Name: Met behulp van fluorescerende eiwitten te visualiseren en te kwantificeren Chlamydia Vacuole groeidynamiek in levende cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Leer fluorescerende microscopie om Chlamydia-inclusiegroei in levende cellen te visualiseren en kwantificeren. Deze methode biedt real-time inzicht in infectiedynamiek en werkt voor alle chlamydia-soorten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Ian Clarke en P. Scott Hefty voor de pGFP-SW2 en pASK-GFP-mKate2-L2 plasmiden, respectievelijk. We danken Paul Miller voor technische assistentie en Richard Stephens voor andere bronnen. Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidie AI095603 (KH).

1. Generatie van Fluorescent gastheercellijnen <ol><li> Dag 1. Plaat 293T cellen (of andere retrovirale verpakkingslijn) op 6-putjes platen bij 2 x 10 6 cellen / putje, worden ~ 75% confluent de volgende dag. Desgewenst plaat duplo putjes voor elk retrovirus te gebruiken. </li><li> Dag 2. Zuig cellen en voeg 2 ml vers groeimedium (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine). Transfecteren van cellen met 5-8 ug per retrovirale vector (bevattende GFP) en verpakkingsvector (bv., PVSVg) met gebruik van Lipofectamine 2000 of soortgelijke reagentia en de instructies van de fabrikant. </li><li> Incubeer de cellen met DNA voor 4-6 uur in een 37 ° C CO2 incubator, en vervolgens vervangen door medium met 1 ml groeimedium. </li><li> Incubeer cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C CO 2 incubator. </li><li> Dag 3. Plaat doelcellen (bv., HeLa) op 6-putjes platen bij een geschatte dichtheid van 10 5 cellen / putje, worden ~ 50% confluent dede volgende dag. Controleer positieve transfectie in 293T-cellen door het volgen GFP fluorescentie op een omgekeerde microscoop. </li><li> Dag 4. Collect retrovirus-bevattende supernatanten uit 293T cellen met behulp van een pipet en filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,45 urn spuitfilter celluloseacetaat. </li><li> Verwijder medium uit HeLa-cellen en voeg 0,5 ml kweekmedium dat 16 ug / ml polybreen. Voeg ~ 0,5 ml gefiltreerd retrovirus cellen druppelsgewijs en incubeer cellen in een 37 ° C CO2 incubator gedurende 24 uur. Slaan alle resterende retrovirus (dwz van zowel het dupliceren) bij 4 ° C. </li><li> Dag 5. Indien duploputjes werden gemaakt om extra retrovirus Herhaal stap 1,7 genereren om serieel te infecteren met de rest van retrovirale deeltjes. </li><li> Dag 6. Passage getransfecteerde HeLa-cellen 1: 1 in een 10 cm schotel met selectie antibioticum (bijvoorbeeld 500 ug / ml neomycine). </li><li> Wacht voldoende tijd getransduceerde cellen om terug te groeien in aanwezigheid van selectie antibiotic, waarna de cellen kunnen worden vermeerderd door standaardtechnieken met een lagere concentratie selectie antibioticum (bv., 200 ug / ml neomycine). Opmerking: Cellen kunnen ook klonaal worden gekozen voor een optimale helderheid op dit moment, indien nodig. </li></ol> 2. Genereren van GFP tot expressie Chlamydia trachomatis <ol><li> Bereid 2x CaCl2 buffer (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM CaCl 2) en 4SP buffer (0,4 M sucrose, 16 mM Na 2 HPO 4). </li><li> Dag 1. Ontdooi bevroren C. trachomatis voorraad op ijs en onmiddellijk verdunnen 10 pi bacteriën in 50 ul 2x CaCl2 buffer. Voeg 3 ug plasmide DNA (bv., PASK-GFP-mKate2-L2), mengen en incuberen gedurende 30 min bij 25 ° C. </li><li> Tijdens deze stap te bereiden gastheercellen door trypsinizing een T-75 kolf van McCoy-cellen in een centrifugebuis. Centrifugeer de celsuspensie bij 50 x g gedurende 5 minuten en de bovenstaande vloeistof. Resuspend celpellet in zodanige hoeveelheid van 1 x CaCl2 buffer tot een eindconcentratie van 4 x 10 7 cellen / ml. </li><li> Na 30 min incubatie (uit stap 2.2), voeg 100 ul bereid McCoy cellen transformatiemengsel buis (totaal volume 200 ui) en incubeer nog eens 20 min bij 25 ° C. Voeg 100 ul van deze getransformeerde cel mengsel tot een enkel putje van een 6-wells plaat en overlay met 2 ml groeimedium. Incubeer bij 37 ° C in een CO2 incubator gedurende 2 dagen. </li><li> Dag 3. Lyse McCoy cellen geïnfecteerd met C. trachomatis door medium vervangen door 1 ml dH 2 O en schrapen cellen met een gebogen 1000 ui pipet tip. Voeg 1 ml 4SP buffer en passeren suspensie door een 27,5 G naald ~ 5 keer voor een efficiënte cellysis en afgifte van C. trachomatis. </li><li> Overdracht 2 ml van het cellysaat bevattende C. trachomatis een T-75 kolf die een confluente monolaag van vers uitgeplaat McCoy cellen; voeg 8 ml DMEM (zonder FBS) en incubeer gedurende 2 uur bij 25 ° C C. toestaan trachomatis te houden aan cellen. </li><li> Aspireren cellen en voeg vers medium growth gesupplementeerd met 10 U / ml penicilline G en 1 ug / ml cycloheximide. Incubeer kolf gedurende 48 uur in een 37 ° C CO 2 incubator. </li><li> Dag 4. Controleer met lichtmicroscopie dat cellen worden besmet en insluitsels bevatten afwijkende Chlamydia. Identificeren