Multilayer Montage voor langdurig licht Sheet Microscopie van zebravis
27 februari 2014
De ontwikkeling van de zebravis kan over dagen met licht blad microscopie wanneer embryo's zijn ingebed in optisch heldere polymeer buizen met een lage concentratie agarose worden gevolgd.
Het algemene doel van deze procedure is het mounten van een zebravisembryo voor langdurige in vivo light-sheet microscopie. Dit wordt bereikt door eerst een gefluorideerde ethyleenpropyleen- of FEP-buis te reinigen en deze te coaten met methylcellulose. Vervolgens wordt het betreffende zebravisembryo gecoat.
Vervolgens wordt het embryo eerst overgebracht naar gesmolten agarose en daarna naar de gecoate FEP-buis. Ten slotte wordt de onderkant van de buis afgesloten met een aros-stop en wordt de oriëntatie van het gemonteerde embryo zorgvuldig gecontroleerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die de ongestoorde ontwikkeling van zebravisembryo's over meerdere dagen laten zien met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie via in vivo light sheet microscopie.
Het belangrijkste voordeel ten opzichte van bestaande technieken is dat we nu zebravisembryo's over meerdere dagen kunnen observeren en niet slechts enkele uren. Deze methode kan waardevolle inzichten bieden in de langetermijn-embryogenese van de zebravis met behulp van light-sheet microscopie. Het kan ook worden toegepast op andere kleine organismen, zoals kleine mariene organismen.
Het kan ook worden gebruikt in combinatie met andere microscopietechnieken, zoals optische projectietomografie, widefield-microscopie of confocale microscopie. Personen die onbekend zijn met deze methode kunnen tegen problemen aanlopen, omdat het protocol enkele tijdskritische stappen bevat en het bepalen van de uiteindelijke positie van het embryo enige expertise vereist. Om een FEP-buis voor te bereiden, dient deze eerst te worden gereinigd door herhaaldelijk door te spoelen met 1 M natriumhydroxide. Plaats de buis vervolgens in een centrifugebuis van 50 ml gevuld met 0,5 M natriumhydroxide en behandel deze 10 minuten lang met ultrasoon geluid.
Breng de polymeerbuis over naar een klein bakje met gedestilleerd gedeïoniseerd water en spoel deze door. Volg dit daarna op met een spoeling met 70% ethanol voordat de buis wordt overgebracht naar een schone centrifugebuis. Met ethanol ultras.
Sonicate de buis gedurende 10 minuten voordat u deze overbrengt naar een klein bassin met gedestilleerd gedeïoniseerd water om deze te spoelen. Snijd de schone FEB-buis vervolgens in stukken van drie centimeter lang en recht deze indien nodig. Bewaar de gereinigde buizen in een nieuwe buis van 50 milliliter gevuld met gedestilleerd gedeïoniseerd water.
Bereid de Trica-stamoplossing. 3% methylcellulose en zowel 1,5% als 0,1% Aros volgens het tekstprotocol. Smelt 1,5% agarro en giet dit in een Petrischaal om een laag met een dikte van ongeveer twee millimeter te vormen.
Verzamel zebravissenembryo's in het gewenste stadium die het gekozen fluorescentiegen positief hebben tot expressie gebracht en breng deze onder een stereomicroscoop over naar een nieuwe schaal met E3-medium. Gebruik twee scherpe pincetten om de embryo's voorzichtig te onchorioneren; gebruik één pincet om het chorion vast te houden en het tweede pincet om het open te scheuren en te verwijderen voor het uitvoeren van multi-layer mounting. Bevestig met handschoenen aan beide handen een stompe canule aan een spuit.
Voer de canule voorzichtig ongeveer drie millimeter in één uiteinde van een gereinigd stuk FEP-buis in. Dompel vervolgens het vrije uiteinde van de FEP-buis in 3% Methylcellulose en vul de buis met de oplossing. Druk daarna langzaam op de spuit om de methylcellulose vrij te geven met behulp van E three-medium en herhaal de stappen van het dompelen en uitstoten.
