Name: Minimaal Invasieve Oprichting van Muriene Orthotope Blaas Xenografts (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Leer een minimaal invasieve methode voor orthotopische blaaskankerxenotransplantatie met echogeleide injectie in muizen. Deze techniek vermindert dierenleed en maakt nauwkeurige monitoring van tumorgroei mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Eliana Beraldi erkennen voor het uitvoeren van virale transductie van tumor cellijnen en Ben Deeley voor zijn instructie over het gebruik van het kleine dier echografie platform. Dit project werd gesteund door de Duitse Stichting System (DFG; JA 2117/1-1: 1), de Canadian Cancer Society Research Institute en een Mentored Arts Scientist Award van Vancouver Coastal Health Research Institute. De echografie platform werd gefinancierd door de Canadese Stichting voor Innovatie.

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Canadese Raad over Animal Care (CCAC). Het protocol werd goedgekeurd door de Animal Care Comite van de Universiteit van British Columbia (Protocol Nummer: A10-0192). 1. Bereiding van cellijnen <ol><li> Bevestig de identiteit van de respectieve menselijke blaaskanker cellijnen door DNA-fingerprinting 7. </li><li> Voor groei analyse van xeno-tumoren door bioluminescentie, transfecteren cellijnen met een lentivirale construct die het vuurvlieg luciferase gen 3. </li><li> Ontdooi en uitbreiden van de bestaande cellijnen gemodificeerd Eagle&#39;s medium van Dulbecco (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer. Passage van de cellen minstens 3x maar vermijd cultuur keer meer dan 3 maanden. </li></ol> 2. Voorbereiding celsuspensie <ol><li> Ontdooien Matrigel. Houd de temperatuur onder4 ° C verhoogde viscositeit van de gel te voorkomen. </li><li> Trypsinize de cellen bij een samenloop van 70% en op te schorten in normale groei media. </li><li> Tel het aantal cellen met een hemocytometer of automatische cel teller. </li><li> Draai de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 200 x g. Verwijder het supernatant. </li><li> Voeg de juiste hoeveelheid DMEM (10% FBS) en Matrigel (1:1) om de gewenste celconcentratie die afhankelijk is van de gebruikte cellijn gewenste groei kinetiek (8-15 x 10 6 / ml) te bereiken. Het geïnjecteerde volume van tumorcel schorsing zal 40 pi. </li><li> Meng goed door en neer te pipetteren (P1000), voorkomen dat er luchtbellen in de suspensie. </li></ol> 3. Voorbereiding van de dieren Opmerking: Vanwege de mogelijke noodzaak van transurethrale katheterisatie in stap 4.7, vrouwelijke muizen zijn de gewenste geslacht in dit diermodel. <ol><li> Huis muizen volgens institutionele en nationale dier zorg guidelines. Verkrijgen goedkeuring ethische commissie voor alle experimenten met muizen. </li><li> Verdoven van de muizen met 3% isofluraan / zuurstof mengsel. Bevestig de juiste verdoving van de dieren (bijvoorbeeld ongevoeligheid tot teen knijpt). </li></ol> 4. Experimentele opstelling <ol><li> Snijd de blaas stabilisatie van elke vorm van vlakke stijve kunststof [Figuur 2 I]. Inspecteer zorgvuldig de band en eventuele scherpe randen te verwijderen vóór het aanbrengen op de muizen. </li><li> Monteer het dier op het verwarmde afbeeldingtafel [Figuur 1 I] van de beeldvorming van kleine proefdieren platform met continue bewaking van de vitale functies. Bevestig de onderste ledematen met een rubberen band [Figuur 1 III]. </li><li> Ontsmet de buik met 2% chloorhexidinegluconaat en veeg de huid met een steriel wattenstaafje. </li><li> Immobiliseren de blaas met de blaas stabilisatie band [Figuur 2 II]. Zo, een uitvluchtvan de blaas tijdens intramurale injectie in stap 5.6 worden vermeden. </li><li> Breng een steriel ultrasound gel naar de onderbuik. </li><li> Langzaam naderen de echo scankop (40 MHz) [Figuur 1 IV] aan de huid (lengterichting met een craniale hoek van 45-70 °) en visualiseren van de blaas op de echo scherm [Figuur 3 I]. </li><li> Als de blaas leeg is, vul het met 50 pi steriel, warm-fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door middel van een transurethrale 24 G angiocatheter. </li></ol> 5. Scheiding van blaaswand Lagen <ol><li> Bevestig een 1,0 ml spuit gevuld met PBS en op een 30 G, ¾ van naald (schuine voren gericht) op de spuit klem. </li><li> Plaats de naald naar de huid boven het schaambeen in een 30-45 ° hoek (80-90 ° ten opzichte van de langsas van de ultrasone aftastkop [Figuur 1]). </li><li> Detecteren de naaldop de echo scherm. </li><li> Langzaam perforeren de huid en de buikwand spieren [Figuur 3 II]. </li><li> Draai de schuine kant van de naald 180 ° (nu naar achteren gericht). </li><li> Steek de punt van de naald in de blaaswand zonder penetreren van de mucosa [Figuur 3 III] </li><li> Langzaam Injecteer 50 pl PBS tussen de spierlaag en het slijmvlies om een artificiële ruimte [Figuur 3 IV] te creëren. Opmerking: Als het slijmvlies ongeluk is geperforeerd tijdens stap 5.6, langzaam trek de naald terug en injecteer 50 pi PBS na de slijmvlieslaag rug heeft omgedraaid de naald. </li><li> Trek de naald. </li></ol> 6. Intramurale Enten van blaaskankercellen <ol><li> Bevestig een tweede 1,0 ml spuit (gevuld met kankercellen gesuspendeerd in Matrigel) met een 30 G, ¾ in op de spuit klem. </li><li> Leid de punt van de naald naar dezelfdePBS-gevulde ruimte die werd gemaakt in stap 5.7. </li><li> Injecteer 40 pi van de celsuspensie in deze ruimte [figuren 3 V en VI]. </li><li> Trek de naald. </li></ol> 7. Post-interventionele Ondersteunende Care <ol><li> Demonteer de muis van de imaging platform. </li><li> Houd het dier in een warme en comfortabele omgeving onder permanente bewaking terwijl u herstelt van de narcose. </li><li> Na het terugbrengen van bewustzijn en hervatten normale ambulation, plaatst het dier terug in zijn kooi. </li></ol>

