Name: Multilayer Montage voor langdurig licht Sheet Microscopie van zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Leer een multilayer montagetechniek voor langdurige lichtveldmicroscopie van zebravisembryo's. Deze methode maakt ongestoorde ontwikkelingsobservatie over meerdere dagen mogelijk met hoge resolutie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de Max-Planck-Gesellschaft, het Human Frontier Science Program (HFSP) en Boehringer Ingelheim Fonds voor financiering en ondersteuning.

1. Materiaal Voorbereiding <ol><li> Bereiding van FEP buizen <ol><li> Reinig de FEP-buis (figuur 2A) door te spoelen vloeistoffen (in de stappen hieronder aangegeven) door de buis en met een injectiespuit bevestigd met een stomp uiteinde canule (figuur 2B) Opmerking 1:.. Gebruik handschoenen tijdens de gehele procedure Noot 2: We raden snijden van de buis in stukken van ca.. 1 m lange reinigen die parallel. <ol><li> Spoel eerst de buis met 1 M NaOH herhaaldelijk. Vervolgens transfer de buis een centrifugebuis van 50 ml gevuld met 0,5 M NaOH en ultrasonicate voor 10 minuten. </li><li> Breng de polymeer buis om een klein bassin met DDH 2 O. Spoel de buis eerst met DDH 2 O en daarna met 70% EtOH. </li><li> Vervolgens brengen de FEP buis een nieuwe centrifugebuis met 70% EtOH. Ook ultrasonicate deze centrifugebuis gedurende 10 minuten. </li></ol></li><li> Snijd de schoongemaakte FEP buis in stukkenvan ongeveer 3 cm (een typische lengte voor gebruik bij de zebravis montage en imaging) en strijk ze indien nodig. Bewaar de schoongemaakte FEP buizen in een nieuwe centrifugebuis van 50 ml gevuld met DDH 2 O (figuur 2C). </li></ol></li><li> Voorbereiding van tricaïne stockoplossing <ol><li> Bereid 0,4% tricaïne voorraad-oplossing door het oplossen van 400 mg tricaïne (MS-222) in 97,9 ml DDH 2 O. Nadat het poeder volledig is opgelost, breng de pH op 7,0 met behulp van 2,1 ml 1 M Tris (pH 9,0). Bescherm de oplossing tegen licht. WINKEL aliquots bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Bereiding van 3% methylcellulose <ol><li> Bereid 3% methylcellulose-oplossing voor de binnenbekleding van de FEP buizen zoals hieronder beschreven. Verwarm E3 11 in een glazen fles ongeveer 60-70 ° C en voeg de juiste hoeveelheid methylcellulose poeder. Voeg een roerstaaf en roer bij 4 ° C. Zodra de oplossing wordt afgekoeld tot onder 30 ° C, voeg tricaïne oplossing tot een uiteindelijke concentration 100 mg / L. Blijf roeren bij 4 ° C gedurende de nacht. </li></ol></li><li> Bereiding van 1,5% en 0,1% agarose in E3 <ol><li> Los de juiste hoeveelheid laag smeltpunt agarose poeder in een bepaald volume van E3 in een glazen kolf. Verwarm het mengsel in een magnetron en schud af en toe, totdat de agarose oplossing lijkt homogeen, zonder enige resterende kristallen. </li><li> Bereid 1 ml aliquots van 0,1% agarose-oplossing in 1,5 ml reageerbuisjes. De monsters kunnen bij 4 ° C worden bewaard </li><li> Gebruik de 1,5% oplossing voor het bekleden van een plastic petrischaal. De dikte van de agarose laag moet ca. zijn. 2 mm. Nadat de agarose is gestold, voeg E3 medium bovenop de laag om te voorkomen drogen. De gecoate schaal kunnen bij 4 ° C worden bewaard </li></ol></li><li> Voorbereiding van de zebravis <ol><li> Houd zebravis (Danio rerio) volwassenen en embryo&#39;s bij 28,5 ° C en hen te behandelen volgens de vastgestelde protocollen 11,12. </li><li> Opgezet mannelijke en vrouwelijke vissen in de middag en ze te scheiden met behulp van een divider. Verwijder de verdeler de volgende ochtend naar de paring van de vis timen. </li><li> Het verzamelen van de embryo&#39;s in een schotel gevuld met E3 en onderzoeken ze met behulp van een stereomicroscoop. </li><li> Op 24 HPF (of de ontwikkelingsfase van uw interesse), selecteert u de zebravis embryo voor fluorescentie expressie en overdracht van de positieve naar een nieuw gerecht met verse E3. </li><li> Dechorionate zorgvuldig de embryo&#39;s met behulp van twee scherpe pincet (figuren 2D en 2E). Gebruik de eerste tang te grijpen en vast te houden het chorion en de tweede tang om het openscheuren en trek het Noot 1:. Voer deze stap met behulp van een stereomicroscoop. </li></ol></li></ol> 2. Multilayer Montage <ol><li> De FEP frameprotector <ol><li> Bevestig een stomp uiteinde canule aan een spuit. Plaats de canule zorgvuldig ongeveer 3 mm in een einde van een schoongemaakt en stukje. FEP buis (fig. 2F en 2G) Opmerking 1: Gebruik handschoenen en vermijd buigen of knijpen van de buis. </li><li> Dompel het vrije einde van de FEP buis in 3% methylcellulose en vul de buis met de oplossing. </li><li> Langzaam de methylcellulose vrij te maken door te drukken op de spuit. Gooi de oplossing. </li><li> Herhaal stap 2.1.2 en 2.1.3 met E3 Noot 1. Het gecoate buizen moeten worden gebruikt voor directe montage. </li></ol></li><li> Het