insluitsels zo helder vacuoles op een standaard lichtmicroscoop, en afwijkende Chlamydia organen ring-achtige objecten binnen insluitsels die groter zijn dan 2 micrometer doorsnede. </li><li> Dag 5. Lyse cultuur door het medium vervangen met 2 ml dH 2 O en schraap cellen in een suspensie. Voeg 2 ml 4SP buffer en passeren suspensie door een 27,5 G naald ~ 5 keer. </li><li> Gebruik 2 ml cellysaat een nieuwe monolaag van McCoy-cellen te infecteren in een enkel putje in een 6-wells plaat. Incubeer cellen met lysaat gedurende 2 uur bij 25 ° C, aspireren en voeg verse groeimedium met penicilline G en cycloheximide. </li><li> Incubeer cellen in een 37 ° C CO2 incubator gedurende 3-5 dagen, afhankelijk van de algemene gezondheid van de cellen. </li><li> Herhaal stap 2,9-2,10 één of meer keren, indien nodig, passage culturen in verse putjes in een 6-wells plaat tot normaal uitziende insluitsels (zonder afwijkende instellingen) ontstaan. Op dit moment gebruik maken van een omgekeerde fluorescentie microscoop om te controleren of C. trachomatis uiten mKate2 (rood). </li><li> Opschalen geïnfecteerde kweken voor het genereren van hoge titer Chlamydia voorraden, bijvoorbeeld door het oogsten Chlamydia transformanten van geïnfecteerde McCoy of HeLa-cellen gekweekt in T-150 kolven. </li></ol> 3. Infecteren Cellen met Chlamydia <ol><li> Plate GFP-HeLa cellen op gewenste kweekvat, bijvoorbeeld glazen bodem gerechten of kamer objectglaasjes voor hoge resolutie beeldvorming of 24-well platen voor IFU bepalen en multiwell screening. </li><li> Dooi weerzen buis met C. trachomatis, C. muridarum of C. pneumoniae op ijs en verdund in HBSS gewenste multipliciteit van infectie (MOI), bijvoorbeeld MOI = 1. </li><li> Voer statisch of centrifugeren aided infecties op basis van de specifieke Chlamydia stam die wordt gebruikt. <ol><li> Voor infecties met C. trachomatis LGV serovar L2 of C. muridarum, was GFP-HeLa-cellen met HBSS en geïncubeerd met verdunde bacteriën gedurende 2 uur bij 25 ° C. Aspireren en wassen cellen met HBSS, en incubeer cellen in groeimedium bij 37 ° C CO 2 incubator. </li><li> Voor infecties met C. trachomatis serovar D of C. pneumoniae, was GFP-HeLa-cellen met HBSS en voeg verdunde bacteriën aan cellen. Plaats multiwell plaat of een glazen bodem schaal (vastgezet met tape in een multiwell plaat deksel) in een multiwell plaat houder van een swingende emmer rotor bijlage in een benchtop centrifuge. </li><li> Centrifugeer cellen bij 900 xg bij 25 ° C gedurende 1 uur. </li&gt; <li> Kweekvaten verwijderen uit centrifuge en plaats in een 37 ° C CO 2 incubator gedurende 1 uur. </li><li> Aspiraat cellen in een bioveiligheid kast, wassen cellen tweemaal met HBSS en voeg vers groeimedium. Plaats cellen in een 37 ° C CO 2 incubator. </li></ol></li></ol> 4. Levende Cell Visualisatie van Chlamydia Inbegrepen <ol><li> Verwijder Chlamydia besmet GFP-HeLa-cellen van CO 2 incubator en vervangen door medium met RPMI zonder fenolrood + 5% FBS. </li><li> Mount cellen op een omgekeerde fluorescentie microscoop (Nikon Eclipse Ti-E of vergelijkbaar) met behulp van een 20X of hoger olie doelstelling. </li><li> Met behulp van imaging software (Volocity 6 of iets dergelijks), gericht op het identificeren en Chlamydia besmet GFP-HeLa-cellen: groene cellen met grote zwarte gaten (Chlamydia inclusies). </li><li> Markeer de xyz locaties van gebieden met Chlamydia geïnfecteerde cellen van belang het gebruik van imaging software (Volocity 6 of iets dergelijks). Uitvoeren van deze door het handmatig &#39;toevoegen Points&#39;, terwijl in de XY Stage weergavemodus. Op deze wijze worden XYZ coördinaten opgeslagen voor elke gemarkeerde positie. </li><li> In het dialoogvenster Overname doos, software configureren naar groen (GFP, HeLa cytosol) en rode (mKate2, C. trachomatis) kanalen, en met een snelheid van nieuwe frames per kanaal om de 5 min te verwerven. </li><li> Verwerven van de beeldsequentie met de overname protocol hierboven opgegeven door te klikken op de &quot;Capture Record /&quot; knop. </li></ol> 5. kwantificering van Inclusie Groei Parameters in levende cellen <ol><li> Op gewenste tijden na de infectie (bv., 24, 48 HPI) verwijder Chlamydia GFP geïnfecteerde HeLa-cellen uit incubator en monteren op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Opmerking: een objectief met een hoge NA 20x of 40x air is het best geschikt voor 24-wells platen en een 40x olie doelstelling wordt aanbevolen voor Kamer slides. Kweek cellen aan beide substraat voor deze ezelay. </li><li> Focus op midplanes van de cellen, waar de insluitsels zijn op hun maximale diameter en op scherpe randen. </li><li> Acquire afbeeldingen voor vele gebieden in elk putje (minimaal 10 per well); putten vertegenwoordigen doorgaans herhalingen of experimentele variabelen. </li><li> Inventariseer het aantal insluitingen handmatig, door het oog (insluitsels zijn zwart compartimenten in GFP-HeLa-cellen) of gebruik maken van imaging software algoritmen om