<ol><li>Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+orthotopic+models+for+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Mouse orthotopic models for bladder cancer research.</a> BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).</li>
<li>Kubota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+models+of+human+cancer+xenografted+in+the+nude+mouse%3A+the+importance+of+orthotopic+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation.</a> J. Cell. Biochem. 56, 4-8 (1994).</li>
<li>Hadaschik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+mouse+model+for+orthotopic+bladder+cancer+using+transurethral+tumour+inoculation+and+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging.</a> BJU Int. 100, 1377-1384 (2007).</li>
<li>Kang, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Bladder+Tumor+Model+and+the+Evaluation+of+Intravesical+saRNA+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li>
<li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Model+of+Murine+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li>
<li>Dinney, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+metastatic+variants+from+human+transitional+cell+carcinoma+passaged+by+orthotopic+implantation+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice.</a> J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).</li>
<li>Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Bladder+Wall+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Bladder Wall Injection.</a> J. Vis. Exp. (53), (2011).</li>
<li>Xiao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+transplantable+orthotopic+rat+bladder+transitional+cell+tumour+model%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel transplantable orthotopic rat bladder transitional cell tumour model.</a> Br. J. Cancer. 81, 638-646 (1999).</li>
<li>Iinuma, S., Bachor, R., Flotte, T., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+and+phototoxicity+of+5-aminolevulinic+acid-induced+PpIX+in+an+orthotopic+rat+bladder+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Biodistribution and phototoxicity of 5-aminolevulinic acid-induced PpIX in an orthotopic rat bladder tumor model.</a> J. Urol. 153, 802-806 (1995).</li>
<li>Jäger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+view%3A+Genetic+profiling+reveals+decades+old+cross-contamination+of+bladder+cancer+cell+line+KU7+with+HeLa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain view: Genetic profiling reveals decades old cross-contamination of bladder cancer cell line KU7 with HeLa.</a> J. Urol. (13), (2013).</li>
<li>Horiguchi, Y., Larchian, W. A., Kaplinsky, R., Fair, W. R., Heston, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+liposome-mediated+interleukin-2+gene+therapy+in+orthotopic+murine+bladder+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Intravesical liposome-mediated interleukin-2 gene therapy in orthotopic murine bladder cancer model.</a> Gene Ther. 7, 844-851 (2000).</li>
<li>Dinney, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+metastatic+variants+from+human+transitional+cell+carcinoma+passaged+by+orthotopic+implantation+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice.</a> J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).</li>
<li>Black, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+bladder+cancer+xenograft+bioluminescence+with+magnetic+resonance+imaging%3A+the+significance+of+hypoxia+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis.</a> BJU Int. 106, 1799-1804 (2010).</li>
</ol>

Open toegang voor deze video-artikel wordt gesponsord door FUJIFILM VisualSonics, Inc

