Name: Verzameling en analyse van Arabidopsis Bastweefsel wondvocht De EDTA-methode vergemakkelijkt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-23T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer de EDTA-gefaciliteerde methode voor het verzamelen van floëemexsudaat uit Arabidopsis voor metaboliet- en eiwitanalyse. Deze techniek helpt onderzoekers bij het bestuderen van plantensignalering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation NSF-IOS subsidie ​​# 1144391 aan SHB.

1. Bereiding van planten <ol><li> Arabidopsis zaden kunnen worden gekiemd direct op de grond of op MS platen. Groeien de planten gedurende vier tot zes weken in groeikamers met een 12-uurs lichtperiode (22 ° C dag, 15 ° C &#39;s nachts 14). Planten water twee keer per week. Gebruik onderste lade voor het besproeien; niet waterplanten uit de top, zodat de trays te drogen alvorens opnieuw te drenken. Zorg ervoor dat planten zijn goed gehydrateerd op het moment van de oogst. </li></ol> 2. Voorbereiding van oplossingen en Schotels <ol><li> 2 K-EDTA-oplossing: Voeg een 100 mM K 2-EDTA voorraadoplossing, die in de koelkast worden bewaard. Op de dag van de verzameling, verder verdund 4:59 (enerzijds EDTA, vier delen water) een 20 mM K 2-EDTA oplossing. </li><li> Vul een glas of een petrischaal (diameter 7-15 cm) halverwege de 20 mM K 2-EDTA-oplossing. Als het verzamelen van monsters van verschillende behandelingen (voor exvoldoende controle en zout-gestresste planten of verschillende genotypen), bereiden aparte gerechten voor elke behandeling. </li><li> Vul gewenste aantal 1,7 ml reageerbuisjes met 1,4 ml 20 mM K-EDTA-oplossing 2. Vul een gelijk aantal reactiebuizen met 1,4 ml geautoclaveerd gedeioniseerd of Millipore water. </li><li> Zet papieren handdoeken op de bank te planten zich op, krijgen een nieuw scheermesje en op handschoenen. </li></ol> 3. Verzameling van bastweefsel exsudaten (afgebeeld in Stroomschema in figuur 1) <ol><li> Harvest rozetbladeren 4-6 weken oude planten door te snijden ze met het scheermes aan de voet van de bladsteel dicht bij het centrum van de rozet. </li><li> Onmiddellijk het bladeren in de gerechten die 20 mM K 2-EDTA. Zorg ervoor dat het afgesneden uiteinde van de bladsteel is ondergedompeld in de oplossing (figuur 2). </li><li> Nadat 15 bladeren zijn verzameld (ca. 3-4 planten) voorzichtig stapelen bladeren boven elkaar de thoed de cut bladstelen zijn op elkaar afgestemd. Recut de basis van de bladstelen (ca. 1 mm) en de bladeren onmiddellijk overbrengen naar een van de reageerbuisjes met 20 mM K 2-EDTA-oplossing. De bladeren passen makkelijkst als ze iets zijn opgerold. Vermijd knijpen de bladeren aangezien dit schade cellen en dus leidt tot het verzamelen van bladeren celinhoud veroorzaken. </li><li> Als er meer materiaal nodig is, zachtjes betrekking op de monsters met een natte papieren handdoek. Gebruik een nieuwe reeks van gerechten als voor het verzamelen van monsters uit verschillende behandelingen of genotypen. </li><li> Nadat alle monsters zijn geplaatst in reageerbuisjes, verzamel de uitscheidingen hetzij in het donker of in het licht. </li><li> Voor de inzameling in het donker, lijn de vloer van een grote ondiepe schaal met natte papieren handdoeken. Plaats het rek met het blad gevulde reageerbuisjes in de schaal en de omslag met natte papieren handdoeken of in een zwarte plastic rug met sleuven voor beluchting. Leg de hele setup in een kast of een donkere kamer. </li><li> Voor de inzameling in het licht, lijn de bodem van een heldere plexiglas container met natte papieren handdoeken. Plaats het rek met het blad gevulde reageerbuisjes in de container en sluit het. </li><li> Na 1 uur, verwijder bladeren voorzichtig uit de container en de reageerbuisjes en grondig met gedestilleerd, gedemineraliseerd of Millipore water om alle EDTA te verwijderen. Deze stap dient drie doelen: (1) het verwijdert de EDTA geminimali celschade, (2) het elimineert de interferentie van EDTA met SDS-PAGE en chromatografie, en (3) verwijdert verbindingen die verzameld uit cut / beschadigd cellen. Onmiddellijk over in de voorbereide reactie buisjes met geautoclaveerd water en terug te keren naar de bevochtigde collectie containers voor de inzameling van afscheidingen. Op dit punt, voeg RNase inhibitor als het exsudaat moet worden gebruikt voor RNA-extractie. Optioneel: proteïnase remmer kan worden toegevoegd indien gewenst eiwitanalyse. </li><li> Na de beoogde verzamelen tijd, trek en DISCArd de bladeren en bast bevriezen de uitscheidingen in vloeibare N2 voor verder gebruik. Indien langdurige opslag vereist, lyofiliseren de monsters en bewaar bij -80 ° C. </li><li> In het geval van Arabidopsis kan metabolieten al gedetecteerd na afname van uitscheidingen gedurende 1 uur. Echter, collectie voor 5-8 uur is aan te raden als de analyse van minder overvloedig onderdelen is gepland. Voor grotere installaties zoals Perilla, worden langer collectie tijden (8 uur) aanbevolen. Exsudaat verzameld uit 15 bladeren is meestal genoeg voor een rijstrook op een SDS-PAGE gel (eiwitten), voor mRNA extractie, GC-MS (suikers en metabolieten). Voor lipide analyse van de bundeling van 2-3 monsters (exsudaat 30-45 bladeren) wordt aanbevolen en leidt tot duidelijkere resultaten. </li></ol> 4. Latere Analyse (Voor Video Wij Only Show 4.4) <ol><li> Voor eiwitanalyse, resuspendeer monster in 15 ul water en 30 pi Lämmli buffer, hitte tot 95 ° C gedurende 5 min, snel spin down elke precipitates en laad gehele monster op een SDS-PAGE gel (45 pl laden zakken). De monsters moeten worden gekleurd met colloïdaal Coomassie of andere gevoelige vlekken aangezien eiwitgehalte zeer laag. </li><li> Voor suiker en kleine metabolietanalyse, voeg derivatiseren middelen voor het gedroogde monster in de literatuur 14. </li><li> mRNA kan worden geanalyseerd met behulp van RT-PCR, microarray of RNA-Seq-analyse. </li><li> Voor lipide analyse onmiddellijk pool 2-3 monsters en partitie tegen Chloroform: Methanol (1:1) in de zuurkast als volgt: voeg een gelijke hoeveelheid Chloroform: Methanol aan elk monster, vortex gedurende enkele seconden en centrifugeer gedurende 4 min bij 400 x g. Verzamel de bodem (organische) fase in een glazen buis met teflon dop en herhaal partitie met de hoogste fase nog drie keer. Droog de ​​gecombineerde organische fasen onder een stroom van N 2 en dienen bij verdere analyse (Dunnelaagchromatografie: TLC 14, 37; Vloeistofchromatografie-Massaspectrometrie: LC-MS 14). </li></ol>

