Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Het algemene doel van deze procedure is om levensvatbare cardiomyocyten te isoleren uit menselijke ventrikelexemplaren met pathologieën en hun functionele veranderingen te karakteriseren. Dit wordt bereikt door eerst verse ventrikeelmonsters snel te verzamelen en te fijn te hakken in een ijskoude cardioplege oplossing om overmatige weefseldegeneratie en celbeschadiging te voorkomen. De tweede stap is het uitvoeren van een stapsgewijze digestie van de myocardiale stukjes met behulp van een op maat gemaakt digestieapparaat en enzymatische oplossingen.

In zes cycli wordt de celbevattende buffer bij elke cyclus in een buis verzameld en verdund met een celconserveringsoplossing. De laatste stap is om de cellen in de zes buizen te resuspenderen in een kleiner volume standaard fysiologische oplossing met normale calciumconcentraties om de functionele karakterisering uit te voeren. Tot slot worden patchclamp-metingen van actiepotentialen en gelijktijdige beoordeling van intercellulair calcium met behulp van fluorescerende kleurstoffen gebruikt om de veranderingen in actiepotentiaalduur en intracellulaire calciumcycli in cardiomyocyten van patiënten met hypertrofische cardiomyopathie aan te tonen.

Het belangrijkste voordeel van DYS ten opzichte van een 16-methode, zoals de standaard chunk dejection-methode, is dat we in combinatie met een enzymoplossing gebruikmaken van een op maat gemaakt digestieapparaat, dat dankzij zijn siliconen schrapers een gezamenlijke dissociatie van variabele cellen mogelijk maakt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van de cardiologie, zoals de vraag hoe de bekende moleculaire en structurele remodeling die geassocieerd wordt met hartaandoeningen zich vertaalt in veranderingen van individuele cardiomyocyten die met onze methode geanalyseerd en met specifieke geneesmiddelen gericht kunnen worden. De implicaties van deze techniek strekken zich dus uit tot de therapie van genetische hartaandoeningen, zoals hypertrofische cardiomyopathie.

In feite kan deze methode worden gebruikt om nieuwe neuropathische benaderingen te testen op ventriculaire cardiomyocyten van patiënten met hypertrofische of ischemische hartziekten die een hartoperatie hebben ondergaan. We kregen aanvankelijk het idee voor deze methode bij het vergelijken van de analogie tussen menselijke arteriespecimens en ventriculaire biopsieën die tijdens een hartoperatie zijn afgenomen. Begin deze procedure door 40 milliliters cardioplegische oplossing in een buis van 50 milliliter te gieten en bewaar deze in ijs voor het transport van het specimen van de operatiekamer naar het laboratorium voor celisolatie; transporteer het specimen snel naar het laboratoriumgebied en start de verwerking van het specimen binnen 10 minuten na de excisie van het specimen.

Neem het volgende collectieve ventriculaire myocardspecimen uit de operatiekamer direct na excisie. Was het specimen met ijskoude CP-oplossing en bewaar het in de buis terwijl het specimen in ijskoude CP-buffer blijft. Verwijder daarna zorgvuldig de endocardiale fibrotische laag met een fijne schaar.

Snijd het myocardweefsel in kleine stukjes van twee tot drie millimeter lang, met een totale hoeveelheid ventriculair myocard tussen 100 mg en 1 g per isolatie. Nadat de stukjes zijn overgeplaatst naar de schraapkamer van het digestieapparaat, wordt de CP-buffer in de kamer vervangen door koud, calciumvrije dissociatiebuffer. Plaats vervolgens het digestieapparaat in een thermostatisch bad.

Stel het bad in op 37,5 °C en zet het aan. Zet vervolgens de motor van het digestieapparaat aan en stel de rotatiesnelheid in op één omwenteling per seconde. Voer drie wascycli uit met DB en vervang de oplossing in de kamer elke acht minuten door schone, zuurstofverzadigde DB bij 37 °C.

Bereid vervolgens enzymbuffer één door 250 units per milliliter collagenase type vijf en vier units per milliliter protease type 24 aan de DB-oplossing toe te voegen. Bereid daarna enzymbuffer twee door 250 units per milliliter collagenase toe te voegen.

