C. elegans chemotaxis-assay

De beweging van een cel of organisme als reactie op een chemische stimulus is een gedrag dat chemotaxis wordt genoemd. In deze video leren we hoe we een chemotaxis-assay kunnen uitvoeren met behulp van de nematode, C. elegans. We zullen ook bespreken hoe chemotaxis-assays in C. elegans worden toegepast om leren en geheugen, olfactorische adaptatie en de ziekte van Alzheimer te bestuderen.

Laten we eerst twee verschillende typen chemotaxis bespreken. Beweging naar een chemische stimulus toe wordt positieve chemotaxis genoemd. In tegenstelling hiermee wordt beweging weg van een chemische stimulus negatieve chemotaxis genoemd, waardoor organismen weg kunnen bewegen van schadelijke chemicaliën.

Chemotaxis kan plaatsvinden op het niveau van het organisme, wanneer organismen naar een voedselbron bewegen. Chemotaxis vindt ook plaats op cellulair niveau, binnen organismen. Zo migreren immuuncellen naar pathogenen of ontstekingsplaatsen. In een ander voorbeeld bewegen zaadcellen naar de eicel als reactie op een chemo-attractant die door de eicel wordt afgegeven. Chemotaxis is ook een belangrijk proces tijdens de ontwikkeling, waarbij cellen migreren als reactie op een chemische stimulus, waardoor weefsels en organen in het ontwikkelende organisme worden gevormd.

Voor wilde, in de bodem levende C. elegans is chemotaxis belangrijk voor de detectie van en beweging naar bacteriën, hun belangrijkste voedselbron. In tegenstelling hiermee worden C. elegans afgestoten door zware metalen, stoffen met een lage pH en detergentia, die toxisch zijn voor het organisme.

Chemotaxis-assays beginnen doorgaans met het voorbereiden van chemotaxis-platen. Verdeel met een liniaal en een markeerpen een plaat van 5 cm met nematode-groeimedium in vier gelijke kwadranten. Teken vervolgens een cirkel met een straal van 0,5 cm rond het midden van het kwadrant. Dit dient als het startpunt voor de wormen. Markeer en label een punt in elk kwadrant, zodanig dat elk punt equidistant is van het centrum en van elkaar.

Bij het voorbereiden van de wormen voor de assay is het essentieel om gebruik te maken van leeftijdgesynchroniseerde jonge volwassen wormen, zodat verschillen in chemotaxis geen artefact zijn van de ontwikkelingsfase. Zodra de wormen gesynchroniseerd zijn, worden ze verzameld door eerst 2 ml S-basale buffer op een plaat met jonge volwassenen te pipetteren. Draai en kantel de schaal om de wormen van de plaat te wassen.

Pipetteer vervolgens de worm/S-basale oplossing in een microcentrifugebuisje. Was de wormen door de worm/S-basale oplossing kort te centrifugeren, het supernatant te verwijderen en opnieuw een milliliter S-basale oplossing toe te voegen aan het wormpellet. Keer het buisje om en herhaal het wassen nog twee keer. Verwijder na het wassen alle S-basale oplossing, behalve ongeveer 100 μl. Voeg vervolgens 2 μl van het worm/S-basale mengsel toe aan een NGM-plaat. Tel met behulp van een microscoop het aantal aanwezige wormen. Idealiter zijn er tussen de 50-250 wormen per 2 μl S-basale buffer.

Nu de chemotaxisplaten en de wormen klaar zijn, kunnen we beginnen met de chemotaxisassay. Meng eerst gelijke volumes van uw testoplossing met 0,5 M natriumazide, een anestheticum dat de wormen zal verlammen zodra ze hun bestemming hebben bereikt. Doe hetzelfde met uw controleoplossing. Pipetteer vervolgens 2 μl van het worm/S-basaal mengsel op het midden van uw chemotaxisplaat. Pipetteer daarna 2 μl van de test- of controleoplossing en breng dit aan op de overeenkomstig gelabelde punten op de chemotaxisplaat. Zodra de test- en controleoplossingen zijn geabsorbeerd, plaatst u het deksel terug, keert u de plaat om en stelt u een timer in op 1 uur.