overbrengen van de zebravis om de agarose <ol><li> Verwarm een ​​hoeveelheid van 0,1% agarose tot 70 ° C in een verwarmingsblok. Vortex de reactie buis kort en overbrengen naar een warmte-blok ingesteld op 38 ° C (Figuur 2H). </li><li> Neem de reageerbuis uit het vuur blok en laat het naar beneden even afkoelen. Voeg tricaïne tot een uiteindelijke concentratie van 133-200 mg / L en vortex opnieuw (figuur 2I). </li><li> Selecteer een van de dechorionated zebravis embryo&#39;s en Transfe. r het aan de reageerbuis met de voorverwarmde 0,1% agarose met een glazen Pasteur pipet (figuren 2J en 2K) Opmerking 1: Probeer zo weinig extra E3 overdracht mogelijk. </li></ol></li><li> Montage van de zebravis <ol><li> Neem de embryo met de spuit bevestigd FEP buis (figuur 2L). . De buis moet helemaal gevuld worden met 0,1% agarose, met het embryo zich dicht bij een van de uiteinden van de buis en met het hoofd wijzend naar de opening van de buis Opmerking 1: Zorg ervoor dat u het nemen van een aantal agarose alvorens de vis. Opmerking 2: Trek heel zachtjes op de spuit om luchtbellen te vermijden Noot 3:. Houd de buis in een horizontale oriëntatie om lekkage van de inhoud ervan (figuren 2M en 2N) te vermijden. </li></ol></li><li> Het aansluiten van de buis <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"src = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; Figuur 2. Multilayer bevestiging voor zebravis embryo&#39;s. A) gefluoreerde Ethyleen Propyleen (FEP) buisjes op een kabelhaspel voor de bereiding. B) Een spuit met een stomp uiteinde canule bevestigd. C) A schoongemaakt en FEP buis. D, E) Dechorionation van 24 HPF zebravis embryo&#39;s. F) Bevestiging van de buis naar de stomp uiteinde canule. G) De spuit met canule en de buis bevestigd. H) Een hoeveelheid van 0,1% agarose in een reageerbuisje terwijl overdraagt ​​aan een warmte-blok. I) vortexen van de gesmolten agarose. J) Opname van een dechorionated embryo met behulp van een glazen pipet. K) Overdracht van het embryo in de gesmolten agarose. L) Inname van het embryo met de omliggende agarose in de FEP buis. M, N) De zebravis embryo in de FEP buis . <strong&gt; O) Het snijden van de buis tussen monster en canule. P) Het aansluiten van de buis door het gebruik van een-agarose gecoate schaal. Q) Het embryo in de aangesloten buis. R) De definitieve monstervoorbereiding in een metalen houder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om Bekijk grotere afbeelding.</a> <ol><li> Gebruik een scheermesje aan de buis afgesneden van de canule (figuur 2O). </li><li> Langzaam stok het einde van de buis met de vis door de hele laag van 1,5% agarose in de plastic schotel aan de buis (figuur 2P) stekker Opmerking 1:. Vermijd de vorming van bellen en proberen een rechte plug oppervlak te verkrijgen door het houden van de . buis precies loodrecht op de agarose oppervlak Noot 2: Draai de tube iets naar een leuke plug verkrijgen. </li><li> Houd de gemonteerde model in een 1,5 ml reageerbuisje met de E3 om uitdrogen te voorkomen. Het monster is now klaar om te worden afgebeeld. Voor de beeldvorming, controleren of de vis zit bovenop de stekker (figuren 2Q en 2R). Controleer ook tricaïne toevoegen aan het medium in de beeldvorming kamer in dezelfde concentratie als in het fixeermiddel. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+functional+imaging+at+cellular+resolution+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy.</a> Nat. Methods. 10 (5), 413-420 (2013).</li>
<li>Swoger, J., Muzzopappa, M., López-Schier, H., Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+retrospective+lineage+tracing+using+SPIM+for+zebrafish+organogenesis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophoton%22%5BJournal%5D)">4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies.</a> J. Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2011).</li>
<li>Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophoton%22%5BJournal%5D)">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J. Biophoton. , 1-11 (2012).</li>
<li>Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+for+real-time+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy for real-time developmental biology.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 566-572 (2011).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeller%2C+PJ+%22Cold+Spring+Harb.+Prot%22">Cold Spring Harb. Prot</a>. 2010 (5), (2010).</li>
<li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li>
<li>Desmaison, A., Lorenzo, C., Rouquette, J., Ducommun, B., Lobjois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+sample+holder+for+single+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A versatile sample holder for single plane illumination microscopy.</a> J. Microsc. 10, (2013).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Zebrafish Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li>
