Met behulp van fluorescerende eiwitten te visualiseren en te kwantificeren Chlamydia Vacuole groeidynamiek in levende cellen

Het algemene doel van deze procedure is om de groeidynamiek van chlamydiale inclusies in levende cellen te visualiseren en te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst fluorescerende gastcellen te genereren die stabiel een fluorescerend eiwit zoals GFP in hun cytoplasma tot expressie brengen. Vervolgens worden de gastcellen geïnfecteerd met chlamydia en gedurende een bepaalde tijd bewaard.

Vervolgens worden de geïnfecteerde cellen gevisualiseerd door middel van levende fluorescentiemicroscopie. Ten slotte worden de kenmerken van chlamydia-inclusies gekwantificeerd door middel van microscoopanalysesoftware. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om chlamydiale inclusies in de gastcellen te visualiseren en om biologische parameters van inclusies te meten voor kwantitatieve resultaten. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals antilichaam-gebaseerde telling zijn dat deze omgekeerde beeldvormingsstrategie kan worden gebruikt op levende cellen en ook in combinatie met andere fluorescerende labels om de inclusiedynamiek van alle chlamydiale soorten te kwantificeren.

Bovendien, in tegenstelling tot routinemethoden die bacteriën in cellen labelen, verlicht deze aanpak de inclusiemembraan in levende cellen en kan daardoor belangrijke dynamische eigenschappen van dit pathogeen bevattende compartiment onthullen. Na het genereren van fluorescerende hela-cellen, volgens het protocol in de tekst, worden GFP Hela-cellen op een gewenst kweekvat geplaatst, zoals glazen bodemschotels voor hoge resolutie beeldvorming, 4 24-welplaten voor IFU-bepaling en multi-well screening. Ontdoe een bevroren buisje met crich cotus, of een andere gewenste chlamydiale stam, van ijs en verdun in HBSS tot de gewenste infectiemultipliciteit. Om een statische infectie uit te voeren met Crich Cotus, LGV zero VL twee, aspireer het medium uit de putjes en gebruik HBSS om de GFP hela-cellen te wassen.

Voeg verdunde bacteriën toe aan de putjes en incubeer gedurende twee uur bij 25 graden Celsius, aspireer de cellen en was met HBSS. Voeg vervolgens groeimedium toe en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een koolstofdioxide-incubator om een centrifugatie-ondersteunde infectie met crich tot serovar D of een andere chlamydiale stam uit te voeren. Gebruik HBSS om de GFP hela-cellen te wassen en voeg verdunde bacteriën toe aan de cellen.

Plaats vervolgens de schaal met geïnfecteerde cellen in een multi-well platenhouder van een roterende emmer in een tafelcentrifuge. Centrifugeer de cellen bij 900 keer G en 25 graden Celsius gedurende één uur. Plaats vervolgens de kweekvaten gedurende één uur in een koolstofdioxide-incubator van 37 graden Celsius in een bioveiligheidskast, aspireer de cellen, was twee keer met HBSS en voeg groeimedium toe.

Incubeer de schaal met geïnfecteerde cellen bij 37 graden Celsius. Om chlamydia-inclusies te visualiseren, verwijder chlamydia-geïnfecteerde GFP hela-cellen uit de koolstofdioxide-incubator en gebruik RPMI zonder fenolrood en 5%FBS Om het medium te vervangen, plaats de schaal of multi-well plaat op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een 20 x of hogere olie objectief. Gebruik beeldvormingssoftware om chlamydia-geïnfecteerde GFP hela-cellen te identificeren die verschijnen als groene cellen met grote zwarte gaten.

In het dialoogvenster van de acquisitie-instellingen configureert u de software om het groene kanaal en elk ander kanaal dat in het monster is toegevoegd, te verkrijgen. Gebruik de opname/opname-knop om de afbeelding op de gewenste tijdstippen te verkrijgen.Na infectie. Verwijder chlamydia-geïnfecteerde GFP hela-cellen uit de incubator en plaats de schaal op een inverteerde fluorescentiemicroscoop.

Richt je op de middelste vlakten van de cellen waar inclusies hun maximale diameter en opbrengst hebben. Scherpe randen verwerven beelden in minimaal 10 velden per put. Putten vertegenwoordigen typisch replica's of experimentele variabelen.

Om GFP hela-cellen te vinden onder het meettabblad, gebruik de opdracht objecten zoeken en selecteer het groene kanaal. Pas de drempelintensiteit aan op basis van relatieve intensiteiten van cellen. Tel handmatig het aantal inclusies of zwarte compartimenten en GFP hela-cellen met het oog of gebruik beeldvormingssoftware-algoritmen om inclusies automatisch te identificeren en te tellen.

Filter de geselecteerde objecten door alleen die groter dan vijf vierkante micrometer te behouden. Noem dit populatie een. Gebruik deze populatie, pas de vulgaten in objecten-opdracht toe als de input. Deze stap genereert populatie twee.

Trek populatie een af van populatie twee om positief gemarkeerde chlamydia-inclusies aan te duiden als populatie drie. Gebruik de filterpopulatie-opdracht om een groottefilter toe te passen op populatie drie. Bijvoorbeeld, behoud objecten groter dan 25 vierkante micrometer voor inclusies in cellen, geïnfecteerd gedurende 24 uur of langer voor vroege infectietijden, stel de groottefilter in om objecten groter dan vier vierkante micrometer te behouden.

Aangezien deze inclusies veel kleiner zijn, resulteert de groottefilter in een populatie van objecten die als inclusies worden aangeduid. Gebruik de beeldvormingssoftware om kwantitatieve gegevens uit de afbeeldingen te berekenen, zoals inclusienummer, inclusie, grootte en inclusie. Omtrek bij infectie met chlamydia-inclusies zijn gemakkelijk zichtbaar als zwarte vlekken en de gastcellen of fluorescerend eiwit dat chlamydia binnen gastcellen tot expressie brengt, en hun helderheid kan worden benut voor geautomatiseerde identificatie over talrijke gezichtsvelden en/of behandelingen.

Zoals gedemonstreerd in deze grafiek, is een belangrijke toepassing de bepaling van chlamydia-inclusievormingseenheden in levende geïnfecteerde cellen, wat de noodzaak voor immunofluorescentieprocedures, die zowel tijdrovend als duur zijn, overbodig maakt. Een ander belangrijk kenmerk van deze beeldvormingsaanpak is dat deze gemakkelijk kan worden toegepast op elke chlamydia-soort of stam. In dit voorbeeld werd een tijdsverloopanalyse van GFP hela-cellen geïnfecteerd met een van de vier chlamydiale soorten of stammen uitgevoerd voor elk van deze soorten en stammen.

Inclusies werden gemarkeerd en geanalyseerd om hun gemiddelde oppervlakte, omtreklengte en