Nadat de wormen een uur de tijd hebben gehad om te reageren op de chemische stimuli op de plaat, kunnen de gegevens worden geanalyseerd. Tel handmatig het aantal wormen in elk kwadrant. Als de wormen worden aangetrokken door de geteste stof, zullen er meer wormen in die kwadranten aanwezig zijn. Als ze neutraal staan tegenover die stof, zullen de wormen gelijkmatig over elk kwadrant verdeeld zijn.

Gebruik deze gegevens om de chemotactische index te berekenen, wat het aantal wormen in de testkwadranten minus het aantal wormen in het controlekwadrant is, gedeeld door het totale aantal wormen. Een chemotactische index dicht bij +1 duidt op attractie, terwijl een chemotactische index dicht bij -1 wijst op repulsie.

Nu we hebben geleerd hoe we een chemotaxis-assay opzetten, kijken we naar hoe deze experimenten worden toegepast om wetenschappelijke vragen te beantwoorden.

Een van de manieren waarop chemotaxis-assays in C. elegans zijn toegepast, is voor het bestuderen van leren en geheugen. Wormen kunnen bijvoorbeeld worden geconditioneerd om een chemische stimulus te associëren met een voedselbron. Goed gevoede wormen worden één uur uitgehongerd en vervolgens geconditioneerd met voedsel en een chemische stof zoals butanon.

Vervolgens worden de wormen op een plaat met voedsel geplaatst, maar zonder butanon. Het uitvoeren van een chemotaxis-assay bepaalt dan of de wormen hebben geleerd om butanon met voedsel te associëren. Er kunnen veel variaties van dit experiment worden uitgevoerd om andere informatie te bepalen, zoals welke genen of neuronen belangrijk zijn voor leren en geheugen.

Olfactorische adaptatie is een fenomeen waarbij sensorische neuronen hun respons op een stimulus na verloop van tijd verminderen, waardoor het dier kan reageren op andere, mogelijk belangrijkere stimuli. Bijvoorbeeld: wild-type C. elegans die gedurende een bepaalde tijd aan een geur zijn blootgesteld, zullen die geur tijdens een chemotaxis-assay negeren vanwege olfactorische adaptatie, in plaats van erop aangetrokken te worden. Daarom kunnen high-throughput genetische screens worden uitgevoerd om de genetische regulatoren van olfactorische adaptatie te onthullen, zoals egl-4. Daarnaast kunnen transgene wormen die fluorescent gelabelde eiwitten tot expressie brengen, worden geobserveerd op veranderingen in lokalisatie tijdens olfactorische adaptatie.

Ten slotte kunnen chemotaxis-assays in C. elegans worden gebruikt om de ziekte van Alzheimer te bestuderen. Wetenschappers kunnen fluorescent gelabeld menselijk amyloïd-beta-peptide - een kenmerk van de ziekte van Alzheimer - tot expressie brengen in de neuronen van C. elegans. Interessant is dat chemotaxis-assays onthulden dat wormen die amyloïd-beta tot expressie brengen in een populatie neuronen een verminderde chemotaxis vertonen naar een chemo-attractant vergeleken met de controle. Veel variaties van dit experiment kunnen worden uitgevoerd, waaronder het tot expressie brengen van amyloïd-beta in andere neuronpopulaties of weefsels, of het bepalen of bepaalde verbindingen de effecten van amyloïd-beta-expressie kunnen verlichten, wat uiteindelijk kan leiden tot een potentiële therapie.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over chemotaxis bij C. elegans bekeken. Allereerst hebben we gedefinieerd wat chemotaxis is en waarom dit in de natuur belangrijk is voor organismen en cellen. Vervolgens hebben we gedemonstreerd hoe een chemotaxis-assay met C. elegans kan worden uitgevoerd. Ten slotte hebben we besproken hoe chemotaxis kan worden toegepast om leren en geheugen, olfactorische adaptatie en de ziekte van Alzheimer te begrijpen. Bedankt voor het kijken!