insluitsels automatisch te identificeren en te tellen. <ol><li> Vind GFP-HeLa-cellen door fluorescentie-intensiteit (&#39;vind Objects&#39; commando) en stel fluorescentie drempel intensiteit op basis van relatieve intensiteiten van de cellen. </li><li> Filter geselecteerde objecten met behulp van grootte richtlijnen van het houden van die slechts groter is dan 5 micrometer 2. Dit is &#39;populatie 1&#39;. </li><li> Solliciteer &#39;Vul Gaten in Objects&#39; opdracht met &#39;bevolking 1&#39; als de input. Deze stap genereert &#39;populatie 2&#39;. </li><li> Aftrekken &#39;bevolking 1&#39; van &#39;population 2 &#39;om de opbrengst positief gemarkeerd Chlamydia inclusies, aangeduid als&#39; de bevolking 3 &#39;. </li><li> Toepassen size filter van &quot;populatie 3&quot; (&quot;Filter Population&quot; command) bijvoorbeeld houden voorwerpen groter dan 25 urn 2 van insluitingen in geïnfecteerde cellen gedurende 24 uur of langer. Voor de vroege infectie maal, bijvoorbeeld vóór 18 uur, stellen grootte filter om objecten groter dan 4 urn 2 te houden, omdat deze inclusies veel kleiner. Grootte filtering resulteert in een populatie van objecten als &#39;inclusies&#39;. </li><li> Bereken kwantitatieve gegevens uit afbeeldingen, bijvoorbeeld nummer opnemen, grootte integratie en inclusie omtrek, met behulp van beeldbewerkingssoftware. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+infections%3A+progress+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis infections: progress and problems.</a> The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).</li>
<li>Schachter, J. Infection and disease epidemiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchachter%2C+J+%22Chlamydia%3A+Intracellular+Biology%2C+Pathogenesis%2C+and+Immunity%22">Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity</a>. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).</li>
<li>Campbell, L. A., Kuo, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+pneumoniae--an+infectious+risk+factor+for+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).</li>
<li>Darville, T., Hiltke, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+genital+tract+disease+due+to+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).</li>
<li>Hackstadt, T. Cell biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHackstadt%2C+T+%22Chlamydia%3A+Intracellular+Biology%2C+Pathogenesis%2C+and+Immunity%22">Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity</a>. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).</li>
<li>Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis%3A+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector).</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258(2011).</li>
<li>Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Chlamydia+trachomatis-infected+cells%3A+directed+trafficking+of+Golgi-derived+sphingolipids+to+the+chlamydial+inclusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).</li>
<li>Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labelling+of+intracellular+bacteria+in+living+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).</li>
<li>Hybiske, K., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+host+cell+exit+by+the+intracellular+bacterium+Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).</li>
<li>Heinzen, R. A., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydia+trachomatis+parasitophorous+vacuolar+membrane+is+not+passively+permeable+to+low-molecular-weight+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds.</a> Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).</li>
<li>Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+expression+in+Chlamydia+trachomatis+using+the+tet+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system.</a> PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).</li>
<li>Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+recruitment+to+the+Chlamydia+inclusion+is+spatiotemporally+regulated+by+a+mechanism+that+requires+host+and+bacterial+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors.</a> PLoS One. 7 (10), e46949(2012).</li>
<li>Agaisse, H., Derré, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+trachomatis+cloning+vector+and+the+generation+of+C.+trachomatis+strains+expressing+fluorescent+proteins+under+the+control+of+a+C.+trachomatis+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter.</a> PLoS One. 8 (2), e57090(2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Hier beschrijven we de experimentele strategie voor het genereren van fluorescente gastheercellen voor real time visualisatie en analyse van Chlamydia inclusies. Deze vacuole visualisatie benadering verleent het krachtige vermogen te verlichten, volgen en kwantitatief meten van de dynamische eigenschappen van Chlamydia inclusies tussen populaties van cellen of enkele cellen in de tijd. Chlamydia inclusies in fluorescent eiwit gelabelde cellen opvallend goed gedefinieerd, zodat ze gemakkelijk geïdentifi...