Bijna alle belangrijke vooruitgang in de behandeling van kanker zal testen in diermodellen nodig voor het starten van klinische proeven. Diermodellen van kanker zijn essentiële hulpmiddelen die onderzoekers in staat stellen om de tumor biologie te bestuderen in vivo. Orthotopische xenotransplantaatmodellen blijft de gouden standaard 1,2 en blijven de meeste flexibiliteit (in termen van selectie van cellijnen) bieden en hebben de meest praktische nut. De geïllustreerde werkwijze is een minimaal invasieve wijziging van de orthotope model eerder beschreven door Dinney et al.. 12 Wij opgericht xenograft tumoren door ultrageluid geleide percutane injectie van drie verschillende cellijnen die technisch succespercentage van 100%. Bij continue follow-up, 98% van de muizen aangetoond voortdurende toename van het tumorvolume. Door het uitvoeren van een minimaal-invasieve techniek konden we bestaande beperkingen van de intramurale model pakken. Naast respecting dierenwelzijn, verminderde invasiviteit van deze procedure ook bij aan reproduceerbaarheid van in vivo experimenten door het verminderen van het aantal chirurgische complicaties. Het is zeer de tijd effectief om een ​​abdominale laparotomie en bijbehorende behoefte aan wondsluiting te voorkomen. We waren in staat om een ​​significante daling van de procedure tijd per dier tot 3,4 min (± 1.6). Echter, het grootste voordeel van onze nieuwe benadering is de juistheid ervan. Hoge-resolutie echografie kunnen we de ruimte die door een zoutoplossing injectie onder het slijmvlies van de blaaswand te visualiseren. Deze eerste stap injectie vergemakkelijkt tumorcel injectie in een tweede stap en minimaliseert het risico van tumorcel morsen. Dit in tegenstelling tot de techniek van intramurale injectie na laparotomie, waar het onmogelijk is naaldplaatsing visualiseren en er is altijd een element van onzekerheid over de exacte diepte van de injectie. Ook, zoals we het inenten van tumorcellen strikt in de voorste blaaswand, tumor growth op de achterste blaaswand wordt vermeden. Vervolgens wordt de snelheid van obstructieve complicaties vanwege tumorgroei in de nabijheid van de ureterale openingen is zeer zeldzaam. Deze begeleidende effect geeft langere groei en behandeling periodes. De belangrijkste beperking van de echogeleide tumorinoculatie is de noodzaak van adequate technische uitrusting. Daarom is de uitvoering van deze procedure waarschijnlijk beperkt tot centra die gespecialiseerd zijn in dierlijke modellen van menselijke kanker. Dit moet samenwerking tussen onderzoeksgroepen te stimuleren buiten deze instellingen en de groepen met expertise in dergelijke nieuwe dierlijke modellen. Hoewel afhankelijk van de bekendheid met echografie en wat handvaardigheid, dit model is gemakkelijk te leren onder bevoegde instructie. De belangrijkste stap in de procedure is het creëren van een kunstmatige ruimte submucosaal in de blaaswand met een zoutoplossing. Zodra deze ruimte wordt gecreëerd zonder perforatie of de mucosale laag blijft stabiel gedurende enkele minuten. De leiding van de tweede naald in deze ruimte om de tumorcellen te inoculeren is relatief eenvoudig. De belangrijkste complicatie tijdens het maken van de submucosale ruimte is perforatie van de naald in de blaas lumen. De oprichting van een submucosale ruimte blijft echter mogelijk. De naald moet langzaam in de blaaswand worden ingetrokken en de zoutoplossing ingespoten net wanneer de slijmvlieslaag klapt over de punt van de naald. Na deze handeling de submucosale ruimte minder stabiel (zout zal ontsnappen naar de blaas lumen binnen 30-60 seconden) en de injectie van de tumorcellen moet snel worden uitgevoerd. Morsen van tumorcellen in de blaas lumen kan in deze gevallen perforatie van de mucosa. Hoewel het verlies van de tumorcellen uit de intramurale ruimte zou kunnen leiden tot een verminderde tumorvolume tijdens de follow-up, hebben we nooit een intravesicale tumoropname waargenomen. Een andere mogelijke complication is het morsen van tumorcellen voor de peritoneale holte via het injectiekanaal. We zagen slechts een intraperitoneale tumorcel verspreiding in 50 dieren, en dit gebeurde in een van onze eerste pogingen. We schrijven dit de injectie van te grote tumor celsuspensie volume. Dit werd ondersteund door het feit dat het verminderen van het volume 50-40 ul resulteerde niet in een verdere intraperitoneale morsen. Deze minimaal invasieve inoculatie van muizen orthotopische blaaskanker xenograft vertegenwoordigt een innovatieve wijziging van de bestaande &quot;intramurale model&quot;, profiteert zowel de onderzoeker en de dieren gelijk. De voordelen van dit model bevorderen aanpassing aan andere organen zoals nier, prostaat en lever om orthotope xenograft tumoren op in een minimaal-invasieve manier.

