Verzameling en analyse van Arabidopsis Bastweefsel wondvocht De EDTA-methode vergemakkelijkt
23 oktober 2013
Kennis van de samenstelling van het floëem sap en het mechanisme van de lading en langeafstandsvervoer is essentieel voor het begrijpen van de lange afstand signalering bij ontwikkeling en stress / pathogeen respons planten en assimileren transport. Dit manuscript beschrijft de verzameling van floëem exsudaten gebruik van de EDTA-gefaciliteerd methode.
Het algemene doel van deze procedure is om flom exudaat te verzamelen van Arabidopsis of andere planten om de inhoud ervan te analyseren of de aanwezigheid van verbindingen in de flom stroom te bevestigen. Dit wordt bereikt door eerst de kroonblaadje te snijden en in incubatie te brengen in kalium EDTA om verzegeling van het zee-element te voorkomen. De tweede stap is om het kroonblad grondig te wassen om alle resterende EDTA te verwijderen die de daaropvolgende analyse kan verstoren en ook cellen kan beschadigen tijdens langdurige blootstelling.
Vervolgens worden de stromende EM exsudaten verzameld in water. De laatste stap is het voorbereiden van monsters voor verdere analyse door L-C-M-S-G-C-M-S-gel, elektroforese en dunnelaagchromatografie. Uiteindelijk kan de EDTA-gefaciliteerde phem-exudatie worden gebruikt om phem-inhouden zoals metabolieten en lipiden, eiwitten of RNA's te analyseren en te bevestigen.
Planten kunnen niet ontsnappen aan ongunstige omstandigheden. Als gevolg hiervan hebben ze zeer efficiënte en snelle systemen nodig om omgevingssignalen door de planten heen te verzenden en te reageren door de ontwikkeling te veranderen. Een van deze signaalroutes is de plantenstroom, die vrij complex is om de samenstelling ervan te begrijpen.
We gebruiken de EDTA-gefaciliteerde stromingssedatie voor het verzamelen en analyseren van stroominhouden. Het werd oorspronkelijk ontwikkeld in Perilla door King en kan gemakkelijk worden aangepast voor andere soorten. Het demonstreren van de procedure zal Elena en ik zijn, beide bachelorstudenten uit mijn lab. Voorafgaand aan het starten van deze procedure.
Kweek Arabidopsis planten gedurende vier tot zes weken in groeikamers met een 12-urige fotoperiode op de dag van de verzameling. Verdun eerder bereide 100 millimolar kalium EDTA oplossing met water tot een eindconcentratie van 20 millimolar. Vul vervolgens twee glazen schalen met een diameter van zeven tot 15 centimeter voor de helft met de 20 millimolar kalium EDTA oplossing.
Wanneer u klaar bent, vul 1,7 milliliter reactiebuisjes met 1,4 milliliter van de 20 millimolar kalium EDTA oplossing. Vul vervolgens een gelijk aantal reactiebuisjes met 1,4 milliliter millipore water. Nadat u de vier tot zes weken oude planten uit de groeikamers hebt gehaald, oogst u de rozetbladeren door ze met een scheermes op de basis van de kroonblaadje dicht bij het midden van de rozet te snijden.
Plaats de bladeren onmiddellijk in de schalen die 20 millimolar kalium EDTA bevatten, met het gesneden uiteinde van de peole ondergedompeld in de oplossing. Zodra 15 bladeren zijn verzameld van drie tot vier planten, stapel ze voorzichtig op elkaar zodat de gesneden kroonbladen op elkaar zijn uitgelijnd. Snijd de basis van de kroonbladen opnieuw en rol de bladeren voorzichtig.
Voer vervolgens de gerolde bladeren voorzichtig in een van de reactiebuisjes met 20 millimolar kalium EDTA in voor exsudaatverzameling. In het donker de bodem van een grote ondiepe schaal met natte papieren handdoeken bekleden. Plaats de houder met de met bladeren gevulde reactiebuisjes in de schaal en plaats deze in een zwarte plastic zak met spleten voor beluchting.
Plaats vervolgens de hele opstelling in een kast voor exsudaatverzameling. In het licht de bodem van een heldere plexiglas container met natte papieren handdoeken bekleden. Plaats de houder met de met bladeren gevulde reactiebuisjes in de container en sluit deze.
Na het verwijderen van de houder uit de container, neem een uur later de bladeren uit de reactiebuisjes. Was de bladeren grondig met gedestilleerd water om alle EDTA te verwijderen. Breng de bladeren onmiddellijk over in de reactiebuisjes met millipore water en plaats ze terug in de bevochtigde containers voor de verzameling van exsudaten na het verwijderen van de houder uit de bevochtigde container.