Verwarm ondertussen in een warmteblok één aliquot van 0,1%aros tot 70 °C. Vortex de reactiebuis kort voordat deze wordt overgebracht naar een warmteblok dat is ingesteld op 38 °C. Laat de buis na het verwarmen kort afkoelen, voeg trica toe tot een eindconcentratie van 133 tot 200 mg/L en vortex.
Gebruik opnieuw een glazen Pasteurpipet. Breng een gecoat embryo over naar de reactiebuis met de voorverwarmde aros, waarbij zo min mogelijk E3 wordt overgebracht. Neem met de FEP-buis en de bevestigde spuit voorzichtig een kleine hoeveelheid aros op voordat het embryo wordt opgenomen en vul de buis volledig met aros.
Het embryo moet aan één van de uiteinden van de buis worden geplaatst, waarbij de kop naar de opening is gericht. Om lekken van de inhoud te voorkomen, moet de buis in een horizontale positie worden gehouden om deze af te sluiten. Gebruik een scheermesje om het embryo van de canule af te snijden.
Houd de buis vervolgens loodrecht en steek het uiteinde er langzaam door de gehele laag van 1,5%aros, waarna u deze licht draait. Om uitdroging te voorkomen, bewaart u het gemonteerde specimen in een reactiebuis van 1,5 milliliter gevuld met E three medium vóór de beeldvorming. Controleer of de vis in de FEP-buis recht is gepositioneerd en of de kop direct op de plug rust voor de beeldvorming.
Voeg trica toe aan het medium in de beeldvormingskamer. Hier wordt een transgene K-G-R-L-G-F-P zebravissenbel embryo getoond, één dag na bevruchting, dat gedurende twee dagen is afgebeeld om de ontwikkeling van de vasculatuur te observeren.
De zebravis wordt niet beperkt door het montage-medium en kan zich normaal ontwikkelen. De kop komt bijvoorbeeld omhoog. De staart strekt zich uit en vasculaire uitlopers verschijnen ongehinderd.
Deze techniek kan in 10 minuten worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd en alle materialen direct beschikbaar zijn. Denk eraan om alle belangrijke stappen zonder vertraging uit te voeren. Houd alle oplossingen schoon, aangezien vuil de uiteindelijke beeldkwaliteit kan verslechteren.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het mounten van zebravisembryo's voor langdurige in vivo light sheet microscopie. De techniek maakt het mogelijk om de ontwikkeling van zebravis gedurende meerdere dagen te observeren met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Zebravissen zijn een modelorganisme voor het bestuderen van de ontwikkeling van gewervelden.
- Traditionele beeldvormingstechnieken zijn beperkt tot korte observatieperioden.
- Light sheet-microscopie biedt een niet-invasieve manier om levende embryo's te observeren.
- Het inbedden van embryo's in een geschikt medium is cruciaal voor een succesvolle beeldvorming.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor langetermijnbeeldvorming van zebravissenembryo's.
- Het verbeteren van het begrip van de embryogenese door continue observatie.
- Het verschaffen van inzichten die toepasbaar zijn op andere kleine organismen.
Gebruikte methoden
- Het reinigen en voorbereiden van FEP-buisjes voor het monteren van embryo's.
- Het coaten van embryo's met methylcellulose en het inkapselen ervan in agarose.
- Het gebruik van light-sheet microscopie om ontwikkelingsprocessen vast te leggen.
- Het waarborgen van de juiste positionering van embryo's voor optimale beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle langetermijnbeeldvorming van zebravissembryo's over meerdere dagen.
- Observatie van normale ontwikkelingsprocessen zonder verstoring.
- Demonstratie van vasculaire ontwikkeling in transgene zebravis.
- De methode kan worden aangepast voor gebruik met andere microscopietechnieken.
Conclusies
- De ontwikkelde methode maakt een ongekende observatie van de embryogenese van zebravis mogelijk.