Kankeronderzoek is afhankelijk van diermodellen van kanker bij de mens met behulp van cellijnen afgeleid van patiënt tumoren om ons begrip van de tumor biologie verdiepen. Voor in vivo groei analyse onder verschillende behandelstrategieën muizen orthotoop blaaskanker modellen blijven de referentie-standaard 1,2. De inenting van menselijke blaas kankercellen in immuungecompromitteerde muizen (xenotransplantaatmodel) vertrouwt op intravesicale instillatie (&quot;intravesicale model&quot;) 3,4,5 of directe injectie in de blaaswand (&quot;intramurale model&quot;) 6,7. Beide technieken kunnen ook worden uitgevoerd bij ratten 8,9. Intravesicale instillatie induceert tumorvorming op het urotheliale oppervlak van de blaas die vervolgens vatbaar zijn voor latere intravesicale instillatie van nieuwe behandelingsmiddelen. Echter, het aantal cellijnen die betrouwbaar tumorigene wanneer via deze methode een beperkt geleverdd een van deze cellijnen, KU7, is onlangs aangetoond in HeLa 4,10. Intravesicale instillatie is ook tijdrovend vanwege noodzakelijk verblijftijden en induceert vaak tumorgroei in aangrenzende elementen van de urinewegen, zoals urethra, ureter en nierbekken 11. Bovendien intravesicale instillatie leidt vaak tot tumorgroei op de vloer van de blaas waar de urineleiders voeren de blaas, en dit kan de bovenste obstructie en gelijktijdig nierfalen veroorzaken. Primaire invasieve blaaskanker xenotransplantaten die geschikt zijn voor systemische behandelingen worden gemaakt door directe injectie van tumorcellen in de blaaswand 12. Hoewel een groot aantal cellijnen groeien adequaat in dit model, zijn beperking is de invasiviteit van het model in verband met de noodzaak van een abdominale incisie 13. Het model is ook uitdagend leren vanwege de technische problemen bij het injecteren van cellen precies in de spierwandvan de blaas. Een nieuwe benadering voor orthotope primaire invasieve blaaskanker xenotransplantaten vaststellen muizen ontwikkeld in de categorieën om de bestaande tekortkomingen van de &quot;intramurale model&quot; richten. We konden de percutane ultrageluid geleide injectie van blaaskankercellen optimaliseren in de voorste blaaswand waardoor deze nieuwe techniek met succes plaats van de vastgestelde invasieve model. Bovendien hebben we potentieel verbeterde de nauwkeurigheid en de reproduceerbaarheid van de &quot;intramurale model&quot;.

<table><tbody><tr><td>Chlorhexidine gluconate (2%)</td><td>Aplicare</td><td>82-319</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle&rsquo;s Medium (DMEM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3008101</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter Corporation</td><td>402-069-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (0.25%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3004202</td><td></td></tr><tr><td>Syringe (1 ml)</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic needle (30 G; &frac34; in)</td><td>Kendall</td><td>830340</td><td></td></tr><tr><td>Angiocatheter (24 G)</td><td>BD Bioscience</td><td>381112</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 770 small animal imaging platform</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RMV 706 ultrasound scanhead</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III</td><td>Caliper Life Science</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

minimaal invasieve oprichting van muriene orthotope blaas xenografts

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Orthotopische blaaskanker xenotransplantaten zijn de gouden standaard om de moleculaire cellulaire manipulaties en nieuwe therapeutische middelen in vivo te bestuderen. Geschikte cellijnen zijn ofwel geënt door intravesicale instillatie (model van nonmuscle invasieve groei) of intramurale injectie in de blaaswand (model van invasieve groei). Beide procedures zijn complex en tijdrovend. Bovendien, de oppervlakkige model zijn tekortkomingen vanwege het gebrek aan cellijnen die tumorigene volgende instillatie. Intramurale injectie, anderzijds, wordt ontsierd door de invasiviteit van de procedure en de morbiditeit voor de ontvangende muis. Met deze tekortkomingen in het achterhoofd, hebben we aangepast eerdere methoden om een ​​minimaal invasieve benadering voor het creëren orthotoop blaaskanker xenotransplantaten ontwikkelen. Met behulp van echografie begeleiding hebben we met succes uitgevoerd percutane inoculatie van de blaaskanker cellijnen UM-UC1, UM-UC3 en UM-UC13 in 50 athymic naakt. We hebben kunnen aantonen dat deze aanpak tijd efficiënt, nauwkeurig en veilig geweest. Met deze techniek wordt eerst een ruimte gecreëerd onder de blaas mucosa met PBS en tumorcellen worden vervolgens geïnjecteerd in deze ruimte in een tweede stap. Tumorgroei regelmatig gecontroleerd met bioluminescentie beeldvorming en echografie. De gemiddelde tumorvolumes gestaag toegenomen in alle, maar een van onze 50 muizen tijdens de studieperiode. In onze instelling, deze nieuwe benadering, die blaaskanker xenograft inoculatie kan in een minimaal-invasieve, snelle en nauwkeurige manier is het traditionele model vervangen.

