Name: Gehumaniseerd muismodel om te studeren Bacteriële infecties Targeting microvasculature (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T15:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Leer hoe Neisseria meningitidis menselijke bloedvaten infecteert met een gehumaniseerd muismodel. Deze methode maakt observatie van klinische pathologie en vasculaire schade in vivo mogelijk voor infectieziektenonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag alle leden van de Dumenil lab, vooral Silke Silva bedanken voor het kritisch lezen van het manuscript. De operatie-afdeling van Hôpital Europeen Georges-Pompidou (HEGP), Dr David Maladry. Michael Hivelin en Dr Patrick Bruneval, afdeling Pathologie op HEGP. Het dier faciliteit op PARCC, onder leiding van Elizabeth Huc. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidie ​​agentschappen: Marie Curie IEF fellowship geen. 273223 (KM), ATIP-Avenir Grant van INSERM, CODDIM apparatuur subsidie ​​(regio Ile de France), FRM (Fondation pour la recherche medicale) apparatuur subsidie, de IBEID Laboratorium voor uitmuntendheid consortium, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) subsidie ​​&quot; Bugs-in-flow &quot;. De financiers hadden geen rol in onderzoeksopzet, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie, of voorbereiding van het manuscript.

1. Risico&#39;s en Machtigingen <ol><li> Plaatselijke ethische comites moeten alle dierlijke protocollen goedkeuren. Dit protocol werd uitgevoerd in overeenstemming met de door de Franse en Europese regelgeving voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (decrets 87-848, 2001-464, 2001-486 en 2001-131 en richtlijnen Europese Richtlijn 2010/63/UE) en door de lokale ethische commissie Comite d&#39;Ethique en matière d&#39;experimenteren Animale, Universite Paris Descartes, Parijs, Frankrijk goedgekeurd. No: CEEA34.GD.002.11. </li><li> Voor de menselijke huid, werd geschreven geïnformeerde toestemming van de patiënt verkregen en alle procedures werden uitgevoerd volgens de Franse nationale richtlijnen en door de lokale ethische commissie, Comite d&#39;Evaluation Ethique de l&#39;INSERM IRB 00003888 FWA 00005881, Parijs, Frankrijk Advies goedgekeurd: 11-048 . </li><li> N. meningitidis is een potentieel schadelijke menselijke ziekteverwekker en alle noodzakelijke voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij de behandeling van de organisme. De maatregelen houden in vaccinatie en werken onder Biosafety level 2 voorwaarden. </li></ol> 2. Skin Graft <ol><li> Verzamel menselijke huid dicht enten tijd mogelijk. De meerderheid van de huid in dit werk komt van plastische chirurgie operaties met betrekking tot de buikstreek. Andere bronnen, zoals borst-, been-en zelfs het gezicht zijn gebruikt met succes. </li><li> Bereid de menselijke huid monster door het reinigen huidoppervlak met 70% EtOH en liggen plat op een goed gereinigde oppervlak, bij voorkeur onder een zuurkast. </li><li> Snijd 200-400 urn segmenten van de bovenkant van de huid met een dermatoom met vooraf ingestelde dikte. </li><li> Controleer de huid plakken voor integriteit en snijd ze in 2 cm x 2 cm vierkantjes, dan plaats in PBS (zonder tweewaardige kationen) als onmiddellijk of bij 4 ° C in DMEM enten met 10% serum voor de korte-termijn opslag (3-12 uur ). </li><li> Verdoven 6-8 weken oude SCID.bg muizen (ongeveer 20 g) met ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) injeCTED ip </li><li> Zodra de muizen worden verdoofd, controleer pijnrespons door het uitvoeren van een teen knijpen, een standaard methode voor het vaststellen van pijn reflex. Breng gel ogen te drogen cornea voorkomen en scheren de linkerzijde van het dier achter de schouder, waarbij het implantaat wordt geplaatst. Houd de muis warm op een warmte-pad tijdens de gehele procedure. </li><li> Na prepping muis voor een operatie, reinig het geschoren gebied met 70% EtOH. </li><li> Breng plaatselijke