<li>Jin, S. -W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -N., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).</li>
<li>Pauls, S., Geldmacher-Voss, B., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+histone+variant+H2A.F%2FZ+and+a+transgenic+H2A.F%2FZ%3AGFP+fusion+protein+for+in+vivo+studies+of+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">A zebrafish histone variant H2A.F/Z and a transgenic H2A.F/Z:GFP fusion protein for in vivo studies of embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 211 (12), 603-610 (2001).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Frazier, D. T., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricaine+%28MS-222%29%3A+effects+on+ionic+conductances+of+squid+axon+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Tricaine (MS-222): effects on ionic conductances of squid axon membranes.</a> Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Geavanceerde microscopische technieken zoals licht vel microscopie ons toelaten om de beelddata met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in de loop van enkele dagen, maar vereisen ook monster montagetechnieken te verbeteren. We presenteren een gedetailleerd protocol van meerlaagse montage voor lichte plaat microscopie van ontwikkeling van de zebravis. De methode is eenvoudig te implementeren en we gebruiken het in ons lab op een dagelijkse basis. De FEP buizen Belangrijkste componenten van onze strategie montage buizen van het polymeer Gefluoreerde Ethyleen Propyleen (FEP). We besloten om FEP gebruiken voornamelijk vanwege de brekingsindex van 1,338, die vergelijkbaar is met water en daarom ideaal voor lichte plaat microscopie met water dompelen doelstellingen en voorbeelden die waterige media. De buizen met 0,8 mm binnendiameter en 0,4 mm wanddikte passen bij de ontwikkeling van de zebravis heel goed, kan gebruikt worden met typische monster houders geschikt voor 1.6 mmhaarvaten en zijn onze eerste keuze voor de gepresenteerde montage methode. We testten deze grondig in ons zelfgebouwde opstellingen als in het commerciële systeem &quot;Lightsheet Z.1&quot; door Carl Zeiss Microscopie en vonden dat FEP tubes langdurige stabiliteit, slechts een minimale impact op de optische prestaties en zijn niet-fluorescerende 10. Zij zijn echter niet geschikt voor toepassingen met monsters die een andere brekingsindex, bijv. gewist monster nodig. Buizen en folies gemaakt van FEP zijn beschikbaar in verschillende diameters en dikten. Daarnaast kunnen FEP worden gesmolten bij 260 ° C en biedt daarmee vrijwel eindeloze mogelijkheden voor op maat gemaakte monster montagebeugels. Het polymeer buizen worden vaak geleverd steriel en daarom het reinigingsprotocol omvat verschillende stappen om beste optische kwaliteit. De coating met methylcellulose zorgt ervoor dat geen enkel deel van het groeiende zebravis embryo kleeft aan het polymeer. De beslissing voor 0,1% agarose is gebaseerd op uitgebreide testen van de groeisnelheid en immobiliteit in verschillende concentraties van agarose en methylcellulose 10. Agarose concentraties boven 0,1% al toonde een grote invloed op de groei van 24 HPF zebravis. Daarnaast maken we gebruik van lage doses van de verlamming drug tricaïne. Tricaïne blokken actiepotentialen, remt dus de signaaloverdracht tussen hersenen en spieren en onderdrukt spiercontracties 16. Een concentratie van 133-200 mg / L zorgt voor voldoende immobilisatie van de zebravis tussen 24-72 HPF. Echter, tricaïne en andere verlamming medicijnen die we tonen dosis-afhankelijke bijwerkingen, zoals hart-oedeem getest. Daarnaast kan de vereiste dosis tricaïne varieert met het ontwikkelingsstadium van het embryo. Wij adviseren daarom het verminderen van de tricaïne concentratie tot het bedrag dat nodig is voor de ontwikkelingsstadia die worden afgebeeld. Om beste-optreden te verzekerence en voorkomen de vorming van giftige bijproducten, moet vers bereid of ontdooid tricaïne stamoplossing te worden gebruikt, beschermd tegen licht en niet boven 30 ° C verwarmd De inbedding in FEP buizen maakt het ook voor eenvoudige wijziging van de montage medium om rekening te houden met specifieke behoeften. Voor time-lapse beeldvorming van het hart, raden wij u 3% methylcellulose en 100 mg / L tricaïne in plaats van 0,1% agarose en 200 mg / L voor de montage. Methylcellulose is meer viskeus dan 0,1% agarose aldus verschaffen hogere immobiliteit op zichzelf en minder tricaïne moet worden om opsluiting van de embryo waarborgen. Tricaïne is gevoelig voor temperaturen boven 30 ° C en kan ook worden verdund met het medium in de beeldvorming kamer, waardoor prestaties en mogelijke trillen van de embryo afgenomen. Zorg er daarom voor om tricaïne ook gebruiken in de beeldvorming