Infectieziekten veroorzaakt door species van de intracellulaire bacterie Chlamydia wekken grote belasting voor wereldwijde gezondheid, waaronder seksueel overgebrachte ziekte, eileiderontsteking, blindheid, longontsteking en eventueel atherosclerose 1-4. Het vermogen van Chlamydia om met de gastheercel, vanuit een vacuole (genaamd de opname), is een bepalende factor voor hun succesvolle infectie van cellen en de gastheer. De opname is een nieuwe pathogene compartiment dat chlamydia groei mogelijk maakt en wordt dynamisch aangepast gedurende de hele 2-3 dag ontwikkelings cyclus van Chlamydia 5. De obligate intracellulaire aard van chlamydiae presenteert talrijke uitdagingen voor de onderzoeksgemeenschap, in het bijzonder voor het direct bestuderen van de unieke biologie van de integratie. Een grote handicap is het onvermogen om efficiënt te visualiseren ofwel intracellulaire Chlamydia of hun opname door TL-aanpakes in levende cellen. Een recente ontdekking heeft eindelijk onthuld de middelen om GFP tot expressie C. genereren trachomatis 6; echter, is deze bevinding nog niet geleid tot de specifieke kenmerken van de integratie. Sommige technieken zijn beschreven voor labeling van bacteriën en insluitsels 7,8, maar ze vertonen tekortkomingen zoals niet-specificiteit, vergankelijkheid en gevoeligheid voor fotobleken. Een belangrijke ontdekking door onze groep werd een nieuwe strategie voor het verlichten van de opname met behulp van GFP tot expressie gastheercellen 9. Deze strategie rationeel exploiteert de intrinsieke ondoordringbaarheid van de opname membraan moleculen groter dan 520 Da 10. Wanneer cellen worden gemanipuleerd om stabiel drukken een bepaald cytosolische fluorescent eiwit (bijvoorbeeld GFP of mCherry), Chlamydia insluitsels zichtbaar met opmerkelijk heldere hun volledige uitsluiting van fluorescentie. Deze omgekeerde beeldvorming strategie maakt directe visualisatie van insluitsels voor alle Chlamydia species en kan gemakkelijk worden aangepast voor de meeste gastheercellen van belang. Als een demonstratie van het nut ervan, werd deze methode eerder gebruikt te onthullen en te definiëren de cellulaire exit routes voor Chlamydia spp 9. Hier hebben we verder aan te tonen hoe deze methode wordt uitgevoerd, en kan worden benut om belangrijke kwantitatieve gegevens over de groei inclusie dynamiek ontlenen. Bovendien kan het effectief vervangen dure antilichamen gebaseerde inventarisatie werkwijzen en kan worden gebruikt in combinatie met andere fluorescente labels, zoals mKate2-expressie Chlamydia 11. Deze krachtige combinatie van instrumenten mogelijk maakt onderzoek van de fysische eigenschappen van de chlamydiale membraan integratie binnen levende gastheercellen.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro;m filters</td><td>Fisher</td><td>09-719D</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen</td><td>10131</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 w/o phenol red</td><td>Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G</td><td>Sigma</td><td>13752</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Chamber slides, Lab-Tek II</td><td>Nunc</td><td>154526, 154534</td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van fluorescerende eiwitten te visualiseren en te kwantificeren<em&gt; chlamydia</em&gt; vacuole groeidynamiek in levende cellen