<html> Intramurale injectie van drie verschillende tumor cellijnen (UM-UC1 luc, UM-UC3 luc en UM-UC13 luc) werd uitgevoerd in 50 dieren onder echografische-begeleiding op drie opeenvolgende dagen. De inenting werd efficiënt uitgevoerd (mean time 5.7 min / dier) en werd niet geassocieerd met een intra-of post-interventionele complicaties. Monitoring van tumorgroei werd uitgevoerd door echografie en bioluminescentie. Op dag nr.3 een tumor kan worden gedetecteerd door ultrageluid in de voorste blaas van alle 50 dieren [Figuur 4 I]. 98% van de muizen bleek een constante groei van de tumor tijdens de follow-up periode [De tabellen 4 en 5]. Na de enting van UM-UC3 luc, een muis ontwikkeld intraperitoneale verspreiding tumor en de tumor involuted na dag # 7 in een tweede dier [Tabel 1]. Dit was de eerste groep muizen geïnoculeerd met deze techniek. nt &quot;&gt; De muizen werden geofferd op dag # 24, # 28 en # 37 na inoculatie van UM-UC3 luc, UM-UC1 luc en UM-UC13 luc, respectievelijk. Xenograft tumoren werden geoogst en onderzocht op hematoxyline en eosine (H &amp; E ) secties. Alle tumoren spier invasieve en sommige geïnfiltreerd in de perivesical vet, maar geen invasie in aangrenzende organen waargenomen [Figuur 6 I]. 60% van de muizen met UM-UC13 luc tumoren en 20% van de muizen met UM-UC3 luc tumoren ontwikkeld retroperitoneale lymfekliermetastasen die werden bevestigd door H &amp; E-kleuring [Figuur 6 II]. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig1.jpg" /> Figuur 1. Beeld en schematische afbeelding van de experimentele opstelling. Wordt de muis gemonteerd op het verwarmde operatietafel (I) en onder verdoving gehouden (&lt;strong&gt; II) met 3% isofluraan / zuurstof mengsel. De onderste ledematen worden bevestigd met een rubberen band (III). Na het naderen van de echografie scankop (IV) op de huid (uitlijning in de lengterichting met een craniale hoek van 45-70 °) van de blaas (V) wordt gevisualiseerd op de echo scherm. Een spuit met een 30 G naald (VI) wordt geleid naar de huid onder een hoek van 30-45 ° (80-90 ° ten opzichte van de langsas van de ultrasone aftastkop). <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig2.jpg" /> Figuur 2. Immobilisatie van de blaas. Afmetingen en illustratie aan de blaas stabilisatie band (I) construct De band wordt naar de onderbuik bevestigd en immobiliseert de blaas (II). Dus een ontduiking van de<html> blaas tijdens intramurale injectie wordt vermeden. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig3.jpg" /> Figuur 3. Intramurale inoculatie van tumorcellen. Visualisatie van de blaas op de echo scherm (I). Perforatie van de huid en buikspieren (II). Naald inbrengen in de blaaswand zonder penetratie van de mucosa (III). PBS (50 ul) van de spierlaag en de mucosa na langzame injectie (IV). Tumorcellen gesuspendeerd in Matrigel in de intramurale kunstmatig gecreëerde ruimte (V, VI). 1123fig4.jpg &quot;/&gt; Figuur 4. . Follow-up door echografie voordurende follow-up door echografie toonde significante toename van de tumor volume (I: dag # 3, II: dag # 7, III: dag # 13). <img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig5.jpg" /> Figuur 5. Follow-up door bioluminescentie. Continue opvolging door bioluminescentie toonde voortdurende stijging van luminescentie tijdens de studieperiode. <img alt="Figuur 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51123/51123fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51123/51123fig6.jpg" /> Figuur 6. Histologie van xenograft tumor en lymfeklieren metastase. In toto H &amp; E gedeelte van een vertegenwoordiger xenograft tu<html> mor waaruit invasieve groei in de spier zonder invasie in aangrenzende organen (I). 60% van de muizen met UM-UC13 luc tumoren en 20% van de muizen met UM-UC3 luc tumoren gepresenteerd retroperitoneale metastasen (II). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320"><colgroup><col span="5" /></colgroup><tbody><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Geënt cellijn </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> UM-UC1 luc </td><td style="width:64px;"> UM-UC3 luc </td><td style="width:64px;"> UM-UC13 luc </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"> Aantal muizen </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 20 </td><td style="width:64px;"> 15 </td><td style="width:64px;"> 15 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Geïnjecteerde volume, pi </td>idth: 64px; &quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> 40 </td><td style="width:64px;"> 50 </td><td style="width:64px;"> 50 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Celgetal, absolute </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 3,6 x 10 5 </td><td style="width:64px;"> 6 x 10 5 </td><td style="width:64px;"> 5,5 x 10 5 </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Tijd per dier, min </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 3,4 (± 1,6) </td><td style="width:64px;"> 7.7 (± 3.7) </td><td style="width:64px;"> 6.8 (± 2.9) </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Tumorincidentie </td><td style="width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:192px;"> 49 (98%) </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"&gt; </td><td style="width:64px;"> 20 (100%) </td><td style="width:64px;"> 14 (93%) </td><td style="width:64px;"> 15 (100%) </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"> Lymfekliermetastase </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 0 </td><td style="width:64px;"> 3 (20%) </td><td style="width:64px;"> 9 (60%) </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"> Follow-up (dagen) </td><td style="width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 28 </td><td style="width:64px;"> 22 [vóór de behandeling] </td><td style="width:64px;"> 28 [vóór de behandeling] </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:64px;"> Tumor volume (pl) </td><td style="width:64px;"> dag 4 </td><td style="width:64px;"> 11.6 (± 1.3) </td><td style="width:64px;"> 12.5 (± 1.7) </td><td style="width:64px;"> 14.4 (± 1.3) </td></tr><tr height="20"><td height="61" rowoverspanning = &quot;2&quot; style = &quot;height: 61px; width: 64px;&quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> Eind </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 394,6 (± 72.4) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 288,7 (± 66.1) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> 78,3 (± 13,4) </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:64px;"> follow-up </td></tr><tr height="56"><td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:64px;"> Tumor luminescentie (Fotonen / sec) </td><td rowspan="2" style="width:64px;"> dag 4 </td><td style="width:64px;"> 4,6 x 10 8 </td><td style="width:64px;"> 2,0 x 10 8 </td><td style="width:64px;"> 5,8 x 10 8 </td></tr><tr height="44"><td height="44" style="height:44px;width:64px;"> (± 9,4 x 10 7) </td><td style="width:64px;"> (± 3,7 x 10 7) </td><td style="width:64px;"> (± 1,3 x 10 8) </td></tr><tr height="23"><td height="67" rowspan="2"style = &quot;height: 67px; width: 64px;&quot;&gt; </td><td style="width:64px;"> Eind </td><td style="width:64px;"> 1,9 x 10 10 </td><td style="width:64px;"> 1,4 x 10 10 </td><td style="width:64px;"> 1,5 x 10 10 </td></tr><tr height="44"><td height="44" style="height:44px;width:64px;"> follow-up </td><td style="width:64px;"> (± 4,0 x 10 9) </td><td style="width:64px;"> (± 2,3 x 10 9) </td><td style="width:64px;"> (± 1,9 x 10 9) </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Echogeleide tumorcel injectie - procedure en de resultaten.