Voeg vijf van de DB-oplossing oxygenate EB one toe en warm dit op tot 37 °C. Voer vervolgens twee cycli van 12 minuten digestie uit in het roterende digestieapparaat met drie milliliter 100% geoxygeneerde EB one bij 37 °C. Verwijder de oplossing door middel van pipetaspiratie en gooi deze na elke cyclus weg.

Bereid vervolgens zes buisjes van 15 milliliter voor voor de celverzameling en 80 milliliter van een vier graden Celsius craft brew-oplossing voor het elueren van de buffers oxygenate EB two en warm deze op tot 37 graden Celsius. Voer vervolgens een eerste digestiecyclus van 15 minuten uit met drie milliliter 100% oxygenated EB two bij 37 graden Celsius. Verzamel na de digestiecyclus de oplossing die de eerste geassocieerde myocyten bevat in een buisje van 15 milliliter en verdun de celsuspensie met 12 milliliter koude KB-oplossing.

Bewaar de buis plat bij kamertemperatuur, voer vijf andere digestiecycli van 12 minuten uit met drie milliliter EB twee bij 37 °C en verzamel de myocytenbevattende buffer na elke cyclus in een conische buis van 15 milliliter. Vergeet niet om bij elke cyclus de verzamelde drie milliliter buffer te verdunnen met 12 milliliter KB-oplossing. Bewaar aan het einde de zes celbevattende buizen bij kamertemperatuur.

Voeg in deze stap één milligram per milliliter bovine serum albumin toe aan 20 milliliters calciumvrije tyro-buffer. Filtreer vervolgens de oplossing en centrifugeer daarna de zes kegelvormige buisjes met myocardcellen bij 100 g gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant om de myocardcellen te laten bezinken en resuspendeer de cellen in elk buisje met een variabele hoeveelheid BSA-bevattende TB bij kamertemperatuur.

Verhoog geleidelijk de calciumconcentratie in de cel met buffer door in de eerste en tweede stap kleine hoeveelheden van een 100 millimolaire per liter calciumchloride-oplossing toe te voegen. De calciumconcentratie wordt respectievelijk verhoogd naar 50 micromolaire per liter en 100 micromolaire per liter. De volgende stappen voor de toevoeging van calcium worden elke vijf minuten uitgevoerd, waarbij de concentratie bij elke stap met 100 micromolaire per liter wordt verhoogd tot een eindconcentratie van 0,9 millimolaire per liter.

Om de opbrengst van de isolatieprocedure te beoordelen, brengt u 0,5 milliliters van de myocytenbevattende oplossing over naar de glazen bodemkamer van een microscoop. Evalueer 15 microscopievelden bij een objectiefvergroting van 10 x en bereken het percentage gezonde myocyten, zoals de staafvormige cellen met duidelijke striaties en zonder significante inclusies. De verwachte opbrengsten moeten rond de 20% liggen om de functionele beoordeling van menselijke cardiomyocyten aan te tonen, inclusief gelijktijdige registraties van actiepotentialen en intracellulaire calciumstromen.

Bereid eerst de pipetvloeistof voor patchclamp-experimenten in geperforeerde patchconfiguratie. Voeg vervolgens 1,8 millimol calciumchloride toe aan calciumvrij tb. Gebruik deze vloeistof voor superfusie van cardiomyocyten tijdens patchclamp-fluorescentie-experimenten.

Breng vervolgens één milliliter cel-suspensie over naar een 1,5 milliliter buisje en voeg 10 micromolair per liter flu fort en 10 microliter power load toe. Incubeer het concentraat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een horizontale positie. Plaats het buisje daarna in een verticale positie en laat de cellen vijf minuten bezinken.

Pipette vervolgens het supernatant af en resuspendeer de celpellet in calciumhoudende tb. Breng 25 milliliters van de celsuspensie over naar een kleine, temperatuurgecontroleerde op een microscoop gemonteerde registratiekamer. Perfuseer door zwaartekracht met een verwarmd micro-perfusiesysteem met een stroomsnelheid van 0,3 milliliters per minuut bij 37 °C.