Vijf tot acht uur later, haal de bladeren uit de buisjes, bevries vervolgens de stroom exsudaten in vloeibaar stikstof en bewaar ze in een min 80 graden Celsius vriezer. Voor verdere analyse op de volgende dag, ontdooi de monsters ter voorbereiding op lipide-analyse. Trek vervolgens twee tot drie monsters en voeg een gelijke hoeveelheid chloroform en methanol toe aan de gecombineerde oplossing.
Vortex de mengsel gedurende enkele seconden. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende vier minuten bij 400 gs. Wanneer u klaar bent, verzamelt u de onderste organische fase in een glazen buis na herhaling van de partitie met de bovenste fase, nog drie keer, droogt u de gecombineerde organische fasen onder een stroom stikstof en dient u in voor dunnelaagchromatografie en LCMS-analyse.
Deze methode maakt het mogelijk om voldoende phem exsudaten te oogsten om phem gelokaliseerde eiwitten te identificeren en de veranderingen in hun niveau als reactie op ontwikkeling of stress. In sommige gevallen willen onderzoekers mogelijk proteaseremmers gebruiken om de afbraak van eiwitten te voorkomen. Zoals hier getoond, zijn eiwitten in zeer lage abundantie, maar hun niveau is hoog genoeg voor volgende proteomics experimenten.
Met behulp van LCMS of voor westerse blot-analyse suggereren bevindingen in cucurbita's dat het snijden van de STAM leidt tot een verstoring van de waterpotentiaalbalans en een daaropvolgende instroom van water en mogelijke contaminanten uit de alast. Echter, verzameling gedurende tijden variërend van één tot acht uur heeft geen invloed op het stromings M eiwitprofiel en samenstelling InOpSys. De hoeveelheid verzamelde eiwitten en het patroon van gevonden eiwitten varieert tussen soorten en behandelingen.
Als gevolg hiervan kunnen eiwitsignalen worden gevisualiseerd, geïdentificeerd en gevolgd. mRNA en microRNA's kunnen ook worden geïdentificeerd in flom exsudaten door deze methode. Echter, behandeling met RNA's-remmer is noodzakelijk om de afbraak van de MR.NA tijdens de verlengde exsudatietijd te voorkomen.
Aangezien de C-elementen geen functionele chloroplasten bevatten, kunnen rubis, kleine of grote subeenheid mRNA's worden gebruikt als negatieve controles, terwijl bekende pH flu m-gelocal
Overzicht
Deze studie beschrijft een methode voor het verzamelen van floëemexsudaten uit planten, specifiek Arabidopsis, met behulp van een EDTA-gefaciliteerde benadering. Inzicht in de samenstelling van het floëemsap is cruciaal voor het begrijpen van plantensignalering en responsen op omgevingsstress.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantbiologie
- Phloeemtransportmechanismen
- Metabolietanalyse
Achtergrond
- Floëmsap speelt een cruciale rol bij signalering over lange afstand in planten.
- Efficiënt transport van nutriënten en signalen is essentieel voor de ontwikkeling van de plant.
- De met EDTA gefaciliteerde methode maakt een effectieve collectie van floëmexudaten mogelijk.
- Inzicht in de samenstelling van het floëm helpt bij het bestuderen van plantenreacties op stress en pathogenen.
Doel van de studie
- Om floëmexudaten van Arabidopsis en andere planten te verzamelen en te analyseren.
- Om de aanwezigheid van metabolieten, eiwitten en RNA's in het floëmsap te bevestigen.
- Om de signaleringsroutes te onderzoeken die betrokken zijn bij plantenreacties op omgevingsfactoren.
Gebruikte methoden
- Incubatie van plantkroonbladen in kalium-EDTA om het afsluiten van de zeefelementen te voorkomen.
- Verzamelen van floëemexudaten in reactiebuisjes voor analyse.
- Gebruik van LC-MS, GC-MS en dunlaagchromatografie voor metabolietanalyse.
- Invriezen en ontdooien van monsters voor verdere analyse van eiwitten en RNA's.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle winning van floëemexudaten die voldoende zijn voor proteomische en metabolomische studies.
- Identificatie van eiwitten en metabolieten, waaronder sucrose als de meest abundante metaboliet.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode bij verschillende plantensoorten.
- Inzichten in de dynamiek van de floëemcompositie als reactie op ontwikkelings- en stresscondities.
Conclusies
- De EDTA-gefaciliteerde methode is effectief voor het bestuderen van floëemexudaten.
- Analyse van het floëemsap kan belangrijke informatie onthullen over plantensignalering en het metabolisme.