<ol><li>Balachandran, S., Xiang, Y., Schobert, C., Thompson, G. A., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+proteins+from+Cucurbita+maxima+and+Ricinus+communis+have+the+capacity+to+traffic+cell+to+cell+through+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Phloem sap proteins from Cucurbita maxima and Ricinus communis have the capacity to traffic cell to cell through plasmodesmata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 14150-14158 (1997).</li>
<li>Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Aston, P., Jones, A., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+protein+identity+from+sieve+element+sap+in+Ricinus+communis+L.+by+quadrupole+time+of+flight+%28Q-TOF%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry.</a> J. Exp. Bot. 55, 1473-1481 (2004).</li>
<li>Behmer, S. T., Grebenok, R. J., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+sterols+and+host+plant+suitability+for+a+phloem+feeding+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Ecology%22%5BJournal%5D)">Plant sterols and host plant suitability for a phloem feeding insect.</a> Functional Ecology. , (2010).</li>
<li>Benning, U. F., Tamot, B., Guelette, B. S., Hoffmann-Benning, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+aspects+of+phloem-mediated+long-distance+lipid+signaling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Front.Plant.Sci%22%5BJournal%5D)">New aspects of phloem-mediated long-distance lipid signaling in plants.</a> Front.Plant.Sci. 3, 53>(2012).</li>
<li>Chen, S., Petersen, B. L., Olsen, C. E., Schulz, A., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+phloem+transport+of+glucosinolates+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PlantPhysiol%22%5BJournal%5D)">Long-distance phloem transport of glucosinolates in Arabidopsis.</a> PlantPhysiol. 127, 194-201 (2001).</li>
<li>Corbesier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FT+protein+movement+contributes+to+long+distance+signalling+in+floral+induction+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">FT protein movement contributes to long distance signalling in floral induction of Arabidopsis.</a> Science. 316, 1030-1033 (2007).</li>
<li>Dafoe, N. J., Gowen, B. E., &Constabel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thaumatin-like+proteins+are+differentially+expressed+and+localized+in+phloem+tissues+of+hybrid+poplar.BMC%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Thaumatin-like proteins are differentially expressed and localized in phloem tissues of hybrid poplar.BMC.</a> Plant Biology. 10, (2010).</li>
<li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Arabidopsis+thaliana+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of Arabidopsis thaliana phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> The Plant Journal. 55, 746-759 (2008).</li>
<li>Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+aphid+stylectomy+and+RT-PCR+for+the+detection+of+transporter+mRNAs+in+sieve+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements.</a> J. Exp. Bot. 53, 631-637 (2002).</li>
<li>Fisher, D. B., Wu, Y., Ku, M. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+soluble-proteins+in+the+wheat+sieve+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Turnover of soluble-proteins in the wheat sieve tube.</a> Plant Physiol. 100, 1433-1441 (1992).</li>
<li>Gaupels, F., Buhtz, A., Knauer, T., Deshmukh, S., Waller, F., van Bel, A. J. E., Kogel, K. -H., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+aphid+stylectomy+for+analyses+of+proteins+and+mRNAs+in+barley+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Adaptation of aphid stylectomy for analyses of proteins and mRNAs in barley phloem sap.</a> J Exp Bot. 59, 3297-3306 (2008).</li>
<li>Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Brassica+napus+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Brassica napus phloem sap.</a> Proteomics. 6, 896-909 (2006).</li>
<li>Guelette, B. S., Chamberlin, B., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Indications of lipids/lipid signaling in the phloem exudates of Arabidopsis thaliana and Perilla ocymoides. Benning, C., Ohlroggeeds, J. Proceedings of the 17th International Symposium of Plant, , Michigan State University. Lansing, USA. 92-95 (2007).</li>
<li>Guelette, B. S., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+lipids+and+lipid-binding+proteins+in+phloem+exudates+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Identification of lipids and lipid-binding proteins in phloem exudates from Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 63, 3603-3616 (2012).</li>
<li>Haebel, S., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time+of+flight+mass+spectrometry+peptide+mass+fingerprints+and+post+source+decay%3A+a+tool+for+the+identification+and+analysis+of+phloem+proteins+from+Cucurbita+maxima+Duch.+separated+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry peptide mass fingerprints and post source decay: a tool for the identification and analysis of phloem proteins from Cucurbita maxima Duch. separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Planta. 214, 3328(2001).</li>
<li>Hayashi, H., Fukuda, A., Suzui, N., Fujimaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+in+the+sieve+element-companion+cell+complexes%3A+their+detection%2C+localization+and+possible+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Proteins in the sieve element-companion cell complexes: their detection, localization and possible functions.</a> Aust. J. Plant Physiol. 27, 489-496 (2000).</li>
<li>Hoffmann-Benning, S., Gage, D. A., McIntosh, L., Kende, H., Zeevaart, J. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+peptides+in+the+phloem+sap+of+flowering+and+non-flowering+Perilla+and+lupine+plants+using+microbore+HPLC+followed+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Comparison of peptides in the phloem sap of flowering and non-flowering Perilla and lupine plants using microbore HPLC followed by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Planta. , 216-2140 (2002).</li>
<li>Jorgensen, R. A., Atkinson, R. G., Forster, R. L., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-Based+Information+Superhighway+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An RNA-Based Information Superhighway in Plants.</a> Science. 6, 1486-1487 (1998).</li>
<li>Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+proteins%3A+their+identities+and+potential+roles+in+the+interaction+between+plants+and+phloem-feeding+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects.</a> J. Exp. Bot. 57, 767-774 (2006).</li>
<li>King, R. W., Zeevaart, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+phloem+exudation+from+cut+petioles+by+chelating-agents%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of phloem exudation from cut petioles by chelating-agents.</a> Plant Physiol. 53, 96-103 (1974).</li>
<li>Lin, M. -K., Lee, Y. -J., Lough, T. J., Phinney, B., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+pumpkin+phloem+proteome+provides+functional+insights+into+angiosperm+sieve+tube+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the pumpkin phloem proteome provides functional insights into angiosperm sieve tube function.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 343-356 (2009).</li>
<li>Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+plant+biology%3A+role+of+phloem+long-distance+macromolecular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative plant biology: role of phloem long-distance macromolecular trafficking.</a> Annu.Rev. Plant Biol. 57, 203-232 (2006).</li>
<li>Madey, E., Nowack, L. M., Thompson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+lipid+in+phloem+sap+of+canola%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of lipid in phloem sap of canola.</a> Planta. 214, 625-634 (2002).</li>
<li>Maeda, H., Song, W., Sage, T. L., DellaPenna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tocopherols+playa+crucial+role+in+low-temperature+adaptation+and+phloem+loading+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Tocopherols playa crucial role in low-temperature adaptation and phloem loading in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 18, 2710-2732 (2006).</li>
<li>Marentes, E., Grusak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+determination+of+low-molecular-weight+proteins+in+phloem+sap+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Mass determination of low-molecular-weight proteins in phloem sap using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> J. Exp. Bot. 49, 903-911 (1998).</li>
<li>Prado, E., Tjallingii, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+evidence+for+local+reduction+of+aphid-induced+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+ofInsect+Science%22%5BJournal%5D)">Behavioral evidence for local reduction of aphid-induced resistance.</a> Journal ofInsect Science. 7, 48(2007).</li>
<li>Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Cázares, B., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+long-distance+transport+of+CmNACP+mRNA%3A+implications+for+supracellular+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants.</a> Development. 126, 4405-4419 (1999).</li>
<li>Ryabov, E. V., Robinson, D. J., Taliansky, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+virus-encoded+protein+facilitates+long-distance+movement+of+heterologous+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A plant virus-encoded protein facilitates long-distance movement of heterologous viral RNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1212-1217 (1999).</li>
<li>Schilmiller, A. L., Howe, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+signaling+in+the+wound+response%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Systemic signaling in the wound response.</a> Curr.Opin. Plant Biol. 8, 369-377 (2005).</li>
<li>Thompson, G. A., Goggin, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomics+and+functional+genomics+of+plant+defence+induction+by+phloem-feeding+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Transcriptomics and functional genomics of plant defence induction by phloem-feeding insects.</a> J. Exp. Bot. 57, 755-766 (2006).</li>
<li>Thorpe, M. R., Ferrieri, A. P., Herth, M. M., Ferrieri, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2811%29C-imaging%3A+methyl+jasmonate+moves+in+both+phloem+and+xylem%2C+promotes+transport+of+jasmonate%2C+and+of+photoassimilate+even+after+proton+transport+is+decoupled%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">(11)C-imaging: methyl jasmonate moves in both phloem and xylem, promotes transport of jasmonate, and of photoassimilate even after proton transport is decoupled.</a> Planta. (11), 226-541 (2007).</li>
<li>Truman, W., Bennett, M. H., Kubigsteltig, I., Turnbull, C., Grant, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+systemic+immunity+uses+conserved+defense+signaling+pathways+and+is+mediated+by+jasmonates%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis systemic immunity uses conserved defense signaling pathways and is mediated by jasmonates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 1075-1080 (2007).</li>
<li>van Bel, A. J. E., Knoblauch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sieve+element+and+companion+cell%3A+the+story+of+the+comatose+patient+and+the+hyperactive+nurse%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sieve element and companion cell: the story of the comatose patient and the hyperactive nurse.</a> Aust. J. Plant Physiol. 27, 477-487 (2000).</li>
<li>van Bel, A. J. E., Hess, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexoses+as+phloem+transport+sugars%3A+the+end+of+a+dogma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Hexoses as phloem transport sugars: the end of a dogma.</a> J. Exp. Bot. 59, 261-272 Forthcoming.</li>
<li>Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+presence+and+activity+of+a+complete+antioxidant+defence+system+in+mature+sieve+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes.</a> Plant J. 31, 189-197 (2002).</li>
<li>Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+curcurbit+phloem+exudate+reveals+a+network+of+defence+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins.</a> Phytochemistry. 65, 1795-1804 (2004).</li>
<li>Wang, Z., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+Polar+Glycerolipid+Profiling+by+Thin+Layer+Chromatography+%28TLC%29+Coupled+with+Gas-Liquid+Chromatography+%28GLC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC).</a> J. Vis. Exp. (49), e2518(2011).</li>
<li>Will, T., van Bel, A. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> J. Exp. Bot. 57, 729-737 (2006).</li>
<li>Yoo, B. C., Kragler, F., Varkonyi-Gasic, E., Haywood, V., Archer-Evans, S., Lee, Y. M., Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systemic+small+RNA+signaling+system+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A systemic small RNA signaling system in plants.</a> Plant Cell. 16, 1979-2000 (2004).</li>
<li>Zhang, B., Tolstikov, V., Turnbull, C., Hicks, L. M., Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+metabolome+and+proteome+suggest+functional+independence+of+dual+phloem+transport+systems+in+cucurbits%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Divergent metabolome and proteome suggest functional independence of dual phloem transport systems in cucurbits.</a> PNAS USA. 107, 13532-13537 (2010).</li>
<li>Zhang, C., Yu, X., Ayre, B. G., Turgeon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Origin+and+Composition+of+Cucurbit+%22Phloem%22+Exudate%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Origin and Composition of Cucurbit "Phloem" Exudate.</a> Plant Physiology. 158, 1873-1882 (2012).</li>
<li>Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phloem-Delivered+RNA+Pool+Contains+Small+Noncoding+RNAs+and+Interferes+with+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Phloem-Delivered RNA Pool Contains Small Noncoding RNAs and Interferes with Translation.</a> Plant Physiol. 150, 378-387 (2009).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