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

De obligate intracellulaire bacterie Chlamydia levert een grote belasting op de wereldwijde volksgezondheid. C. trachomatis is de belangrijkste bacteriële oorzaak van seksueel overdraagbare infecties en ook de belangrijkste oorzaak van voorkombare blindheid in de wereld. Een essentiële bepalende factor voor succesvolle infectie van gastcellen door Chlamydia is het vermogen van de bacterie om signaalroutes van gastcellen te manipuleren vanuit een nieuw, vacuolair compartiment genaamd de inclusie. Vanuit de inclusie verwerven Chlamydia voedingsstoffen die nodig zijn voor hun 2-3 dagen durende ontwikkelingsgroei, en ze scheiden bovendien een reeks effector-eiwitten uit op het cytosolische oppervlak van het vacuolemembraan en in het gastheercytosol. Gaten in ons begrip van de biologie van Chlamydia vormen echter aanzienlijke uitdagingen voor het visualiseren en analyseren van dit intracellulaire compartiment. Onlangs werd een reverse-imagingstrategie beschreven voor het visualiseren van de inclusie met behulp van GFP-expresserende gastcellen. Deze benadering maakt rationeel gebruik van de intrinsieke ondoorlaatbaarheid van het inclusiemembraan voor grote moleculen zoals GFP. In dit werk beschrijven we hoe GFP- of mCherry-expresserende gastcellen worden gegenereerd voor daaropvolgende visualisatie van chlamydiale inclusies. Bovendien wordt aangetoond dat deze methode effectief kan worden gebruikt als vervanging voor dure antilichaamgebaseerde telmethoden, kan worden gebruikt in tandem met andere fluorescente labels, zoals GFP-expresserende Chlamydia, en kan worden gebruikt om belangrijke kwantitatieve gegevens over inclusiemembraangroei te verkrijgen van een reeks Chlamydia-soorten en -stammen.