De gevestigde techniek om primaire invasieve orthotoop blaaskanker xenotransplantaten te enten vereist laparotomie en mobilisatie van de blaas. Deze procedure toebrengt significante morbiditeit op de muizen, technisch uitdagend en tijdrovend. Daarom hebben wij een hoge precisie, percutane benadering gebruik te maken van echografie begeleiding.

Minimaal Invasieve Oprichting van Muriene Orthotope Blaas Xenografts

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

Het algemene doel van deze procedure is om op een snelle, nauwkeurige en minimaal invasieve wijze orthotope blaaskanker-xenografts te creëren. Dit wordt bereikt door eerst de specifieke tumorcellijn uit te breiden en de tumorcellen in Matrigel te suspenderen. Vervolgens wordt het dier op het imagingplatform geplaatst en wordt de blaas met echografie gevisualiseerd.Vervolgens worden de mucosale en musculaire lagen in de blaas gescheiden met een zoutoplossingsinjectie. Ten slotte wordt de tumorcel-matrigelsuspensie in deze kunstmatig gecreëerde ruimte geïnjecteerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die tumorgroei aantonen via echografie en bioluminescentie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals het gebruik van laparotomie voor de inoculatie van primaire xenotransplantaten, is dat deze aanpak snel, nauwkeurig en minimaal invasief is. De implicaties van deze technieken strekken zich uit tot de diagnose en therapie van blaascancer, aangezien auto-xenotransplantaten de gouden standaard vormen voor preklinisch onderzoek naar nieuwe behandelingen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel omdat de injectiestappen vrij moeilijk aan te leren zijn en de wand erg dun is. Het demonstreren van deze procedure zal zijn.Igor Mosca beschikt over een onderzoeksassistent en Wolfgang Yeager is een postdoctoral fellow. Beiden zijn urologen. Na het bevestigen van de identiteit van de respectievelijke humane blaasstammencellijnen voor deze studie via DNA-fingerprinting, wordt een lentiviraal construct dat het firefly luciferase-gen draagt gebruikt om de cellijnen te transfecteren voor bioluminescentie-groeianalyse van xenograft-tumoren.Wanneer u klaar bent om met de procedure te beginnen, ontdooi en gebruik DMEM met 10% FBS om de bestaande cellijnen uit te breiden; incubeer deze bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer. Om na het ontdooien en het gebruik van matrigel een cel-suspensie voor injectie voor te bereiden, houdt u trypsine op ijs, gebruikt u cellen bij 70% confluentie en gebruikt u normaal groeimedium voor de suspensie; tel vervolgens de cellen en centrifugeer de suspensie bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Na het verwijderen van het supernatant voegt u de juiste hoeveelheid gelijke volumes DMEM-FBS en MATRIGEL toe om de gewenste celconcentratie te bereiken voor het injecteren van een volume van 40 µL per dier.Meng goed en voorkom de vorming van luchtbellen met behulp van een plat, rigide plastic materiaal. Snijd een blaasstabilisator, inspecteer de band zorgvuldig en verwijder eventuele scherpe randen voordat deze bij de muizen wordt aangebracht. Na het anesthetiseren van vrouwelijke muizen met 3% isofluraan in zuurstof en het uitvoeren van een knijptest in de teen.Om adequate sedatie te waarborgen, plaatst u het dier op de verwarmde beeldvormingstafel van het platform voor beeldvorming van kleine dieren, waarbij de vitale functies continu worden gemonitord met een elastiekje. Fixeer de onderste ledematen en gebruik 0,5% chloorhexidinegluconaat om de buik te desinfecteren voordat u de huid afveegt met een steriel wattenstaafje. Immobiliseer vervolgens de blaas met de blaasstabilisatieband om te voorkomen dat deze verschuift tijdens de intramurale injectie.Breng vervolgens steriele echogel aan op de onderbuik. Beweeg de echokop langzaam over de huid en visualiseer de blaas op het echoscherm. Als de blaas leeg is, gebruik dan 50 µL warme PBS in een transurethrale 24 gauge angiocatheter om deze te vullen, zodat de wandlagen van de blaas van elkaar gescheiden worden.Begin met het bevestigen van een spuit van 1,0 milliliter gevuld met PBS en verbonden met een naald van 30 gauge en driekwart inch aan de spuitklem. Positioneer de naald richting de huid net boven het schaambeen. Detecteer de naald op het echoscherm onder een hoek van 30 tot 45 graden voordat u langzaam de huid en de spieren van de buikwand perforeert.Draai vervolgens de schuine punt van de naald 180 graden zodat deze naar achteren is gericht, en voer de naaldpunt in de blaaswand in zonder de mucosa te penetreren. Injecteer vervolgens langzaam 50 µL PBS tussen de spierlaag en de mucosa om een kunstmatige ruimte te creëren voordat de naald wordt teruggetrokken. Om blaasstammencellen te injecteren, bevestigt u een tweede spuit van 1,0 mL gevuld met de matrigel-suspensie van kankercellen en een naald van 30 gauge en driekwart inch aan de spuitklem.Stuur de naaldpunt naar de met PBS gevulde ruimte. Injecteer vervolgens 40 µL van de suspensie in deze ruimte. Trek daarna de naald terug nadat de muis van het beeldvormingsplatform is gehaald.Houd het dier in een warme en comfortabele omgeving onder continue monitoring. Plaats het dier terug in de thuiskooi nadat het bij bewustzijn is en weer normaal kan lopen. Intramurale injectie van drie verschillende tumorcellijnen werd uitgevoerd bij 50 dieren onder echogeleiding op drie opeenvolgende dagen.De inoculatie werd efficiënt uitgevoerd en ging niet gepaard met intra- of postinterventionele complicaties. De monitoring van de tumorgroei werd uitgevoerd middels echografie en bioluminescentie. Op dag drie kon bij alle 50 dieren een tumor worden vastgesteld via echografie in de voorste blaas, en bij 98% van de muizen was er sprake van constante tumorgroei tijdens de follow-up periode na de inoculatie van uc.Three.Bij één muis ontwikkelde zich intraperitoneale tumordisseminatie en bij een tweede dier kromp de tumor na dag zeven. Dit was de eerste groep muizen die met deze nieuwe techniek was geïnoculeerd na inoculatie van uc.Three. Luke uc, one Luke, en uc.13 Luke. De muizen werden respectievelijk op dag 24, 28 en 37 geofferd. Xenograft-tumoren werden geoogst en onderzocht via h- en d-secties.Alle tumoren waren spierinvasief en sommige infiltreerden in het periviscerale vet, maar er werd geen invasie in aangrenzende organen waargenomen. 60% van de uc, 13 Luke, en 20% van de uc. Drie tumordragende Luke-muizen ontwikkelden retroperitoneale lymfekliermetastasen, wat werd bevestigd door h and e kleuring.Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in drie minuten worden uitgevoerd. Bekendheid met echografie is een vereiste voor het uitvoeren van deze procedure. Nadat tumoren op deze wijze zijn geïnoculeerd, stelt de echografie ons in staat om niet alleen de tumorgroei in de loop van de tijd te monitoren, maar ook om de tumorperfusie met microbellen te bestuderen. Het stelt ons daarnaast in staat om intratumorale injecties uit te voeren met nieuwe experimentele middelen.

