Met behulp van fluorescerende eiwitten te visualiseren en te kwantificeren

Het algemene doel van deze procedure is om de groeidynamiek van chlamydiale inclusies in levende cellen te visualiseren en te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst fluorescerende gastheercellen te genereren die stabiel een fluorescerend eiwit zoals GFP in hun cytoplasma tot expressie brengen. Vervolgens worden de gastheercellen geïnfecteerd met chlamydia en gedurende een bepaalde tijd geïncubeerd.

Daarna worden de geïnfecteerde cellen gevisualiseerd door middel van live fluorescentiemicroscopie. Uiteindelijk wordt chlamydia inclusiekenmerken gekwantificeerd door middel van microscoopanalysesoftware, waarbij uiteindelijk live fluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om chlamydiale inclusies binnen de gastheercel te visualiseren en om biologische parameters van inclusies te meten voor kwantitatieve resultaten. De belangrijkste voordelen van deze techniek boven bestaande methoden zoals op antilichamen gebaseerde enumeratie zijn dat deze omgekeerde beeldvormingsstrategie kan worden gebruikt op levende cellen en ook in samenwerking met andere fluorescerende labels om inclusiedynamiek van alle chlamydiale soorten te kwantificeren.

Bovendien, in tegenstelling tot routinemethoden die bacteriën in cellen labelen, verlicht deze aanpak de inclusiemembraan in levende cellen en kan daarom belangrijke dynamische eigenschappen van dit pathogeenbevattende compartiment onthullen. Na het genereren van fluorescerende hela cellen, volgens het tekstprotocolplaat, GFP Hela cellen op een gewenst kweekvat, zoals glazen bodem schotels voor hoge resolutie beeldvorming 4 24 wel platen voor IFU bepaling en multi-well screening ontdooi een bevroren buis met crich cotus, of elke andere gewenste chlamydiale stam op ijs en verdun in HBSS tot de gewenste infectiemultipliciteit. Om een statische infectie met Crich Cotus, LGV zero VL twee uit te voeren, zuig het medium uit de wells en gebruik HBSS om de GFP hela cellen te wassen.

Voeg verdunde bacteriën toe aan de wells en incubeer gedurende twee uur op 25 graden Celsius, zuig de cellen op en was met HBSS. Vervolgens, na toevoeging van groeimedium, incubeer de cellen gedurende één uur bij 37 graden Celsius in een kooldioxide-incubator om een centrifugatie-geassisteerde infectie met crich tot serovar D of elke andere chlamydiale stam uit te voeren. Gebruik HBSS om de GFP hela cellen te wassen en voeg verdunde bacteriën toe aan de cellen.

Plaats vervolgens de schaal met geïnfecteerde cellen in een multi-well platen houder van een zwevende emmer rotor in een tafelcentrifuge. Centrifugeer de cellen bij 900 keer G en 25 graden Celsius gedurende één uur. Plaats vervolgens de kweekvaten in een kooldioxide-incubator van 37 graden Celsius gedurende één uur in een bioveiligheidskast, zuig de cellen op, was twee keer met HBSS en voeg groeimedium toe.

Incubeer de schaal met geïnfecteerde cellen gedurende één uur bij 37 graden Celsius. Om chlamydia inclusies te visualiseren, verwijder chlamydia geïnfecteerde GFP hela cellen uit de kooldioxide-incubator en gebruik RPMI zonder fenolrood en 5% FBS Om het medium te vervangen, plaats de schaal of multi-well plaat op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een 20 x of hoger olie objectief. Gebruik beeldvormingssoftware om chlamydia geïnfecteerde GFP hela cellen te identificeren die verschijnen als groene cellen met grote zwarte gaten.

In het acquisitie setup dialoogvenster, configureer de software om het groene kanaal en elk ander kanaal dat in het monster is toegevoegd te verwerven. Gebruik de opname/opname knop om de afbeelding op de gewenste tijdstippen te verwerven. Na infectie. Verwijder chlamydia geïnfecteerde GFP hela cellen uit de incubator en plaats de schaal op een inverteer fluorescentiemicroscoop.

Focus op de middelste vlakten van de cellen waar inclusies hun maximale diameter en opbrengst hebben. Scherpe randen verwerven afbeeldingen in ten minste 10 velden per well. Wells vertegenwoordigen doorgaans replica's of experimentele variabelen.

Om GFP hela cellen te vinden onder het meettabblad, gebruik de opdracht objecten vinden en selecteer het groene kanaal. Pas de drempelintensiteit aan op basis van relatieve intensiteiten van cellen. Tel handmatig het aantal inclusies of zwarte compartimenten en GFP hela cellen met het oog of gebruik beeldvormingssoftware algoritmen om automatisch inclusies te identificeren en te tellen.

Filter de geselecteerde objecten door alleen die te behouden die groter zijn dan vijf vierkante micrometer. Noem dit populatie een. Gebruik deze populatie en pas de vul gaten in objecten opdracht toe als invoer deze stap genereert populatie twee.

Trek populatie één af van populatie twee om positief gemarkeerde chlamydia inclusies aan te duiden als populatie drie. Gebruik de opdracht populatie filteren om een groottefilter toe te passen op populatie drie. Bijvoorbeeld, houd objecten groter dan 25 vierkante micrometer voor inclusies in cellen, geïnfecteerd gedurende 24 uur of langer voor vroege infectietijden stel de groottefilter in om objecten groter dan vierkante micrometer te behouden.

Aangezien deze inclusies veel kleiner zijn, resulteert de groottefilter in een populatie van objecten die zijn aangeduid als inclusies. Gebruik de beeldvormingssoftware om kwantitatieve gegevens uit de afbeeldingen te berekenen, zoals inclusienummer, inclusie, grootte en inclusie. Omtrek bij infectie met chlamydia inclusies zijn gemakkelijk zichtbaar als zwarte vlekken en de gastheercellen of fluorescerend eiwit expresserende chlamydia binnen gastheercellen, en hun helderheid kan worden benut voor geautomatiseerde identificatie over talrijke gezichtsvelden en/of behandelingen.

Zoals aangetoond in deze grafiek, is een belangrijke toepassing de bepaling van chlamydia inclusievormingseenheden in levend geïnfecteerde cellen, wat de noodzaak voor immunofluorescentieprocedures, die zowel tijdrovend als kostbaar zijn, overbodig maakt. Een ander belangrijk kenmerk van deze beeldvormingsbenadering is dat het gemakkelijk kan worden toegepast op elke chlamydia soort of stam. In dit voorbeeld werd een tijdsverloopanalyse van GFP hela cellen geïnfecteerd met een van vier chlamydiale soorten of stammen uitgevoerd voor elk van deze soorten en stammen.

Inclusies werden gemarkeerd en geanalyseerd om hun gemiddelde gebiedsomtreklengte en aantal per cel op de aangegeven tijdstippen te berekenen