Zoogdiercellen tot expressie cytosolische fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld GFP) kan worden gemanipuleerd om verlichting van Chlamydia inclusies mogelijk in levende, geïnfecteerde celkweken. Na infectie met Chlamydia, insluitsels gemakkelijk zichtbaar als zwarte vlekken in de gastheercellen (figuur 1). De helderheid van fluorescentie ontbrekende insluitsels kan worden benut voor het automatisch identificeren van insluitsels op talloze gezichtsvelden en / of behandelingen <...

Een methode op basis van fluorescente eiwitten in levende cellen voor het verlichten van cellulaire vacuolen (insluitsels) die Chlamydia bevatten, wordt beschreven. Deze strategie maakt een snelle, geautomatiseerde bepaling van Chlamydia-infectiviteit in monsters mogelijk en kan worden gebruikt om de groeidynamiek van insluitsels kwantitatief te onderzoeken.

Met behulp van fluorescerende eiwitten te visualiseren en te kwantificeren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole groeidynamiek in levende cellen

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren en kwantificeren van de groeidynamiek van chlamydiale inclusies in levende cellen. Dit wordt bereikt door eerst fluorescerende gastheercellen te genereren die stabiel een fluorescent eiwit, zoals GFP, in hun cytoplasma tot expressie brengen. Vervolgens worden de gastheercellen geïnfecteerd met chlamydia en geïncubeerd.Vervolgens worden de geïnfecteerde cellen gevisualiseerd met levende fluorescentiemicroscopie. Tot slot worden de kenmerken van de chlamydia-inclusies gekwantificeerd met microscopie-analysesoftware; uiteindelijk wordt levende fluorescentiemicroscopie gebruikt om chlamydiale inclusies binnen de gastheercel te visualiseren en om biologische parameters van de inclusies te meten voor kwantitatieve resultaten. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals antilichaamgebaseerde enumeratie, zijn dat deze reverse-imagingstrategie kan worden toegepast op levende cellen en in samenwerking met andere fluorescerende labels kan worden gebruikt om de dynamiek van inclusies van alle chlamydiale soorten te kwantificeren.Bovendien, in tegenstelling tot routinemethoden die bacteriën in cellen labelen, verlicht deze aanpak het inclusiemembraan in levende cellen en kan zo belangrijke dynamische eigenschappen van dit compartiment dat de pathogeen bevat, onthullen. Nadat fluorescerende HeLa-cellen zijn gegenereerd volgens het tekstprotocol, plaatst u GFP HeLa-cellen op een gewenst kweekvat, zoals glazen bodemschalen voor imaging met hoge resolutie of 24-wells platen voor IFU-bepaling en multi-well screening; ontdooi een bevroren buisje met Crich Cotus, of elke andere gewenste chlamydiale stam, op ijs en verdun in HBSS tot de gewenste multiplicity of infection. Om een statische infectie met Crich Cotus, LGV zero VL two uit te voeren, aspireert u het medium uit de wells en gebruikt u HBSS om de GFP HeLa-cellen te wassen.Voeg verdunde bacteriën toe aan de wells en incubeer deze gedurende twee uur bij 25 °C, aspireer de cellen en was met HBSS. Incubeer de cellen vervolgens na toevoeging van groeimedium bij 37 °C in een CO2-incubator om een centrifugatie-ondersteunde infectie uit te voeren met crich to serovar D of een andere chlamydiale stam. Gebruik HBSS om de GFP HeLa-cellen te wassen en voeg verdunde bacteriën toe aan de cellen.Plaats vervolgens de schaal met geïnfecteerde cellen in een houder voor multi-wellplaten van een swing-out rotor in een tafelcentrifuge. Centrifugeer de cellen bij 900 ×g en 25 °C gedurende één uur. Plaats de kweekvaten vervolgens in een CO2-incubator van 37 °C gedurende één uur in een veiligheidskast, aspireer de cellen, was deze twee keer met HBSS en voeg groeimedium toe.Incubeer de schaal met geïnfecteerde cellen bij 37 °C. Om chlamydia-inclusies te visualiseren, haalt u de met chlamydia geïnfecteerde GFP HeLa-cellen uit de koolstofdioxide-incubator en gebruikt u RPMI zonder fenolrood en 5% FBS om het medium te vervangen. Plaats de schaal of multi-wellplaat op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een olie-objectief