De EDTA-gefaciliteerd collectie van floëem afscheidingen is heel simpel, moet een minimale uitrusting, en is van toepassing op de meeste planten. Kortom, deze werkwijze breidt de mogelijkheid floëem uitscheidingen analyseren van meer species. Hoewel het exsudaat wordt verdund, is het gemakkelijk om verschillende monsters of veel planten te schalen tot een grote hoeveelheid materiaal. Dit maakt vervolgens de detectie van nieuwe verbindingen die in zeer lage abundantie en anders zouden worden gezien. Deze methode kan gebruikt worden voor verschillende plantensoorten en werkt zoals beschreven in dit manuscript opgegeven talen. Als er nieuwe soorten worden verkend, de twee aspecten die wijziging nodig zou kunnen hebben zijn het aantal bladeren gebruikt en het tijdstip van de afscheiding. In de meeste gevallen moet een uur exudaat 07:55 geschikt. Om het gebruik van deze methode voor een nieuwe plantensoorten bevestigen exsudaat moet worden verzameld en een of meer van de volgende als beschreven in protocol deel 4 needs te voeren. Afhankelijk van de intensiteit van het signaal waargenomen, kan de opvangcapaciteit moet worden opgeschaald. In het algemeen zullen lipiden en eiwitanalyse meer materiaal dan suiker en metabolietanalyse worden omdat de eerstgenoemde minder overvloedig in floëem exudaten. Omdat EDTA gefaciliteerde exudaat verzameling omvat gesneden oppervlakken en een potentieel schadelijke effect van EDTA, diverse punten moeten worden overwogen: (1) na een uur incubatie met EDTA, de bladstelen moeten grondig worden gewassen. Dit verwijdert alle samenstellingen uit gewonde cellen alsmede de EDTA zelf, die cellen kunnen beschadigen of die de extractie. (2) Positieve en negatieve controles moeten worden opgenomen om ervoor te zorgen verkregen gegevens zijn afgeleid van floëem sap en niet die van gewonde cellen (zie hieronder kritische stappen). (3) bastweefsel sap bevat verschillende enzymen, die tijdens wondvocht collectie actief kon zijn. Vandaar dat in sommige gevallen het nuttig om voor verzamelen kanr verschillende hoeveelheden tijd. (4) Aangezien de werkwijze betrokken exudatie in water, een absolute kwantificering van de verbindingen niet mogelijk. Kritische stappen: De sleutel tot het succesvol gebruik van deze methode is het gebruik van voorzichtigheid tijdens het hanteren van het monster aan alle cellen, alsook het gebruik van passende controles niet verwonden (zie ref 14.). Een geschikte controle is de collectie van floëem afscheidingen zonder voorafgaande behandeling met EDTA. In dit geval zal het floëem zelf dichten en geen exsudaat kunnen worden verzameld. Elke vervuilende stoffen afkomstig van de gewonde cellen zullen hier worden gedetecteerd. Een tweede controle zou de analyse van suikers in het exsudaat zijn. In Arabidopsis, moet sucrose zijn de belangrijkste metaboliet in het floëem sap, met fructose naar sacharose verhouding van 1:04-01:08 (ref 8, 14). Voor RNA-extractie het gebruik van een RNAse inhibitor noodzakelijk. Bovendien, een positieve controle van eerder described floëem-gelokaliseerde mRNA (UBC9: Ubiquitine conjugerend enzym 9, At4g27960, 8, 14) en een negatieve controle voor bijvoorbeeld een chloroplast mRNA (Rubisco LSU) te bepalen. Omdat het exsudaat bevat actieve enzymen, is een tijdsverloop geadviseerd om zeker veranderingen in het floëem profiel te maken zijn niet alleen te wijten aan variaties in de collectie tijd. In sommige gevallen kan het nuttig zijn om proteaseremmers gebruiken. Echter, de onderzoekers moeten in gedachten houden, dat de verzamelde wondvocht zal worden geconcentreerd en dat eventuele toegevoegde verbindingen zal grotendeels worden geconcentreerd. Een tweede belangrijke stap in het protocol is de Versnijden van de bladsteel onder EDTA. Deze stap heeft een tweeledig doel: ten eerste, het verwijdert alle geasfalteerde zeef platen terwijl het voorkomen van de vorming van nieuwe pluggen waardoor voor vrije doorstroming van het floëem sap. Ten tweede, het verwijdert de cavitatie zeepbel in de houtvaten gegenereerd tijdens het snijden en dus zorgt voor xyleem vervoer. De grootte van de tweede snede afhangenTussen de planten gebruikt. In installaties met grotere bladstelen moet verscheidene millimeters (1 cm) boven het aansnijden in planten zoals Arabidopsis, 1-2 mm voldoende. Het gebruik van deze werkwijze kan leiden tot de ontdekking van nieuwe verbindingen in floëem exsudaten die kunnen signaleren, ontwikkelings-of biomedische gevolgen. Het heeft een meer gevraagd diepgaande blik op lange afstand lipide signalering, wat een weinig onderzocht gebied was binnen de plantkunde te wijten aan het gebrek aan toegang tot het floëem.