Bereid met een micropipettrekker patchclamp-pipetten voor met een tipdiameter van drie tot vijf µm en een weerstand van drie tot 4,5 MΩ wanneer deze zijn gevuld met PS. Voeg vervolgens amfotericine B toe aan PS in een concentratie van 250 µg/mL en gebruik dit om de elektroden te vullen; monteer daarna de elektrode op de pipethouder. Selecteer vervolgens een Ron-vormige cel met duidelijke striaties en zonder inclusies.

Vorm de giga-seal en wacht vijf tot 10 minuten tot de toegangsweerstand onder de 20 ohm daalt. Wek vervolgens actiepotentialen op in current clamp-modus door gebruik te maken van korte pulsen bij verschillende stimulatiefrequenties. Schakel tijdens de registratiefase de bright field-verlichting in op 492 nanometer en detecteer Fluor fort fluorescentie bij 505 tot 520 nanometer.

Verwerf vervolgens de fluorescentie- en membraanpotentialsignalen. Deze figuur toont de veranderingen in actiepotentialen in ventriculaire cardiomyocyten van de HCM-monsters. Hier zijn de representatieve supergeponeerde actiepotentialen opgewekt bij 0,2 hertz, 0,5 hertz en één hertz van een controlemyocyt en een HCM-myocyt.

De over elkaar heen gelegde actiepotentialen bij 0,5 hertz van een controlemyocyt. Er wordt getoond hoe dit eruitziet in afwezigheid en aanwezigheid van 10⁻⁷ M isoproterenol, en hier is het representatieve spoor van het membraanpotentiaal van een cardiomyocyt van een HCM-patiënt, waarop verschillende spontane depolarisaties (early after depolarizations) te zien zijn. De figuur toont de veranderingen in de calciumtransiënt in ventriculaire cardiomyocyten uit de HCM-monsters.

Hier zijn de representatieve gesuperponeerde calciumtransiënten die werden opgewekt tijdens stimulatie bij 0,2 hertz via de patchpipet in een controlemyocyten en een HCM-cel. De kinetiek van calciumtransiënten in HCM- en controlecardiomyocyten op verschillende tijdstippen worden getoond, en hier zijn de representatieve lange traces die het intracellulaire calcium tijdens stimulatie bij drie verschillende frequenties laten zien, wat het verhoogde diastolische calcium bij hoge pacing-snelheden in de HCM-myocyten benadrukt. Deze figuur toont de aanvullende experimentele toepassingen met menselijke ventriculaire myocyten.

De representatieve over elkaar heen gelegde traceringen die de L-type calciumstroom tonen, geregistreerd bij verschillende membraanspanningen, zijn links afgebeeld; rechts is de gemiddelde piekdensiteit van de L-type calciumstroom van 18 cellen geïsoleerd uit HCM-monsters bij verschillende membraanspanningen weergegeven, en hier is de intracellulaire calciumtracering getoond die is geregistreerd van een ventriculaire myocyt tijdens elektrische veldstimulatie bij één hertz. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de procedure kort na de verzameling van het specimen uit de operatiekamer te starten om de levensvatbaarheid te waarborgen. Volg deze procedure om menselijke ventriculaire cardiomyocyten te isoleren. Andere methoden kunnen worden uitgevoerd, zoals levende confocale microscopie of immunochemie, en dit zal cruciaal zijn om fundamentele vragen te beantwoorden, zoals bijvoorbeeld hoe de subcellulaire lokalisatie van membraanstructuren en calciumrelease-eenheden is veranderd bij hartaandoeningen na diens ontwikkeling.

Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt in de cellulaire cardiologie om functionele abnormaliteiten in ventriculaire cardiomyocyten te bestuderen en om het potentiële nut van nieuwe therapeutische opties te testen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u levensvatbare enkelvoudige cardiomyocyten kunt isoleren uit menselijke monsters en hoe u de celfunctie onder verschillende omstandigheden kunt karakteriseren.