Gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van menselijke en dierlijke ventriculaire cardiomyocyten van vibratome-cut myocardische plakjes. Hoge opbrengsten van calciumtolerante cellen (tot 200 cellen/mg) kunnen worden verkregen uit kleine hoeveelheden weefsel (&lt;50 mg). Het protocol is van toepassing op myocardium dat tot 36 uur aan koude ischemie wordt blootgesteld.

Isolatie van human ventriculaire cardiomyocyten van Vibratome-Cut Myocardial Slices

We ontwikkelden een simple-methode voor het isoleren van hoogwaardige individuele muishartcellen door de antegrade perfusietechniek. Deze methode is Langendorff-vrij en nuttig voor het isoleren van ventriculaire en atriale myocyten of interstitiële cellen, zoals hartfibroseblasten of voorlopers.

Een Antegrade Perfusie methode voor Cardiomyocyt isolatie van muizen

Muismodellen maken het mogelijk om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen. Voor dit doel zijn cardiomyocyten van hoge kwaliteit nodig om patchklemmetingen uit te voeren. Hier wordt een methode beschreven om murine atriale en ventriculaire myocyten te isoleren via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, die gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en L-type calciumstroom mogelijk maakt.

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom

De gouden standaard in de cardiologie voor cellulaire en moleculaire functionele experimenten zijn cardiomyocyten. Dit artikel beschrijft aanpassingen aan de niet-Langendorff-techniek om cardiomyocyten bij muizen te isoleren.

Een eenvoudige en effectieve methode om cardiomyocyten van muizen consequent te isoleren

Leer de isolatie van cardiomyocyten uit muizenharten met LOR-perfusie voor fysiologische analyse. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek naar contractiliteit en calciumtransiënten mogelijk.

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Meer video's verkennen