Planten kunnen niet bewegen om ongunstige omstandigheden te ontsnappen. Bijgevolg moesten ze mechanismen om milieu-invloeden te detecteren ontwikkelen, uitlokken en zenden een bijbehorende signaal door de plant, en de ontwikkeling aan te passen. Twee transportsystemen bestaan ​​voor de distributie van water, voedingsstoffen en andere (signalering) verbindingen. De eerste is het xyleem, die typisch transporteert water en mineralen opgenomen door de wortels in de plant. De tweede is het floëem. Volgens de floëem is veranderd van een eenvoudige assimileren transportsysteem met een leiding voor RNA, eiwitten, virussen, lipiden en andere kleine moleculen. Het speelt een belangrijke rol bij assimileren en transport van nutriënten, respons op biotische en abiotische stress, en in plantengroei en-ontwikkeling. Het wordt nu genoemd de &quot;informatiesnelweg&quot; van de plant 18. De floëem bestaat uit verschillende celtypes: floëem parenchym, alsmede gespecialiseerde companion cells en zeef elementen. De zeef element is de plaats van de lange afstand beweging. Te zorgen voor onbelemmerde langsstroming, worden zeef elementen ontbreken de meeste organellen evenals kernen en worden verondersteld om in het beste geval een beperkte translatiemachinerie 21, 33 bevatten. Men gelooft dat companion cellen synthetiseren eiwitten en andere verbindingen, die reizen op het floëem stroom. Deze verbindingen worden vervolgens in de zeef element via plasmodesmata vervoerd en kan functioneren als lange afstand signalen 4,16. Verschillende groepen van verbindingen kunnen worden gevonden in floëem exsudaten: <ul><li> Suikers Vaak gaat de fotosynthese en getransporteerd als &quot;energie-transport&quot; moleculen aan andere delen van de plant voor opslag of als bouwstenen. Ze kunnen echter ook als antivries of signalering verbindingen. </li><li> Eiwitten kunnen ook worden gevonden in floëem exsudaten. Zij omvatten metabole enzymen maar heeft signaalfunctie. Een example van een eiwit dat als een ontwikkelingsstoornis signaal bedient is de Bloeiende locus T-eiwit, dat de inductie van de bloei en seizoensgebonden blad abscissie in planten signaleert. 6 </li><li> Nucleïnezuren aanwezig in floëem exsudaten in de vorm van mRNA, kleine en micro RNAs, en virale RNA&#39;s. Ze lijken grotendeels betrokken bij signalering 27, 28, 39. Tegelijkertijd hebben rRNA en tRNA&#39;s voor vrijwel alle aminozuren waargenomen in het bastweefsel sap van Cucurbitaceae 42. Ze lijken selectief overgebracht naar de zeef buissysteem. Het tRNA vertonen noodzakelijk zijn voor de mogelijkheid om aminozuren te dragen aan de translationele inrichting. Maar in plaats van aan vertaling, lijken ze dit proces remmen. Ze zouden ook dienen als een bron van cytokinine of signaleren metabole status van de installatie 42. </li><li> Vetzuren, oxylipines en andere lipiden zijn ook gevonden in floëem exudaten 3, 13, 14, 23. Jasmonic zuur, een oxylipin beweegt door het floëem als onderdeel van de reactie op pathogeeninfectie 22, 29, 31, 32. Hoewel de rol van de meest floëem lipiden is nog onduidelijk, sommige hebben waarschijnlijk signaalfunctie 4. </li></ul> De uitdaging in het werken met planten floëem ligt in zijn vermogen om zichzelf te verzegelen na verwonding. Er zijn vier belangrijke methoden die worden gebruikt om floëem afscheidingen te verzamelen, maar ze werken alleen in een beperkt aantal soorten: 1) In komkommerachtigen is het mogelijk om redelijke hoeveelheden floëem exsudaat vinden doorsnijdingen van de bladsteel. Zodra de eerste druppel met verontreiniging van verwonde cellen wordt verwijderd, is het mogelijk om redelijk grote hoeveelheden van zuiver sap floëem 1, 15 te verkrijgen. Echter, met toenemende verzamelen tijd, dit exsudaat verdikt, zodat het steeds ongeschikt voor vloeistofchromatografie benaderingen (niet gepubliceerd). Recente publicaties suggereren, dat afhankelijk van de soort, dit floëem sap wordt afgeleid van either de fasciculair (FP) of de extrafascicular floëem (EP) en dat, terwijl het bevat &quot;mobiele&quot; floëem sap uit de zeef elementen (FP), het is ook gevoelig voor besmetting van andere celtypen, waaronder de xyleem 40, 41 . 2) Een tweede benadering is om floëem sap te verkrijgen via ondiepe sneden of lekken in de stengel of bladsteel. Deze werkwijze is met succes gebruikt in lupine 17, 25, 36 pompoenen en Brassica napus 12. Hier de verontreiniging door verwonde cellen is minimaal en de uitscheidingen zeer zuiver. Echter, planten nodig hebben om gezond en goed van water te zijn, omdat het is zeer uitdagend om selectief punctie gewoon de zeef elementen. Als houtvaten zijn gejat, wordt alle exsudaat getrokken in de houtvaten stroom. Dit maakt de methode geschikt voor planten met zeer fragiel of sterk verhoute bladstelen of stengels. 3) Bladluis stylectomy laat bladluizen hun stilet voegen in de zeef elementen den verwijderen van de bladluis met een laser. Floëem sap wordt afgescheiden door de overgebleven stilet 2, 9, 10, 35, 38. In theorie kunnen alle planten die kunnen worden geïnfecteerd door bladluizen worden gebruikt voor deze aanpak. Toch zullen de meeste kassen of klimaatkamers managers ondersteunt het gebruik van een ziekteverwekker. Bovendien bladluizen introduceer eiwitten in het bastweefsel hun speeksel 19, 33. Dit leidt tot een beperkte transcriptionele herprogrammering 30 en heeft de potentie om de samenstelling floëem 26 wijzigen. 4) De hier beschreven methode is de EDTA-gefaciliteerd uitzweten van floëem sap. Deze methode maakt EDTA om afdichting van de floëem 20 voorkomen. EDTA chelaat Ca2 + ionen die anders zouden deelnemen processen die dicht de floëem. Terwijl EDTA kan leiden tot celbeschadiging 30, hebben verschillende groepen deze methode en acht geen nadelig effect van EDTA concentraties van 10 mM tot 20 mM aan de cel ultrastructuur of phloem laden en transport 5, 24. Om schadelijk effect, en ook interferentie van EDTA met chromatografie en gelelektroforese verminderen, worden de planten verplaatst naar water na 1 uur en alleen het laatste deel van het exsudaat wordt gebruikt 14. Dus, in plaats van afscheiding in EDTA, wordt phloem exudated in water (EDTA-gefaciliteerd uitzweten). Het is een straight-forward, lage kosten, en de low-tech methode voor het verzamelen van floëem afscheidingen. Floëem sap deze wijze verkregen kan worden gebruikt om eiwitten, kleine moleculen, lipiden en RNA analyse en is met succes gebruikt in veel planten. Terwijl een beperkt aantal experimenten werd uitgevoerd in eenzaadlobbigen 11, wordt de methode meer geschikt voor tweezaadlobbigen (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, populier 7). Verzameling van exudaten moet plaatsvinden in een vochtige omgeving om verlies van uitscheidingen voorkomen door transpiratie. Afhankelijk van de installatie, incubatie in EDTA gedurende 1-2 uur isvoldoende afdichting van het floëem / zeef elementen te voorkomen. De collectie kan dan plaatsvinden in het water. Dit heeft het voordeel van het voorkomen van de negatieve gevolgen EDTA op celstructuur en stabiliteit. Tevens elimineert de interferentie van EDTA met methoden zoals HPLC of SDS-PAGE. Aangetoond zoals dit geldt voor Arabidopsis. Voor grotere installaties incubatie in EDTA en exsudaat verzamelingen moet worden opgeschaald en wordt uitgevoerd in bekers plaats in 1,7 ml reageerbuisjes.