medium waarin de gemonteerde monster wordt ondergedompeld. Als uw experimenten vereisen het gebruik van hogeretemperaturen raden wij uitwisseling het medium in de beeldvorming kamer hetzij continu door een perfusie systeem of handmatig met een buis en een spuit tussen twee tijdstippen. Kritische stappen De kritische stappen tijdens het proces van monster montage zijn de opname van het monster in de buis en het inbrengen van de agarose plug. De inlaat definieert de beginpositie van het embryo, wat omslachtig achteraf veranderen. Meerdere exemplaren beschikbaar moeten te monteren en de montage kwaliteit moet worden gecontroleerd met een stereomicroscoop. Als het monster oriëntatie is niet bevredigend, het veranderen van de snelheid van het opstellen van het model en het vermijden van latere verplaatsingen van de zuiger kan helpen als deze verdraait vaak het embryo. De 1,5% agarose plug noodzakelijk om lekkage van de 0,1% agarose voorkomen. Het oppervlak van de plug in de buis moeten plat om het monster geaardheid geen invloed tijdens de ontwikkeling zijn. Om een ​​goede surf bereikenace, verschillende diktes van de agarose lagen moeten worden getest en buisje in de agarose normaal op het oppervlak worden gebracht. Draaiing van de buis een beetje en het uittrekken van de buis zorgvuldig releases de stekker uit de schotel. De kwaliteit van de montage moet worden gecontroleerd met een stereomicroscoop voor de beeldvorming. Multiview beeldvorming Een groot voordeel van licht plaat microscopie is multiview beeldvorming, de mogelijkheid om het model te roteren, te verwerven z-stacks vanuit verschillende hoeken en vervolgens registreren en zekering ze. Een gevestigde methode om de z-stacks te registreren in 3D-ruimte is-kraal registratie op basis van het gebruik van fluorescerende kralen rond het monster, zoals fiduciaire markers 17. Deze methode gaat er echter van een stevige montage medium zoals 1,5% agarose en lijkt derhalve onverenigbaar met de meerlaagse montage hier gepresenteerd. Maar verschillende alternatieve oplossingen werkt, afhankelijk van de toepassing. Ten eerste, de fluorescerende kralen kanin de agarose plug, die moet in het gezichtsveld tijdens de acquisitie worden opgenomen. Ten tweede kan het stadium posities wordt vóór de eigenlijke experimenten met een 1,5% agarose kolom met fluorescerende kralen. Ten derde kunnen alternatieve merkers zoals fluorescente kernen worden gebruikt om de positie van de z-stacks opzichte van elkaar te identificeren. Verdamping Typische lichte vel microscopie opstellingen gebruiken een open monsterkamer, wat onvermijdelijk leidt tot de verdamping van het medium. Aangezien het medium is essentieel voor de overleving van het monster, om verdamping van het fixeermiddel te beperken en voor de juiste brekingsindex tussen optische en monster aanbevolen waarbij een of meer van de volgende maatregelen om verdamping te voorkomen. Ten eerste kan het medium in de kamer voortdurend worden uitgewisseld door een perfusie systeem. Ten tweede kan het medium handmatig worden bijgevuld. Ten derde kan de kamer worden afgedekt met een deksel of een flexibele folie. <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; Zuurstoftoevoer Het polymeer FEP is ontwikkeld om een ​​groot aantal chemicaliën te weerstaan ​​en derhalve robuust, chemisch inert en nonpermeable gas. Bij meerlagige montage zuurstof alleen doordringen door de agarose plug en agarose-luchtinterface, maar moet nog worden aangetoond of de zuurstoftoevoer meerlagige montage ernstig lager dan in de montage in 1,5% agarose zonder ondersteuning polymeerbuis. Zoals montage in 1.5% agarose kunnen alleen worden gebruikt voor ongeveer twee uur voor de zebravis morfologie beïnvloed multilayer montage lijkt de totale superieure oplossing voor lange termijn beeldvorming. Beeldvorming van eerdere stadia van ontwikkeling Multilayer montage is nu onze standaard inbedding techniek voor time-lapse licht vel microscopie van zebravis ouder dan 24 HPF. Daarnaast gebruiken we ook het polymeer buizen voor beeldvorming van eerder stadium embryo&#39;s. De embryos blijven in hun chorions en worden in een FEP buis gemonteerd met een binnendiameter van 1 mm en gevuld met E3. De zebravis kan vrij ontwikkelen zich in het chorion en nog steeds kan worden afgebeeld en met behulp van licht plaat microscopie. Vooruitzicht De gepresenteerde multilayer monster montage ontketent het volledige potentieel van licht plaat microscopie voor real-time ontwikkelingsbiologie met zebravissen. Het kan gemakkelijk voor andere microscopische technieken zoals optische projectie tomografie (OPT) en andere organismen vastgesteld. Wij zijn van mening dat de standaard-en kleinbedrijf FEP buizen zijn slechts de eerste stappen op weg naar monster montage technieken afgestemd op specifieke behoeften.