- Het biedt een waardevol instrument voor onderzoekers die de ontwikkelingsbiologie bestuderen.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar andere kleine aquatische organismen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Langetermijn in vivo imaging van zebravissenembryo's maakt mechanische risicoreductie van ontwikkelingspaden mogelijk en ondersteunt target-validatie in de vroege ontdekkingsfase. Deze mehrlaagse montagetechniek biedt een ziekte-relevant systeem voor het observeren van normale embryogenese met minimale verstoring, waardoor het voorspellende vertrouwen in fenotypische screening wordt vergroot. Het positioneert light-sheet microscopie als een schaalbare, reproduceerbare tool voor preklinische modelevaluatie en translationele biomarker-afstemming.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door real-time observatie van vasculaire en morfologische ontwikkeling in transgene zebravissen.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door ongestoorde embryogenese over meerdere dagen mogelijk te maken, waardoor het aantal fout-positieven in pathway-analyses wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Verbeteren van lead-identificatie door het verschaffen van kwantitatieve, longitudinale read-outs van ontwikkelingsprocessen onder blootstelling aan verbindingen.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor in optisch transparante FEP-buisjes voor downstream compound-screening met een consistente positionering van de embryo's.
- Reproduceerbaarheid: Standaardiseert de monsterpreparatie door gebruik van laagconcentratie agarose en een methylcellulosecoating, waardoor variabiliteit tussen replicaten wordt geminimaliseerd.
- Schaalbaarheid: Maakt multiplex imaging-opstellingen mogelijk dankzij een snel montageprotocol van 10 minuten en compatibiliteit met geautomatiseerde microscopieworkflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Biedt een op zebravis gebaseerd model voor het bestuderen van geconserveerde ontwikkelingspaden die van toepassing zijn op menselijke ziektemechanismen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen fundamenteel onderzoek en preklinisch werk door observatie van normale organogenese mogelijk te maken, wat biomarker-validatie in vivo ondersteunt.
- Risicogebaseerde besluitvorming: Faciliteert go/no-go-criteria door ontwikkelings toxiciteit of verstoring van signaalpaden onthullen via longitudinale beeldvorming.
Integratie van pipeline en workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische beoordeling, en ondersteunt iteratieve design-make-test-analyze-cycli in onderzoek in een vroeg stadium.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetests van genfunctie en pathway-activiteit mogelijk via niet-invasieve, hoge-resolutie time-lapse imaging van ontwikkelende embryo's.
- Screening: Levert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste fenotypische resultaten die geschikt zijn voor high-content screeningcampagnes waarbij ontwikkelingsendpunten vereist zijn.
- Analytiek: Genereert temporele en morfologische read-outs die statistische vergelijking van controlecondities en behandelde condities over verschillende tijdspunten ondersteunen.
- Translationeel onderzoek: Koppel aan preklinische validatie door fysiologische ontwikkeling te behouden, waardoor extrapolatie van bevindingen naar hogere vertebratenmodellen mogelijk is.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar montageplatform dat aanpasbaar is aan meerdere microscopiemodaliteiten en modelsystemen, waardoor de inspanning voor hervalidatie over projecten heen wordt verminderd.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets door mechanische ambiguïteit te verminderen via directe observatie van ontwikkelingsfenotypes.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid tussen laboratoria via gedefinieerde stappen voor buispreparatie, coating en embedding.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van ontwikkelingsgebreken mogelijk te maken, waardoor het risico op uitval in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen op basis van longitudinale ontwikkelingsprofilering in een context van het gehele organisme.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van zebravis, embryonale stadia en fluorescentiemicroscopie om een correcte montage en oriëntatie te garanderen.
- Is afhankelijk van toegang tot light-sheet microscopiesystemen en randapparatuur voor het reinigen van buisjes, sonicatie en het bereiden van oplossingen.
- Vereist standaardisatie tussen teams van oplossingsconcentraties (bijv. methylcellulose, agarose, Aros) en protocollen voor de voorbereiding van buisjes om de consistentie van de beelden te behouden.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het overbrengen van de methode naar andere kleine organismen, inclusief aanpassingen aan de diameter van het buisje en de viscositeit van de inbeddingsmatrix.
- Wordt beperkt door de eisen aan de optische helderheid van het montagebuisje en de noodzaak om particulaire contaminatie te vermijden die de beeldkwaliteit tijdens lange acquisities kan belemmeren.