- Deze aanpak kan worden aangepast voor diverse plantensoorten om het begrip van de floëemfuncties te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Inzicht in de samenstelling van het floëem maakt mechanische risicoreductie mogelijk bij de validatie van targets voor plantgebaseerde biofarmaceutische toepassingen, in het bijzonder bij de analyse van metabolieten en signaleringspaden. De met EDTA gefaciliteerde exudatiemethode ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid door reproduceerbare toegang tot de inhoud van het floëem bij verschillende soorten te bieden, wat bijdraagt aan vroege discovery-workflows. Deze benadering verbetert de translationele continuïteit van de ontdekking tot de preklinische evaluatie van plantafgeleide verbindingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de analyse van in het floëem gelokaliseerde metabolieten, eiwitten en RNA's die betrokken zijn bij stress-signaleringspaden.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie via functionele doelwitvalidatie, waarbij sucrose-, lipide- en eiwitprofielen als biomarkers voor de integriteit en activiteit van het floëem worden gebruikt.
- Voorspellende waarde: Faciliteert de triage van portfolios door veranderingen in de samenstelling van het floëem te koppelen aan ontwikkelings- of stresscondities, wat besluitvorming over het voortzetten of stopzetten (go/no-go) bij het screenen van verbindingen op basis van planten ondersteunt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door exudaten te verkrijgen die geschikt zijn voor LC-MS-, GC-MS- en dunne-laagchromatografie-analyse van metabolieten en lipiden.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays door gecontroleerde verzameltijden van exudaten en stappen voor de verwijdering van EDTA, waardoor de variabiliteit in de resultaten van compound-screening wordt verminderd.
- Schaalbaarheid: Maakt betrouwbare evaluatie van compounds mogelijk bij zowel kruidachtige als houtige soorten met minimale apparatuur, wat hergebruik van het platform in discovery-pipelines ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten via analyse van lipide-signalering en glycolytische enzymen in floëemexudaten, wat aansluit bij translationele biomarker-ontdekking bij plantstressreacties.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door longitudinale profilering van floëemmetabolieten en eiwitten over verschillende tijdspunten en behandelingen mogelijk te maken.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt beslissingen over de verdere ontwikkeling van plantafgeleide verbindingen door stabiele biomarkers (bijv. sucrose-ratio's) te identificeren die de vitaliteit van floëemlading en -transport weerspiegelen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het continuüm van ontdekkingen, van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, en ondersteunt de analyse van floëem-afgeleide metabolieten, eiwitten en lipiden in Arabidopsis en andere soorten.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door analyse mogelijk te maken van in het floëem gelokaliseerde verbindingen die betrokken zijn bij stresssignalering en metabolische flux.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van assays via gestandaardiseerde stappen voor exudaatverzameling en -zuivering, waardoor reproduceerbare kwantitatieve resultaten voor metaboliet- en lipidenscreening worden gegarandeerd.
- Analytics: Benadrukt LC-MS, GC-MS en dunne-laagchromatografie als cruciale analytische technieken die vergelijkbare datasets genereren voor het evalueren van effecten van verbindingen op de floëemsamenstelling.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door het mogelijk maken van het volgen van lipide- en eiwitbiomarkers over verschillende ontwikkelingsstadia en stresscondities, ter ondersteuning van risicogebaseerde voortgang.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Positioneert de met EDTA gefaciliteerde methode als een herbruikbare capaciteit voor diverse plantensoorten en laboratoria, waardoor de afhankelijkheid van gespecialiseerde apparatuur voor floëemanalyse wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen bij doelwitvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in floeemsignaleringsroutes en ontdekking van biomarkers voor stressrespons.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van exudaatverzameling over verschillende soorten en laboratoriumomgevingen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie door verminderde uitval in een laat stadium bij de ontwikkeling van plantaardige verbindingen en verminderd biologisch risico bij de selectie van doelwitten.
- Impact op het portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en voortgangsbeslissingen op basis van kwantitatieve floeemmetaboliet- en proteïneprofielen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in plantenfysiologie en metabolietanalyse om echte floëemexudaten te onderscheiden van cellulaire contaminanten.
- Afhankelijk van toegang tot LC-MS, GC-MS en elektroforese-instrumentatie voor een uitgebreide karakterisering van exudaten.
- Maakt standaardisatie van EDTA-wasprotocollen en verzameltijdstippen tussen teams noodzakelijk om de reproduceerbaarheid tussen laboratoria te waarborgen.
- Omvat aanpassingen bij het toepassen van de methode op houtige versus kruidachtige soorten vanwege verschillen in de kinetiek van floëemafsluiting.
- Praktische beperking: enkel relatieve kwantificering, aangezien de methode gebaseerd is op exudatie in plaats van directe verzameling van floëemsap, wat normalisatiestrategieën vereist voor vergelijkingen tussen monsters.