Om de complexe gebeurtenissen en interacties tijdens de embryogenese begrijpen, onderzoek in de ontwikkelingsbiologie is meer en meer het verplaatsen van microscopie van enkele cellen en organen in vivo beeldvorming van hele organismen. Traditionele microscopische technieken meestal niet de ruimtelijke en temporele resolutie over een lange periode van tijd te volgen snelle gebeurtenissen hebben vaak bleken of fototoxische effecten in het monster 1 te veroorzaken. Wij en anderen hebben gevonden lichtwaaier microscopie (figuur 1) om de ideale techniek voor in vivo beeldvorming van zebravis 2-4 zijn. De verlichting van het monster met een dun vel van laserlicht, loodrecht op de detectie as, biedt een snelle optische sectie met een hoge ruimtelijke resolutie en geminimaliseerd foto-toxiciteit 5. Tegelijkertijd, als gevolg van deze unieke optische opstelling traditionele monster montagetechnieken middels Petrischalen of cultuur kamers zijn niet geschikt. In een typisch lichtsheet microscoop drie translationeel motoren en een roterende motor houdt het monster, zodat het teken nauwkeurig kan worden gepositioneerd, draaide zich om en vanuit elke richting. In het verleden exemplaren voor lichte plaat microscopie zijn vaak ingebed in 1-2% agarose in een glazen capillair 6,7. In dit geval de gestolde agarose cilinder met de ingebedde monster wordt geëxtrudeerd uit het glas capillair in de monsterkamer gevuld met water-achtige medium voor beeldvorming. Agarose heeft een brekingsindex dicht bij water en is daarom perfect geschikt voor in vivo licht blad microscopie dat water gecorrigeerde belichting-en detectie optiek vergemakkelijkt. Het monster wordt opgesloten in de stijve agarose en kan goed worden afgebeeld gedurende een korte periode, maar morfogenetische veranderingen en groei van het embryo sterk verstoord wanneer beeldvorming enkele uren 7,8. Hoewel oplossingen voor andere toepassingen zijn ontwikkeld 9, de niet-invasieve langdurige time-lapse zebravis<html> beeldvormende mogelijkheden van licht plaat microscopie kan niet worden misbruikt via het conventionele 1,5% agarose inbedding. We ontwikkelden daarom een nieuwe montage strategie voor in vivo licht vel microscopie van zebravis embryo&#39;s 10. Het monster wordt in 0,1% agarose gemonteerd met 200 mg / L tricaïne in een buis van de optisch heldere polymeer gefluoreerde ethyleenpropyleen (FEP). De embedded embryo ontwikkelt gewoonlijk het gevolg van lage viscositeit van het medium. Tegelijkertijd, de FEP buis begrenst het medium en het monster gedurende de duur van het experiment. Hier geven we een gedetailleerd protocol van de nieuwe montage techniek en presenteren van gegevens als gevolg van de voordelen ten opzichte van de conventionele protocol. We zien dat onze werkwijze zebravis ontwikkeling continu kan worden afgebeeld met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie gedurende meer dan twee dagen. 5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Het beginsel van lichtwaaier microscopie. Zebravis gemonteerd in een buis van Gefluoreerde Ethyleen Propyleen (FEP) op vertaling en gedraaid het brandvlak van het objectief detectie. Een dunne plaat van laserlicht (licht vel) wordt geprojecteerd door de belichting doelstelling in het brandvlak van de objectieve detectie en verlicht slechts een dunne optische gedeelte van het monster. De geëmitteerde fluorescentiesignaal wordt door het doel detectie en opgenomen op een camera chip.