minimally-invasive-establishment-murine-orthotopic-bladder

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Muis blaaswand injectie is een nuttige benadering voor orthotopically studie blaas stamcellen en kanker biologie. Deze delicate microchirurgische methode kan worden beheerst met een zorgvuldige techniek en praktijk.

Muis blaaswand Injection

Blaastumoren zijn gevestigd in vrouwelijke muizen in een minimaal invasieve wijze via catheterisatie, lokale cauterisatie, en de daaropvolgende aanhechting van carcinoom cellen om de branden sites.

Een orthotope Model van Murine Blaaskanker

De oprichting van een orthotope blaas tumor model om anti-tumor effecten van intravesicaal geleverd Sarna en monitoring groei van de tumor door middel van ultrageluid en bioluminescente beeldvorming te evalueren.

Een orthotope Blaas Tumor Model en de evaluatie van Intravesicale Sarna behandeling

This video describes the procedure to generate an experimental xenograft murine model, which can be used for studying urothelial cell carcinoma progression.

Patient-derived Tumor Xenografting: A Technique to Generate Experimental Mouse Model for Evaluating Urothelial Cell Carcinoma

In this video, we describe the orthotopic transplantation of cultured bladder tumor organoids into the murine bladder to study the role of the organ environment on developing tumors.

Bladder Tumor Organoid Model: A Method for Orthotopic Transplantation of Bladder Organoids into Recipient Murine Bladder

In this video, we describe the intravesical procedure of delivering cancer cells into the bladder of a mouse model. This procedure helps generate an orthotopic bladder tumor model that can be used to develop therapeutic strategies.

Modeling Orthotopic Bladder Tumor in Mouse Model: A Procedure for Intravesical Administration of Cancer Cells into Murine Bladder

Implantatie van kankercellen in het orgaan van oorsprong kan dienen als een nuttige preklinisch model om nieuwe therapieën te evalueren. MB49 blaascarcinoom cellen kunnen worden gekweekt in de blaas na intravesicale instillatie. Dit protocol toont katheterisatie van de blaas muis behoeve van tumor implantatie en adenovirale levering.

Een orthotope Blaaskanker Model voor Gene Delivery Studies

Dit protocol beschrijft de generatie van muizen orthotope blaastumoren bij vrouwelijke C57BL / 6J muizen en de monitoring van tumorgroei.

Een muizen orthotope Blaas Tumor Model en Tumor Detection System

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van echografie-geleide injectie van neuroblastoom (NB) en de Ewing sarcoom (ES) cellen (gevestigde cellijnen en patiënt afkomstige tumorcellen) op biologisch relevante sites maken van betrouwbare preklinische modellen voor kanker onderzoek.

Gebruik van echografie begeleide weefsel geleide cellulaire implantatie voor de oprichting van biologisch relevante uitgezaaide Tumor Xenografts

Dit protocol biedt gedetailleerde experimentele stappen om een driedimensionale in vitro cultuur van blaastumororganoïden afgeleid van kankerverwekkende murineblaaskanker vast te stellen. Cultuurmethoden zoals passaging, genetische manipulatie en orthotopische transplantatie van tumororganoïden worden beschreven.

Cultuur, manipulatie en orthotopische transplantatie van mouse bladder tumor organoïden

Leer een minimaal invasieve methode voor orthotopische blaaskankerxenotransplantatie met echogeleide injectie in muizen. Deze techniek vermindert dierenleed en maakt nauwkeurige monitoring van tumorgroei mogelijk.

Minimaal Invasieve Oprichting van Muriene Orthotope Blaas Xenografts

Meer video's verkennen