Verzameling en analyse van

Het algemene doel van deze procedure is het verzamelen van floëmexudaat van Arabidopsis of andere planten om de inhoud te analyseren of de aanwezigheid van verbindingen binnen de floëemstroom te bevestigen. Dit wordt bereikt door eerst het kroonblad door te snijden en te incuberen in kalium-EDTA om het dichtsluiten van de zeefelementen te voorkomen. De tweede stap is om het kroonblad grondig te wassen om elk resterend EDTA te verwijderen dat de daaropvolgende analyse kan verstoren en ook cellen kan beschadigen bij langdurige blootstelling.

Vervolgens worden de flow EM-exudaten opgevangen in water. De laatste stap is het voorbereiden van monsters voor daaropvolgende analyse via L-C-M-S-G-C-M-S gel-elektroforese en dunne-laagchromatografie. Uiteindelijk kan de door EDTA gefaciliteerde phem-exudatie worden gebruikt om phem-inhoud zoals metabolieten en lipiden, eiwitten of RNA's te analyseren en te bevestigen.

Planten kunnen niet ontsnappen aan ongunstige omstandigheden. Als gevolg hiervan hebben ze zeer efficiënte en snelle systemen nodig om omgevingssignalen door de gehele plant te transporteren en te reageren door de ontwikkeling aan te passen. Een van deze signaleringspaden is de plantenstroom, waarvan de samenstelling vrij complex is om te begrijpen.

We maken gebruik van de EDTA-gefaciliteerde stroomsedatie voor het verzamelen en analyseren van stroominhoud. Deze methode is oorspronkelijk in Perilla ontwikkeld door King en collega's, maar kan eenvoudig worden aangepast voor andere soorten. De procedure zal worden gedemonstreerd door Elena en US, beiden undergraduate studenten uit mijn laboratorium, voorafgaand aan de start van deze procedure.

Kweek Arabidopsis-planten gedurende vier tot zes weken in groeikamers met een fotoperiode van 12 uur tot de dag van verzameling. Verdun een eerder bereide 100 millimolaire kalium-EDTA-oplossing met water tot een uiteindelijke concentratie van 20 millimolair. Vul vervolgens twee glazen schalen met een diameter van 7 tot 15 centimeter voor de helft met de 20 millimolaire kalium-EDTA-oplossing.

Vul na voltooiing 1,7 milliliter reactiebuisjes met 1,4 milliliters van de 20 millimolaire kalium-EDTA-oplossing. Vul vervolgens een gelijk aantal reactiebuisjes met 1,4 milliliters Millipore-water. Haal na het verwijderen van de vier tot zes weken oude planten uit de groeikamers de rozetbladeren oogst door ze met een scheermesje aan de basis van het blad dicht bij het centrum van de rozet af te snijden.

Plaats de bladeren onmiddellijk in de schalen met 20 millimol potassium EDTA, waarbij het gesneden uiteinde van de bladeren in de oplossing wordt ondergedompeld. Zodra er 15 bladeren van drie tot vier planten zijn verzameld, worden deze voorzichtig op elkaar gestapeld zodanig dat de gesneden uiteinden op één lijn liggen. Snijd de basis van de bladeren opnieuw af en rol de bladeren voorzichtig op.

Voeg vervolgens de opgerolde bladeren voorzichtig toe aan een van de reactiebuisjes met 20 millimolar kalium-EDTA voor de collectie van het exsudaat. Bekleed in het donker de bodem van een grote ondiepe schaal met natte papieren handdoeken. Plaats het rek met de gevulde reactiebuisjes in de schaal en doe deze in een zwarte plastic zak met sleuven voor beluchting.

Plaats vervolgens de gehele opstelling in een kast voor de collectie van exudaten. Bekleed de bodem van een doorzichtige plexiglascontainer met natte papieren handdoeken. Plaats het rek met de reactiebuisjes gevuld met bladeren in de container en sluit deze.

Na het verwijderen van het rek uit de houder, een uur later, worden de bladeren uit de reactiebuisjes gehaald. Was de bladeren grondig met gedestilleerd water om alle EDTA te verwijderen. Plaats de bladeren onmiddellijk in de reactiebuisjes met millipore-water en plaats ze terug in de bevochtigde houders voor de opvang van exudaten na het verwijderen van het rek uit de bevochtigde houder.

Haal vijf tot acht uur later de bladeren uit de buisjes, vries vervolgens de stroomexudaten in vloeibare stikstof en bewaar ze in een vriezer op -80 °C. Voor verdere analyse op de volgende dag worden de monsters ontdooid ter voorbereiding op de lipidenanalyse. Neem vervolgens twee tot drie monsters en voeg een gelijke hoeveelheid chloroform en methanol toe aan de gecombineerde oplossing.

Vortex het mengsel gedurende enkele seconden. Centrifugeer vervolgens het monster vier minuten bij 400 gs. Verzamel na voltooiing de onderste organische fase in een glazen buis nadat de partitie met de bovenfase nog drie keer is herhaald, droog de gecombineerde organische fasen onder een stroom stikstof en dien deze in voor dunlaagchromatografie en LCMS-analyse.