<table><tbody><tr><td>Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes</td><td>Bola</td><td>S 1815-04</td><td>0.8/1.6 mm binnen/buitendiameter, andere maten beschikbaar</td></tr><tr><td>Omnifix-F Solo 1 ml Spuit</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9161406 V</td><td></td></tr><tr><td>Sterican Single-Use Cannula, stomp</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9180109</td><td>0.8 mm x 22 mm, andere maten beschikbaar, buitendiameter van canule moet passen op binnendiameter van FEP-buis</td></tr><tr><td>50 ml Polypropyleen Centrifugeerbuis</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M NaOH&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>wordt geleverd als poeder</td></tr><tr><td>E3 medium (voor zebravis embryo's)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Reactiebuis</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, lage geleertemperatuur</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>wordt geleverd als poeder</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Greiner</td><td>633180</td><td>kunststof, 94 mm x 16 mm</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>synoniemen:&nbsp; Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat, MS-222, TS 222, Tricaine methaansulfonaat&nbsp;</td></tr><tr><td>10X/0.3 W Microscoopobjectieflens</td><td>Leica</td><td>HCX APO L</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Andor Technology</td><td>iXon 885 EMCCD</td><td></td></tr></tbody></table>

multilayer montage voor langdurig licht sheet microscopie van zebravis

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Licht blad microscopie is het ideale beeldvormingstechniek om zebravis embryonale ontwikkeling te bestuderen. Vanwege minimale foto-toxiciteit en bleken, is het bijzonder geschikt voor langdurige time-lapse imaging gedurende vele uren tot enkele dagen. Echter, een geschikt monster montage strategie vereist dat zowel opsluiting en normale ontwikkeling van het monster biedt. Multilayer montage, een nieuwe inbedding techniek met behulp van lage-concentratie agarose in optisch heldere buizen, overwint nu deze beperking en ontketent het volledige potentieel van licht plaat microscopie voor real-time ontwikkelingsbiologie.

Meerdaagse Imaging van zebravis Vasculature Development We maken gebruik van 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 zebravis om de voordelen van de meerlaagse montage strategie voor de lange termijn licht vel microscopie demonstreren. Het doel is om het imago van de ontwikkeling van het vaatstelsel in het gehele zebravis over een cursus van 2 dagen. De zebravis embryo werd in 0,1% agarose in een methylcellulose gecoate polymeer buis gemonteerd. Hier wordt de zebravis niet beperkt door het fixeermiddel en kan normaal te ontwikkelen. Zijn kop verhoogt, de staart uitstrekt en vasculaire kiemen verschijnt ongehinderd (figuur 3). <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> Figuur 3. Meerdaagse beeldvorming van zebravis vaatstelsel ontwikkeling. Het vaatstelsel van een multilayer gemonteerd 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 zebravis ontwikkelt ongehinderd in een lichte plaat microscoop in de loop van twee dagen. Een 488 nm laserlicht vel opgewonden de fluorescentie en het signaal werd gedetecteerd met behulp van 10X/0.3 W objectieve en een EMCCD camera. Z-stacks werden verworven op vier aangrenzende posities per 10 min en vervolgens gestikt met Fiji 15. Maximale intensiteit projecties van een subset van tijdstippen weergegeven. Schaalbalk:. 500 pm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding.</a> Beeldvorming van Vroege zebravis Embryogenese Hier tonen we het vermogen van FEP buis als montagehulp voor lichte plaat microscopie van de vroege embryogenese zebravis gedurende de eerste dag na de bevruchting. De 8 hpf Tg (H2A: GFP) 14 zebravis embryo werd met zijn intacte chorion in een E3-gevulde buis met een i gemonteerdenner diameter van 1 mm. Dat levert een lichte klemming van het chorion. Alle ontwikkelingsprocessen tijdens de embryogenese worden niet beïnvloed door de montage en kan optimaal worden gevisualiseerd met behulp van licht plaat microscopie. In dit voorbeeld hebben we belicht het monster gedurende een verloop van 12 uur (Figuur 4). Typische vormveranderingen tijdens vroege embryogenese, zoals de toenemende rek van de dooier en verdikking van weefsel langs de middellijn, worden onderdrukt in de gewone montage zonder chorion in 1,5% agarose. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . Figuur 4 Beeldvorming van vroege zebravis embryogenese A Tg (H2A: GFP). 14 zebravis passeert vroege embryogenese. Een 488 nm laserlicht vel enthousiast GFP en de fluorescentie-signaal werd gedetecteerdmet een 10X/0.3 W objectieve en een EMCCD camera. Z-stacks vanuit twee invalshoeken werden elke 3 min verworven over een cursus van 12 uur. Genormaliseerde maximale intensiteit projecties van een subset van de time-lapse getoond. Zichtbaar motion blur op 19 hpf resultaten uit het embryo spiertrekkingen tijdens acquisitie, omdat er geen verdoving gebruikt. Schaalbalk:. 150 pm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding.</a>

De ontwikkeling van de zebravis kan over dagen met licht blad microscopie wanneer embryo&#39;s zijn ingebed in optisch heldere polymeer buizen met een lage concentratie agarose worden gevolgd.