<table><tbody><tr><td>K2-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P-500G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ondiepe glazen of plastic Petri-schaal (7-15cm)</td><td>PYREX of Corning</td><td></td><td>Elke schone, ondiepe schaal werkt</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>EMD</td><td>CX1054-1</td><td>Open alleen containers in een afzuigkap</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T.Baker</td><td>9070-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Buisjes met schroefdop</td><td>VWR International</td><td>53283-800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Buisjes met schroefdop</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorfbuisjes</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

verzameling en analyse van<em&gt; arabidopsis</em&gt; bastweefsel wondvocht de edta-methode vergemakkelijkt

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

De plant floëem is essentieel voor het vervoer over lange afstand van de (foto-) assimileert alsook van signalen overbrengen van biotische of abiotische stress. Het bevat suikers, aminozuren, eiwitten, RNA, lipiden en andere metabolieten. Hoewel er een grote belangstelling voor het begrijpen van de samenstelling en functie van het floëem, de rol van veel van deze moleculen en dus hun belang in ontwikkeling en stress plantenrespons moet nog worden bepaald. Een hindernis bij floëem analyse ligt in het feit dat het floëem zeehonden zich op verwonden. Dientengevolge, het aantal planten waaruit floëem sap kan worden verkregen beperkt. Een methode die collectie van floëem afscheidingen laat uit verschillende plantensoorten zonder toegevoegde apparatuur is de EDTA-gefaciliteerde floëem exsudaat collectie hier beschreven. Hoewel het gemakkelijk is te gebruiken, leidt wel tot het verwonden van cellen en zorg moet worden genomen om de inhoud van beschadigde cellen te verwijderen. Bovendien hebben verschillende controles zuiverheid van het exsudaat tonennoodzakelijk. Omdat het een afscheiding in plaats van een directe inning van het floëem sap (niet mogelijk in veel soorten) slechts relatieve kwantificering van de inhoud kan ontstaan. Het voordeel van deze methode boven anderen is dat het kan worden gebruikt in vele kruidachtige en houtachtige plantensoorten (Perilla, Arabidopsis, populier, enz.) en vereist minimale uitrusting en training. Het leidt tot redelijk grote hoeveelheden exsudaten die kan worden gebruikt voor daaropvolgende analyse van eiwitten, suikers, lipiden, RNA, virussen en metabolieten. Het is eenvoudig genoeg dat het kan worden gebruikt in zowel onderzoek als in het onderwijs laboratorium.