Deze methode maakt het mogelijk om voldoende phem-exudaten te oogsten om phem-gelokaliseerde eiwitten te identificeren en de veranderingen in hun gehalte als reactie op ontwikkeling of stress te bepalen. In sommige gevallen kunnen onderzoekers proteinaseremmers gebruiken om degradatie van eiwitten te voorkomen. Zoals hier wordt getoond, is de abundantie van eiwitten zeer laag, maar hun niveau is voldoende voor daaropvolgende proteomics-experimenten.

Bevindingen uit LCMS- of western blot-analyses in cucurbitten suggereren dat het doorsnijden van de STENGEL leidt tot een verstoring van de balans in het waterpotentieel en een daaropvolgende instroom van water en mogelijke contaminanten vanuit de omgeving. Echter, verzamelperiodes variërend van één tot acht uur hebben geen invloed op het eiwitprofiel en de samenstelling van de flow M inOpSys. De hoeveelheid verzameld eiwit en het patroon van de aangetroffen eiwitten variëren per soort en behandeling.

Als gevolg hiervan kunnen eiwitsignalen worden gevisualiseerd, geïdentificeerd en gevolgd. mRNA en microRNA's kunnen met deze methode eveneens worden geïdentificeerd in flom-exudaten. Behandeling met een RNA-inhibitor is echter noodzakelijk om degradatie van het mRNA tijdens de verlengde exudatietijd te voorkomen.

Aangezien de C-elementen geen functionele chloroplasten bevatten, kunnen rubis-, kleine of grote subunit-mRNA's als negatieve controles worden gebruikt, terwijl bekend pH flu m gelokaliseerd mRNA, zoals ubiquitine-conjugerend enzym, als positieve controle kan dienen. Op dezelfde manier kunnen suikers of kleine metabolieten worden geanalyseerd met behulp van GCMS of LCMS. Er moet worden vermeld dat de phem-exudaten een groot aantal functionele enzymen bevatten, waaronder bijna de volledige glycolytische route.

Daarom kan het gebruik van verschillende tijdspunten metabole processen tijdens de verzameling van het exsudaat onthullen. In alle exudaten is sucrose de meest voorkomende metaboliet. Dit is het meest duidelijk na een verzameling van één uur.

Na vijf uur is de verhouding tussen sucrose en fructose echter licht verminderd. Wanneer hetzelfde exsudaat gedurende één uur wordt verzameld en vervolgens nog vier uur op de bench blijft staan, is de verhouding tussen sucrose en fructose in veel grotere mate verminderd. Dit suggereert dat actieve enzymen in de flegm-exsudaten leiden tot afbraak van sucrose bij kamertemperatuur.

Bovendien is het feit dat continue collectie gedurende vijf uur slechts een lichte afname in de sucrose-fructose-ratio laat zien, consistent met bevindingen dat phloembelading en het transport van moleculen van begeleidende cellen naar de zeefelementen kunnen doorgaan tijdens de exudatie, totdat het systeem zijn vitaliteit verliest. Lipiden in de phloeme-exudaten en bijgevolg lipidensignalering over lange afstand zijn een relatief recent onderzoeksveld in de plantwetenschappen. Vanwege hun hydrofobe aard zijn lipiden slechts in lage concentraties aanwezig en kunnen ze gebonden zijn aan andere moleculen voor solubilisatie.

Toch maakt de door EDTA gefaciliteerde exudatie het mogelijk om voldoende materiaal te verzamelen om de stroom en lipiden van verschillende plantensoorten te visualiseren en te identificeren. Zoals hier wordt getoond, is het mogelijk om verschillende lipidensoorten te scheiden met behulp van dunne-laagchromatografie. LCMS maakt het mogelijk om verschillende lipidensoorten te identificeren en veranderingen in de lipidenprofielen van verschillende genotypen of behandelingen te monitoren.

Dit maakt het mogelijk om de rol van lipiden tijdens de plantontwikkeling en stressrespons te bestuderen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in slechts drie uur worden uitgevoerd, mits dit correct gebeurt. Voor de meeste monsters adviseren wij echter een verzameltijd van vijf tot acht uur.

In dit geval wordt aanbevolen om vroeg in de ochtend te beginnen met de oogst van de bladeren. Deze procedure kan worden aangepast voor andere planten en kan leiden tot de ontdekking of bevestiging van nieuwe stroomverbindingen. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de PDL's na het eerste uur grondig in de gaten te houden om het EDTA te verwijderen en om de bladeren niet uit te knijpen om contaminatie met de inhoud van andere cellen te voorkomen.

Bovendien beschermt het dragen van handschoenen uw monsters tegen contaminanten die u vanaf uw huid zou kunnen overbrengen. Om contaminatie te voorkomen, dient u de juiste controles voor eiwit-, RNA- of metabolietmonsters te gebruiken. Voorgestelde controles zijn vermeld in het tekstprotocol. Deze methode heeft ons in staat gesteld nieuwe inzichten te verkrijgen in de samenstelling van de plantenstroom.

We waren in staat om verschillende lipiden in het exudaat van de vorm te identificeren, die niet werden verwacht in de waterige omgeving van de bodem. Dit leidde ertoe dat wij en anderen het concept van lipide-signalering over lange afstand introduceerden, wat inmiddels is uitgegroeid tot een boeiend nieuw onderzoeksveld binnen de implantatenstudie.