Multilayer Montage voor langdurig licht Sheet Microscopie van zebravis

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Het algemene doel van deze procedure is het mounten van een zebravisembryo voor langdurige in vivo light-sheet microscopie. Dit wordt bereikt door eerst een gefluorideerde ethyleenpropyleen- of FEP-buis te reinigen en deze te coaten met methylcellulose. Vervolgens wordt het betreffende zebravisembryo gecoat.Vervolgens wordt het embryo eerst overgebracht naar gesmolten agarose en daarna naar de gecoate FEP-buis. Ten slotte wordt de onderkant van de buis afgesloten met een aros-stop en wordt de oriëntatie van het gemonteerde embryo zorgvuldig gecontroleerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die de ongestoorde ontwikkeling van zebravisembryo's over meerdere dagen laten zien met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie via in vivo light sheet microscopie.Het belangrijkste voordeel ten opzichte van bestaande technieken is dat we nu zebravisembryo's over meerdere dagen kunnen observeren en niet slechts enkele uren. Deze methode kan waardevolle inzichten bieden in de langetermijn-embryogenese van de zebravis met behulp van light-sheet microscopie. Het kan ook worden toegepast op andere kleine organismen, zoals kleine mariene organismen.Het kan ook worden gebruikt in combinatie met andere microscopietechnieken, zoals optische projectietomografie, widefield-microscopie of confocale microscopie. Personen die onbekend zijn met deze methode kunnen tegen problemen aanlopen, omdat het protocol enkele tijdskritische stappen bevat en het bepalen van de uiteindelijke positie van het embryo enige expertise vereist. Om een FEP-buis voor te bereiden, dient deze eerst te worden gereinigd door herhaaldelijk door te spoelen met 1 M natriumhydroxide. Plaats de buis vervolgens in een centrifugebuis van 50 ml gevuld met 0,5 M natriumhydroxide en behandel deze 10 minuten lang met ultrasoon geluid.Breng de polymeerbuis over naar een klein bakje met gedestilleerd gedeïoniseerd water en spoel deze door. Volg dit daarna op met een spoeling met 70% ethanol voordat de buis wordt overgebracht naar een schone centrifugebuis. Met ethanol ultras.Sonicate de buis gedurende 10 minuten voordat u deze overbrengt naar een klein bassin met gedestilleerd gedeïoniseerd water om deze te spoelen. Snijd de schone FEB-buis vervolgens in stukken van drie centimeter lang en recht deze indien nodig. Bewaar de gereinigde buizen in een nieuwe buis van 50 milliliter gevuld met gedestilleerd gedeïoniseerd water.Bereid de Trica-stamoplossing. 3% methylcellulose en zowel 1,5% als 0,1% Aros volgens het tekstprotocol. Smelt 1,5% agarro en giet dit in een Petrischaal om een laag met een dikte van ongeveer twee millimeter te vormen.Verzamel zebravissenembryo's in het gewenste stadium die het gekozen fluorescentiegen positief hebben tot expressie gebracht en breng deze onder een stereomicroscoop over naar een nieuwe schaal met E3-medium. Gebruik twee scherpe pincetten om de embryo's voorzichtig te onchorioneren; gebruik één pincet om het chorion vast te houden en het tweede pincet om het open te scheuren en te verwijderen voor het uitvoeren van multi-layer mounting. Bevestig met handschoenen aan beide handen een stompe canule aan een spuit.Voer de canule voorzichtig ongeveer drie millimeter in één uiteinde van een gereinigd stuk FEP-buis in. Dompel vervolgens het vrije uiteinde van de FEP-buis in 3% Methylcellulose en vul de buis met de oplossing. Druk daarna langzaam op de spuit om de methylcellulose vrij te geven met behulp van E three-medium en herhaal de stappen van het dompelen en uitstoten.Verwarm ondertussen in een warmteblok één aliquot van 0,1%aros tot 70 °C. Vortex de reactiebuis kort voordat deze wordt overgebracht naar een warmteblok dat is ingesteld op 38 °C. Laat de buis na het verwarmen kort afkoelen, voeg trica toe tot een eindconcentratie van 133 tot 200 mg/L en vortex.Gebruik opnieuw een glazen Pasteurpipet. Breng een gecoat embryo over naar de reactiebuis met de voorverwarmde aros, waarbij zo min mogelijk E3 wordt overgebracht. Neem met de FEP-buis en de bevestigde spuit voorzichtig een kleine hoeveelheid aros op voordat het embryo wordt opgenomen en vul de buis volledig met aros.Het embryo moet aan één van de uiteinden van de buis worden geplaatst, waarbij de kop naar de opening is gericht. Om lekken van de inhoud te voorkomen, moet de buis in een horizontale positie worden gehouden om deze af te sluiten. Gebruik een scheermesje om het embryo van de canule af te snijden.Houd de buis vervolgens loodrecht en steek het uiteinde er langzaam door de gehele laag van 1,5%aros, waarna u deze licht draait. Om uitdroging te voorkomen, bewaart u het gemonteerde specimen in een reactiebuis van 1,5 milliliter gevuld met E three medium vóór de beeldvorming. Controleer of de vis in de FEP-buis recht is gepositioneerd en of de kop direct op de plug rust voor de beeldvorming.Voeg trica toe aan het medium in de beeldvormingskamer. Hier wordt een transgene K-G-R-L-G-F-P zebravissenbel embryo getoond, één dag na bevruchting, dat gedurende twee dagen is afgebeeld om de ontwikkeling van de vasculatuur te observeren.De zebravis wordt niet beperkt door het montage-medium en kan zich normaal ontwikkelen. De kop komt bijvoorbeeld omhoog. De staart strekt zich uit en vasculaire uitlopers verschijnen ongehinderd.Deze techniek kan in 10 minuten worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd en alle materialen direct beschikbaar zijn. Denk eraan om alle belangrijke stappen zonder vertraging uit te voeren. Houd alle oplossingen schoon, aangezien vuil de uiteindelijke beeldkwaliteit kan verslechteren.

multilayer-mounting-for-long-term-light-sheet-microscopy-of-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft de monstervoorbereiding voor lichtbladfluorescentiemicroscopie. Het demonstreert ook een methode om levende zebravisembryo's te monteren voor langetermijnbeeldvorming, waardoor lange time-lapse-films van levende embryo's in bijna fysiologische omstandigheden kunnen worden opgenomen.