Het is duidelijk geworden in de afgelopen jaren dat de complexiteit van het floëem sap het antwoord op de vraag hoe planten te sturen verschillende ontwikkelings-en stress-signalen voor optimale respons kan zijn. Met behulp van EDTA-gefaciliteerd floëem uitzweten kan de mogelijkheid om floëem afscheidingen analyseren van planten die niet geschikt zijn voor andere benaderingen, maar kan zijn van economische of fysiologische belang. Deze methode zorgt voor de oogst van voldoende floëem uitscheidingen te floëem-gelokaliseerde eiwitten te identificeren en detecteren veranderingen in het niveau in reactie op ontwikkeling of stress (Figuur 3). Zoals de figuur laat zien, eiwitten zijn in zeer lage overvloed, maar toch, het niveau hoog genoeg is voor de daaropvolgende proteomics experimenten met LC-MS/MS of voor Western blot analyse. Bevindingen in cucurbitaceae suggereren dat het snijden van de steel leidt tot een verstoring van het water potentieel balans en een latere instroom van water eneventuele verontreinigingen uit de apoplast 41. Toch collectie voor tijden, variërend van een tot acht uur heeft geen invloed op het floëem eiwitprofiel / compositie in Arabidopsis (. Alleen het absolute bedrag varieert Guelette et al.), de hoeveelheid eiwit verzameld en het patroon van eiwitten gevonden varieert tussen soorten (Arabidopsis: op; Perilla, lane I en NI) en behandelingen (Perilla gegroeid op verschillende dag lengtes, lane I en NI). Hierdoor eiwitachtig signalen kunnen worden gevisualiseerd, geïdentificeerd en gevolgd. mRNA en micro RNAs kunnen ook bastweefsel exudaten worden geïdentificeerd door deze methode. Echter, de behandeling met RNAse inhibitor noodzakelijk voor afbraak van het mRNA tijdens de verlengde exudatie tijd voorkomen. Aangezien de zeef elementen niet functioneel chloroplasten Rubisco kleine of grote subeenheid (RBCs of RbCl respectievelijk) bevatten mRNA kan worden gebruikt als negatieve controles, terwijl bekend bastweefselGelokaliseerde mRNA achtige Ubiquitine-conjugerend enzym worden gebruikt als een positieve controle (Figuur 4). Evenzo kunnen suikers of kleine metabolieten worden geanalyseerd met behulp van GC-MS of LC-MS. Hierbij moet worden opgemerkt dat het floëem uitscheidingen bevatten een groot aantal functionele enzymen, waaronder bijna de volledige glycolytische route 12. Vandaar dat, met behulp van verschillende tijdstippen kunnen metabole processen tijdens het exsudaat collectie te onthullen. Een voorbeeld is getoond in Figuur 5: In alle afscheidingen, sucrose is de meest voorkomende metaboliet, dit is het duidelijkst na verzameling gedurende 1 uur. Na vijf uur de sucrose fructose enigszins verminderd. Als dezelfde wondvocht wordt verzameld voor een uur en links op de bank voor de komende vier uur, wordt de sucrose te verhouding fructose gereduceerd tot een veel grotere mate, wat suggereert dat actieve enzymen in het floëem uitscheidingen leiden tot een degradatie van sucrose bij kamertemperatuurtuur (voor meer peak interpretaties zie 14). Dit komt overeen met de bevindingen die floëem laden en transport van moleculen uit begeleider cellen in de zeef elementen, nog tijdens afscheiding tot het systeem verliest zijn vitaliteit 34. Lipiden in het floëem afscheidingen en, bij uitbreiding, lange-afstand lipide signalering zijn een vrij recente veld van interesse in de plantkunde. Door hun hydrofobe aard lipiden slechts aanwezig in lage concentraties en worden gebonden aan andere moleculen voor solubilisatie. Toch is de EDTA-vergemakkelijkt afscheiding maakt het verzamelen van voldoende materiaal te visualiseren (TLC, figuur 6), en identificeren (LC-MS, Figuur 7) floëem lipiden uit verschillende plantensoorten. Zoals de figuur laat zien is het mogelijk om verscheidene soorten lipiden identificeren en te scheiden. LC-MS maakt het mogelijk om verschillende soorten lipiden te identificeren en om veranderingen te volgen binnen het lipidenprofiel van different genotypen of behandelingen. Dit maakt de studie van de rol van lipiden in plantenontwikkeling en stressrespons. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> Figuur 1. Stroomdiagram van de collectie van floëem afscheidingen van Arabidopsis of Perilla. Verschillende wegen leiden tot verschillende eindproducten, die zijn aangegeven in blauw. Voor de bereiding van RNA, RNAse-remmer (100 U / ml, Roche) wordt toegevoegd aan het water waarin het floëem exudaat verzameld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> Figuur 2. Setup van materialen voor floëem exsudaat verzamelenion. De setup geeft alle materialen die nodig zijn voor het protocol stappen 3.1-3.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . Figuur 3 Eiwitten gevonden in floëem exsudaten van twee verschillende plantensoorten, Arabidopsis (At) en Perilla (I en NI; andere dag lengtes); MW: molecuulgewichtmerker (baan 2). Eiwitten werden gescheiden onder toepassing van een 10-20% gradiënt SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> Figuur 4. Analysede aanwezigheid van mRNA voor Rubisco kleine en grote subeenheid (RBCs en RbCl, respectievelijk) en ubiquitine-conjugerend enzym (UBC). mRNA werd verzameld van Arabidopsis bladeren (L), bladstelen (P) en floëem exudaten (Ph), reverse getranscribeerd en specifieke transcripten gevisualiseerd middels PCR. Het cijfer werd gewijzigd van Guelette et al.. 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> Figuur 5. GC-MS profiel van floëem exsudaten voor verschillende hoeveelheid tijd. Merk op hoe de relatieve hoeveelheid sacharose verandert van 1 uur collectie (A) tot 5 uur van de collectie (B) tijd. Exsudaat profiel na collectie voor 1 uur gevolgd door &quot;incubatie&quot; op kamer<html> temperatuur (RT) van vier uur (C). Blad metabolietenprofiel (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> Figuur 6. Thin-layer chromatogram lipiden vergelijken van Perilla (links) en Arabidopsis (rechts) bladeren en bast afscheidingen. Sterretjes geven lipiden specifiek voor floëem uitscheidingen. DGDG: digalactosyldiacylglycerol; PG: fosfatidylglycerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; Het deel van de figuur weergeven van Arabidopsis lipiden aangepast is Guelette et al. 14.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; altijd &quot;&gt; <img alt="Figuur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> Figuur 7. Lipidenprofiel van floëem afscheidingen van Arabidopsis (chloroform fase) met behulp van LC-MS / negatieve ion-modus. Grafieken in de top (mutant A) en onder (wild-type, B) tonen de verschillen in lipidenprofielen tussen twee verschillende genotypen (aangegeven door pijlen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> .

Kennis van de samenstelling van het floëem sap en het mechanisme van de lading en langeafstandsvervoer is essentieel voor het begrijpen van de lange afstand signalering bij ontwikkeling en stress / pathogeen respons planten en assimileren transport. Dit manuscript beschrijft de verzameling van floëem exsudaten gebruik van de EDTA-gefaciliteerd methode.