van 20 x of hoger. Identificeer met behulp van beeldsoftware de met chlamydia geïnfecteerde GFP HeLa-cellen, die zichtbaar zijn als groene cellen met grote zwarte gaten.Configureer in het dialoogvenster voor de acquisitie-instellingen de software om het groene kanaal en elk ander kanaal dat aan het monster is toegevoegd te acquireren. Gebruik de knop voor vastlegging/opname om de beelden op de gewenste tijdstippen te acquireren. Na de infectie: haal de met chlamydia geïnfecteerde GFP HeLa-cellen uit de incubator en plaats de schaal op een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop.Focus op het middenvlak van de cellen, waar de inclusies hun maximale diameter en opbrengst hebben. Neem afbeeldingen met scherpe randen op in ten minste 10 velden per putje. Putjes vertegenwoordigen doorgaans replicates of experimentele variabelen.Om GFP HeLa-cellen onder het tabblad 'measurements' te vinden, gebruikt u het commando 'find objects' en selecteert u het groene kanaal. Pas de drempelintensiteit aan op basis van de relatieve intensiteiten van de cellen. Tel het aantal inclusies of zwarte compartimenten en GFP HeLa-cellen handmatig met het oog, of gebruik algoritmen van beeldbewerkingssoftware om inclusies automatisch te identificeren en te tellen.Filter de geselecteerde objecten door alleen die objecten te behouden die groter zijn dan vijf vierkante micrometer. Noem dit populatie één. Pas met gebruik van deze populatie het commando 'fill holes in objects' toe; deze stap genereert populatie twee.Trek populatie één af van populatie twee om positief gemarkeerde chlamydia-inclusies te verkrijgen, aangeduid als populatie drie. Gebruik het commando 'filter population' om een groottefilter op populatie drie toe te passen. Houd bijvoorbeeld objecten groter dan 25 µm² aan voor inclusies in cellen die 24 uur of langer zijn geïnfecteerd; stel bij vroege infectietijden het groottefilter zo in dat objecten groter dan 4 µm² worden behouden.Omdat deze inclusies veel kleiner zijn, resulteert het groottefilter in een populatie objecten die als inclusies zijn aangemerkt. Gebruik de beeldverwerkingssoftware om kwantitatieve gegevens uit de beelden te berekenen, zoals het aantal inclusies, de grootte van de inclusie en de omtrek van de inclusie na infectie met chlamydia. Inclusies zijn gemakkelijk zichtbaar als zwarte vlekken en de gastcellen of fluorescent eiwit-expresserende chlamydia binnen gastcellen, en hun duidelijkheid kan worden benut voor geautomatiseerde identificatie over talrijke gezichtsvelden en/of behandelingen.Zoals in deze grafiek wordt aangetoond, is een belangrijke toepassing de bepaling van chlamydia-inclusievormende eenheden in levende geïnfecteerde cellen, waardoor immunofluorescentieprocedures, die zowel tijdrovend als kostbaar zijn, overbodig worden. Een ander belangrijk kenmerk van deze beeldvormingsbenadering is dat deze eenvoudig kan worden toegepast op elke chlamydia-soort of stam. In dit voorbeeld is voor elk van deze soorten en stammen een tijdreeksanalyse uitgevoerd van GFP-HeLa-cellen die waren geïnfecteerd met een van vier chlamydiale soorten of stammen.Insluitsels werden gemarkeerd en geanalyseerd om hun gemiddelde oppervlakte, omtrek, lengte en aantal per cel op de aangegeven tijdstippen te berekenen. Deze eigenschappen verschaffen belangrijke informatie over de biologie van chlamydiale insluitsels, waaronder de wijze waarop zij interageren met de gastheercel. Hier wordt een video getoond van mCherry HeLa-cellen geïnfecteerd met GFP C. trachomatis L2, bestaande uit time-lapsebeelden die gedurende 125 minuten met intervallen van vijf minuten zijn genomen, beginnend op 48 uur na infectie.Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in hoe u deze reverse-imagingtechniek kunt gebruiken om Chlamydiale inclusies niet alleen te visualiseren, maar ook om inclusiedynamiek te kwantificeren, zoals de omtrek van het inclusieoppervlak en het aantal inclusies per cel. Deze techniek is kosteneffectief in vergelijking met meer traditionele visualisatietechnieken en werkt met alle chlamydiale soorten en stammen.