Light Sheet Microscopie Monstervoorbereiding: Montage van levende zebravisembryo's voor langdurige beeldvorming

Dit artikel beschrijft een methode om levende zebravisembryo's te monteren voor langetermijnbeeldvorming. Deze methode is kosteneffectief en gemakkelijk uit te voeren met behulp van gewone microscopieschalen met glazen bodem voor beeldvorming op inverted microscope. De montage wordt uitgevoerd in lagen agarose in verschillende concentraties.

Gelaagde agarmontage: levende zebravisembryo's voorbereiden op langetermijnbeeldvorming met een omgekeerde microscoop

We presenteren een protocol voor het vastleggen van de dynamica van regeneratie van de staartvin van zebravislarven op een volledige weefselschaal met behulp van stereomicroscopie op basis van helder veld. Deze techniek maakt het mogelijk om de regeneratiedynamica met een enkele celresolutie vast te leggen. Deze methodologie kan worden aangepast aan elke stereomicroscoop uitgerust met een CCD-camera en time-lapse software.

Vastleggen van Tissue Repair in zebravis Larven met Time-lapse Helderveld stereomicroscopie

Lichtbladfluorescentiemicroscopie is een uitstekend hulpmiddel voor het beeldvormen van embryonale ontwikkeling. Het maakt het mogelijk om lange time-lapse films van levende embryo's op te nemen in bijna fysiologische omstandigheden. We demonstreren de toepassing ervan voor het beeldvormen van de oogontwikkeling van zebravissen over brede ruimtelijk-temporele schalen en presenteren een pijplijn voor het samenvoegen en deconvolutie van multiview datasets.

Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development

Hier presenteren we een veelzijdige montagemethode die langetermijn tijds-gelaps beeldvorming mogelijk maakt van de ontwikkeling van het achterste lichaam van levende zebravisembryo's zonder de normale ontwikkeling te verstoren.

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Dit artikel beschrijft een methode voor het monteren van fragiele zebravis embryo's voor uitgebreide time-lapse confocale microscopie. Deze voordelige methode is eenvoudig uit te voeren met behulp van regelmatige glazen bodem microscopie gerechten voorbeeld vorming op elke omgekeerde Microscoop. De montage wordt uitgevoerd in lagen van agarose bij verschillende concentraties.

Een gelaagde montagemethode voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's

We beschrijven geoptimaliseerde hulpmiddelen om het hart van de zebravis in vivo te bestuderen met fluorescentiemicroscopie van lichtplaten. In het bijzonder stellen we heldere cardiale transgene lijnen voor en presenteren we nieuwe zachte inbeddings- en immobilisatietechnieken die ontwikkelings- en hartafwijkingen voorkomen. Een mogelijke data-acquisitie- en analysepijplijn aangepast aan cardiale beeldvorming wordt ook verstrekt.

Light Sheet Microscopie van snelle hartdynamica in zebravisembryo's

Er wordt een strategie voor de voorbereiding van monsters beschreven voor het afbeelden van vroege zebravisembryo's in een intact chorion met behulp van een light-sheet-microscoop. Het analyseert de verschillende oriëntaties die embryo's verwerven in het chorion in de 70% epiboly- en knopstadia en beschrijft beeldvormingsstrategieën voor het verkrijgen van resolutie op cellulaire schaal in het hele embryo met behulp van het light-sheet-systeem.

Light Sheet Microscopie, beeldvorming en montagestrategieën voor vroege zebravisembryo's

Op lange termijn Imaging zoogdiercellen met behulp van Wide-Field Microscopie

In dit rapport stellen we een nieuwe toepassing van licht-uithardende tandheelkundige harsen voor montageplaat van elektroden of microdialyse probes in chronische experimenten. Dit materiaal maakt directe binding aan de schedel.

Toepassing van de Light-cured Dental lijm hars voor permanente montage elektroden of Microdialyseprobes bij chronische experimenten

Leer een multilayer montagetechniek voor langdurige lichtveldmicroscopie van zebravisembryo's. Deze methode maakt ongestoorde ontwikkelingsobservatie over meerdere dagen mogelijk met hoge resolutie.

Multilayer Montage voor langdurig licht Sheet Microscopie van zebravis

Meer video's verkennen