Verzameling en analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bastweefsel wondvocht De EDTA-methode vergemakkelijkt

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Het algemene doel van deze procedure is het verzamelen van floëmexudaat van Arabidopsis of andere planten om de inhoud te analyseren of de aanwezigheid van verbindingen binnen de floëemstroom te bevestigen. Dit wordt bereikt door eerst het kroonblad door te snijden en te incuberen in kalium-EDTA om het dichtsluiten van de zeefelementen te voorkomen. De tweede stap is om het kroonblad grondig te wassen om elk resterend EDTA te verwijderen dat de daaropvolgende analyse kan verstoren en ook cellen kan beschadigen bij langdurige blootstelling.Vervolgens worden de flow EM-exudaten opgevangen in water. De laatste stap is het voorbereiden van monsters voor daaropvolgende analyse via L-C-M-S-G-C-M-S gel-elektroforese en dunne-laagchromatografie. Uiteindelijk kan de door EDTA gefaciliteerde phem-exudatie worden gebruikt om phem-inhoud zoals metabolieten en lipiden, eiwitten of RNA's te analyseren en te bevestigen.Planten kunnen niet ontsnappen aan ongunstige omstandigheden. Als gevolg hiervan hebben ze zeer efficiënte en snelle systemen nodig om omgevingssignalen door de gehele plant te transporteren en te reageren door de ontwikkeling aan te passen. Een van deze signaleringspaden is de plantenstroom, waarvan de samenstelling vrij complex is om te begrijpen.We maken gebruik van de EDTA-gefaciliteerde stroomsedatie voor het verzamelen en analyseren van stroominhoud. Deze methode is oorspronkelijk in Perilla ontwikkeld door King en collega's, maar kan eenvoudig worden aangepast voor andere soorten. De procedure zal worden gedemonstreerd door Elena en US, beiden undergraduate studenten uit mijn laboratorium, voorafgaand aan de start van deze procedure.Kweek Arabidopsis-planten gedurende vier tot zes weken in groeikamers met een fotoperiode van 12 uur tot de dag van verzameling. Verdun een eerder bereide 100 millimolaire kalium-EDTA-oplossing met water tot een uiteindelijke concentratie van 20 millimolair. Vul vervolgens twee glazen schalen met een diameter van 7 tot 15 centimeter voor de helft met de 20 millimolaire kalium-EDTA-oplossing.Vul na voltooiing 1,7 milliliter reactiebuisjes met 1,4 milliliters van de 20 millimolaire kalium-EDTA-oplossing. Vul vervolgens een gelijk aantal reactiebuisjes met 1,4 milliliters Millipore-water. Haal na het verwijderen van de vier tot zes weken oude planten uit de groeikamers de rozetbladeren oogst door ze met een scheermesje aan de basis van het blad dicht bij het centrum van de rozet af te snijden.Plaats de bladeren onmiddellijk in de schalen met 20 millimol potassium EDTA, waarbij het gesneden uiteinde van de bladeren in de oplossing wordt ondergedompeld. Zodra er 15 bladeren van drie tot vier planten zijn verzameld, worden deze voorzichtig op elkaar gestapeld zodanig dat de gesneden uiteinden op één lijn liggen. Snijd de basis van de bladeren opnieuw af en rol de bladeren voorzichtig op.Voeg vervolgens de opgerolde bladeren voorzichtig toe aan een van de reactiebuisjes met 20 millimolar kalium-EDTA voor de collectie van het exsudaat. Bekleed in het donker de bodem van een grote ondiepe schaal met natte papieren handdoeken. Plaats het rek met de gevulde reactiebuisjes in de schaal en doe deze in een zwarte plastic zak met sleuven voor beluchting.Plaats vervolgens de gehele opstelling in een kast voor de collectie van exudaten. Bekleed de bodem van een doorzichtige plexiglascontainer met natte papieren handdoeken. Plaats het rek met de reactiebuisjes gevuld met bladeren in de container en sluit deze.Na het verwijderen van het rek uit de houder, een uur later, worden de bladeren uit de reactiebuisjes gehaald. Was de bladeren grondig met gedestilleerd water om alle EDTA te verwijderen. Plaats de bladeren onmiddellijk in de reactiebuisjes met millipore-water en plaats ze terug in de bevochtigde houders voor de opvang van exudaten na het verwijderen van het rek uit de bevochtigde houder.Haal vijf tot acht uur later de bladeren uit de buisjes, vries vervolgens de stroomexudaten in vloeibare stikstof en bewaar ze in een vriezer op -80 °C. Voor verdere analyse op de volgende dag worden de monsters ontdooid ter voorbereiding op de lipidenanalyse. Neem vervolgens twee tot drie monsters en voeg een gelijke hoeveelheid chloroform en methanol toe aan de gecombineerde oplossing.Vortex het mengsel gedurende enkele seconden. Centrifugeer vervolgens het monster vier minuten bij 400 gs. Verzamel na voltooiing de onderste organische fase in een glazen buis nadat de partitie met de bovenfase nog drie keer is herhaald, droog de gecombineerde organische fasen onder een stroom stikstof en dien deze in voor dunlaagchromatografie en LCMS-analyse.Deze methode maakt het mogelijk om voldoende phem-exudaten te oogsten om phem-gelokaliseerde eiwitten te identificeren en de veranderingen in hun gehalte als reactie op ontwikkeling of stress te bepalen. In sommige gevallen kunnen onderzoekers proteinaseremmers gebruiken om degradatie van eiwitten te voorkomen. Zoals hier wordt getoond, is de abundantie van eiwitten zeer laag, maar hun niveau is voldoende voor daaropvolgende proteomics-experimenten.Bevindingen uit LCMS- of western blot-analyses in cucurbitten suggereren dat het doorsnijden van de STENGEL leidt tot een verstoring van de balans in het waterpotentieel en een daaropvolgende instroom van water en mogelijke contaminanten vanuit de omgeving. Echter, verzamelperiodes variërend van één tot acht uur hebben geen invloed op het eiwitprofiel en de samenstelling van de flow M inOpSys. De hoeveelheid verzameld eiwit en het patroon van de aangetroffen eiwitten variëren per soort en behandeling.Als gevolg hiervan kunnen eiwitsignalen worden gevisualiseerd, geïdentificeerd en gevolgd. mRNA en microRNA's kunnen met deze methode eveneens worden geïdentificeerd in flom-exudaten. Behandeling met een RNA-inhibitor is echter noodzakelijk om degradatie van het mRNA tijdens de verlengde exudatietijd te voorkomen.Aangezien de C-elementen geen functionele chloroplasten bevatten, kunnen rubis-, kleine of grote subunit-mRNA's als negatieve controles worden gebruikt, terwijl bekend pH flu m gelokaliseerd mRNA, zoals ubiquitine-conjugerend enzym, als positieve controle kan dienen. Op dezelfde manier kunnen suikers of kleine metabolieten worden geanalyseerd met behulp van GCMS of LCMS. Er moet worden vermeld dat de phem-exudaten een groot aantal functionele enzymen bevatten, waaronder bijna de volledige glycolytische route.Daarom kan het gebruik van verschillende tijdspunten metabole processen tijdens de verzameling van het exsudaat onthullen. In alle exudaten is sucrose de meest voorkomende metaboliet. Dit is het meest duidelijk na een verzameling van één uur.Na vijf uur is de verhouding tussen sucrose en fructose echter licht verminderd. Wanneer hetzelfde exsudaat gedurende één uur wordt verzameld en vervolgens nog vier uur op de bench blijft staan, is de verhouding tussen sucrose en fructose in veel grotere mate verminderd. Dit suggereert dat actieve enzymen in de flegm-exsudaten leiden tot afbraak van sucrose bij kamertemperatuur.Bovendien is het feit dat continue collectie gedurende vijf uur slechts een lichte afname in de sucrose-fructose-ratio laat zien, consistent met bevindingen dat phloembelading en het transport van moleculen van begeleidende cellen naar de zeefelementen kunnen doorgaan tijdens de exudatie, totdat het systeem zijn vitaliteit verliest. Lipiden in de phloeme-exudaten en bijgevolg lipidensignalering over lange afstand zijn een relatief recent onderzoeksveld in de plantwetenschappen. Vanwege hun hydrofobe aard zijn lipiden slechts in lage concentraties aanwezig en kunnen ze gebonden zijn aan andere moleculen voor solubilisatie.Toch maakt de door EDTA gefaciliteerde exudatie het mogelijk om voldoende materiaal te verzamelen om de stroom en lipiden van verschillende plantensoorten te visualiseren en te identificeren. Zoals hier wordt getoond, is het mogelijk om verschillende lipidensoorten te scheiden met behulp van dunne-laagchromatografie. LCMS maakt het mogelijk om verschillende lipidensoorten te identificeren en veranderingen in de lipidenprofielen van verschillende genotypen of behandelingen te monitoren.Dit maakt het mogelijk om de rol van lipiden tijdens de plantontwikkeling en stressrespons te bestuderen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in slechts drie uur worden uitgevoerd, mits dit correct gebeurt. Voor de meeste monsters adviseren wij echter een verzameltijd van vijf tot acht uur.In dit geval wordt aanbevolen om vroeg in de ochtend te beginnen met de oogst van de bladeren. Deze procedure kan worden aangepast voor andere planten en kan leiden tot de ontdekking of bevestiging van nieuwe stroomverbindingen. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de PDL's na het eerste uur grondig in de gaten te houden om het EDTA te verwijderen en om de bladeren niet uit te knijpen om contaminatie met de inhoud van andere cellen te voorkomen.Bovendien beschermt het dragen van handschoenen uw monsters tegen contaminanten die u vanaf uw huid zou kunnen overbrengen. Om contaminatie te voorkomen, dient u de juiste controles voor eiwit-, RNA- of metabolietmonsters te gebruiken. Voorgestelde controles zijn vermeld in het tekstprotocol. Deze methode heeft ons in staat gesteld nieuwe inzichten te verkrijgen in de samenstelling van de plantenstroom.We waren in staat om verschillende lipiden in het exudaat van de vorm te identificeren, die niet werden verwacht in de waterige omgeving van de bodem. Dit leidde ertoe dat wij en anderen het concept van lipide-signalering over lange afstand introduceerden, wat inmiddels is uitgegroeid tot een boeiend nieuw onderzoeksveld binnen de implantatenstudie.