using-fluorescent-proteins-to-visualize-quantitate-chlamydia-vacuole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.

Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Source: Chetrit, D., et al. Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates the preparation and imaging of fluorescently labeled pathogenic bacteria. Agarose pads are first prepared and positioned within an adhesive frame. A suspension of genetically modified bacteria expressing a fluorescent protein is applied to the pad to immobilize the cells. The...

Sample Preparation and Imaging of Fluorescently Labeled Bacteria

We beschrijven beeldvormingsbenaderingen we gebruiken om de verdeling en mobiliteit van de getransfecteerde fluorescerende eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner via de confocale beeldvorming van levende cellen te onderzoeken. We hebben ook ultrastructureel analyseren het effect van hun expressie op de architectuur van deze subcellulaire compartiment.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Accurate kwantificering van vesiculaire transportgebeurtenissen levert vaak sleutelinzichten op in de rol van specifieke eiwitten en de effecten van mutaties. Dit artikel presenteert methoden voor het gebruik van superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige GFP-variant, als een hulpmiddel voor kwantificering van endocytische gebeurtenissen in levende cellen met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie.

Toepassingen van pHluorin voor Quantitative, Kinetic en High-throughput analyse van de Humor in gist

Inzicht in de functie van essentiële processen bij bacteriën is uitdagend. Fluorescentie microscopie met doelgroepen gerichte kleurstoffen kan belangrijke inzicht verwerven in de cel van de microbiële groei en celcyclus progressie. Hier, wordt Agrobacterium tumefaciens gebruikt als een model bacterie Markeer methoden voor levende cellen imaging voor karakterisering van essentiële processen.

Cel fluorescentie microscopie als waarnemer van essentiële processen tijdens microbiële celgroei bij te wonen

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding om de eiwit subcellulaire lokalisatie dynamiek te onderzoeken en morfologische veranderingen te monitoren met behulp van hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus.

Live-cel fluorescentiemicroscopie om Subcellulaire eiwit lokalisatie en celmorfologie veranderingen in bacteriën te onderzoeken

Vitale fluorescerende kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor Live-celbeeldvormings analyses in moderne schimmel celbiologie. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-/exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels.

Toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor het beeldvorming van filamenteuze schimmels in levende cellen

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende promotor-verslaggevers, live-cel microscopie, en individuele opname extractie in een gerichte voorwaartse genetische benadering te identificeren en isoleren van ontwikkelingsmutanten van Chlamydia trachomatis.

Live-Cell Forward Genetische Benadering voor identificeren en isoleren developmental mutanten in Chlamydia trachomatis

Leer fluorescerende microscopie om Chlamydia-inclusiegroei in levende cellen te visualiseren en kwantificeren. Deze methode biedt real-time inzicht in infectiedynamiek en werkt voor alle chlamydia-soorten.

Met behulp van fluorescerende eiwitten te visualiseren en te kwantificeren

Meer video's verkennen