collection-analysis-arabidopsis-phloem-exudates-using-edta

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

Hier beschrijven we een robuuste werkwijze voor de fractionering van plantaardige plasmamembranen in reinigingsmiddelenbestendige en detergent oplosbare membranen gebaseerd op een mengsel van gelabelde en in vivo volledig 15N gemerkt Arabidopsis thaliana celculturen. De procedure wordt toegepast voor vergelijkende proteomics studies om signalering processen te begrijpen.

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Schorsing Celkweken

Kristalline cellulose is een belangrijk bestanddeel van de plantencelwand. De kwantificering ervan op cellulair niveau is echter technisch uitdagend. Hier beschrijven we het gebruik van gepolariseerd lichttechnologie en worteldoorsneden om informatie te verkrijgen over de samenstelling van de celwand met een spatie-temporelle resolutie.

Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots aan Tissue-specifieke celwand Wijzigingen Monitor

De circadiane klok regelt ongeveer een derde van de Arabidopsis transcriptoom, maar het percentage van genen die te gebruiken bij tijdwaarneming blijft onbekend. Hier visualiseren we een methode om circadiane fenotypes snel te beoordelen in welke mutant lijn van Arabidopsis met behulp van lichtgevende beeldvorming van een circadiaan reporter tijdelijk tot expressie gebracht in protoplasten.

Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter

Hier presenteren we een protocol voor het analyseren van de samenstelling van de eiwitten van groot eiwit: eiwit en eiwit: nucleïnezuur complexen van koolzaad (B. napus) floëem afgescheiden met behulp van een 3D polyacrylamide-gel elektroforese (pagina) aanpak combineren blauw native (BN) met twee denatureren pagina's, gevolgd door massaspectrometrische identificatie.

Floëem Sap bemonstering van Brassica napus voor 3D-pagina van eiwit en Ribonucleoprotein complexen

Presenteren we een protocol voor snelle screening van milieu monsters voor siderofoor potentieel bijdragen aan micronutriënt biologische beschikbaarheid en omzet in terrestrische systemen.

Siderofoor High-throughput Screening van milieu monsters: plantaardige weefsels, Bulk bodems en rhizosfeer bodems

Hier wordt een fosfaatprotemische benadering gepresenteerd, namelijk stop and go extractietip op basis van phosfoproteom, die een hoge doorvoer en diepe dekking van Arabidopsis phosphoproteome biedt. Deze aanpak definieert het overzicht van osmotische stresssignalering in Arabidopsis.

Fosfaatprotemische strategie voor profilering osmotische stresssignalering in Arabidopsis

De afscheiding van wortelexsudaten is meestal een externe ontgiftingsstrategie voor planten onder stressomstandigheden. Dit protocol beschrijft hoe de impact van xenobiotica op alfalfa kan worden beoordeeld via niet-gerichte metabolomische analyse.

Verzameling van alfalfawortelexsudaten om de impact van di (2-ethylhexyl) ftalaat op de productie van metabolieten te bestuderen

Een verbeterde methode om pollenhydratatieprofielen in Arabidopsis thaliana te meten wordt hier beschreven. De nieuwe methode biedt een hogere resolutie, is niet-invasief en is zeer reproduceerbaar. Het protocol vertegenwoordigt een nieuw hulpmiddel voor een fijnere ontleding van de processen die de vroege stadia van bestuiving reguleren.

Een hoge resolutie, enkelkorrelig, in vivo pollenhydratatiebioassay voor Arabidopsis thaliana

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om extracellulaire vesikels (EV's) uit Arabidopsis thaliana-bladeren te isoleren ter ondersteuning van downstream moleculaire en functionele analyses.

Isolatie en zuivering van extracellulaire plantblaasjes uit Arabidopsis-bladeren met behulp van een geoptimaliseerde apoplastische wasverzamelmethode

Leer de EDTA-gefaciliteerde methode voor het verzamelen van floëemexsudaat uit Arabidopsis voor metaboliet- en eiwitanalyse. Deze techniek helpt onderzoekers bij het bestuderen van plantensignalering.

Verzameling en analyse van

Meer video's verkennen