verdoving topisch de entlocatie (Tronothane) en bereidt de entlocatie door zorgvuldig verwijderen van de oppervlakkige laag van de muis huid met een paar gebogen schaar. Wees voorzichtig de onderliggende vaatstelsel niet te verstoren. </li><li> Verwijder het vel in een gebied iets kleiner dan het gebied van de menselijke huid segment. </li><li> Verwijder slice huid tegen PBS (of DMEM) en plaats dan graft bed, het waarborgen van de epidermale kant naar boven. Stappen 2,8-2,10 moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd, zodat het transplantaat bed niet uitdroogt. </li><li> Lijn een hoekof de rand en met weefsel lijm fix. Steek voorzichtig de rest van de huid segment het transplantaatbed, plaatsen van kleine hoeveelheden weefsel lijm rond de randen. Trimmen altijd de menselijke huid op maat te maken in plaats van het transplantaat bed groter. </li><li> De huid niet trekken te strak over de graft bed als de muis huid is zeer flexibel. </li><li> Controleer het implantaat wordt bevestigd met weefsellijm in elke hoek. </li><li> Reinig het gebied met een jodium oplossing. </li><li> Breng een pleister met het kussen ruimte boven het transplantaat. Zorg ervoor dat de pleister is stevig maar niet strak en dat de ademhaling van het dier wordt niet beïnvloed. </li><li> Fix the Band-Aid met dressing tape. </li><li> Laat het dier te laten bekomen op een warme ondergrond. </li><li> Eenmaal wakker, terug het dier naar zijn kooi. Dieren worden gehuisvest 2-3 per kooi. </li><li> Controleer muizen regelmatig tijdens het herstel op tekenen van pijn of ongemak. 10-14 dagen na de transplantatie, verwijder de Band-Aid, zorg dat het transplantaat niet te verstoren. In onze ervaring postoperatieve pijn is minimal. Niettemin dieren moeten dagelijks worden gecontroleerd met name in de paar dagen na operatie. Criteria voor pijn of angst zijn de volgende. <ul><li> Verlies van het gewicht meer dan 10% </li><li> Fysieke verschijning, bont, gebochelde positie, ogen </li><li> Versnelde ademhaling of hartslag </li><li> Verminderde of abnormale bewegingen. </li><li> Stijging van de lichaamstemperatuur </li><li> Bij tekenen van pijn gedetecteerd paracetamole oraal toegediend (300 mg / kg elke 4 uur). Humane eindpunten strikt worden gerespecteerd als de pijn aanhoudt. </li></ul></li><li> Als het transplantaat droog uitziet babyolie toepassen om de 2-3 dagen om de huid soepel te houden. </li><li> De ent is klaar voor experimenten 21 dagen na de transplantatie. </li></ol> 3. Infectie <ol><li> De dag voor de infectie, bereiden bacteriestam door uitstrijken op GCB agar platen met de juiste antibiotica. Kweek gedurende de nacht bij 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Bacteria preparaat <ol&gt; <li> Opnieuw overgeënt bacteriën in 5 ml van Human endotheel SFM media met 10% serum tot een OD 600 0,05. </li><li> Incubeer onder schudden gedurende 2 uur in incubator (37 ° C in 5% CO2) met los deksel, totdat een bacteriële dichtheid van ongeveer 0,1 OD600. </li><li> Centrifugeer de bacteriën gedurende 3 min. 15.000 rpm. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer in PBS en centrifugeer weer. </li><li> Herhaal de wasstap (2.2.4-2.2.5) tweemaal. </li><li> Resuspendeer bacteriële pellet in PBS. </li><li> Meet OD 600. </li><li> Wordt de kweek van OD 600 0,1 (10 8 CFU / ml) of OD 600 1,0 (10 9 CFU / ml). Van deze bekende concentratie verdund tot 10 7 CFU / ml. Probeer om bacteriën zo dicht mogelijk bij de injectie tijd mogelijk voor te bereiden. </li></ol></li><li> Muizen <ol><li> Wegen muizen. </li><li> Verdoven muizen met ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) geïnjecteerd ip </li><li> Eenmaal in slaap, check dat de pijn respons afwezig is door een teen-snuifje, houden de muizen warm met een warmte-pad en zet oogzalf op om uitdroging te voorkomen. </li><li> Geef elke muis 8 mg humaan transferrine, opnieuw gesuspendeerd in zoutoplossing of PBS, geïnjecteerd ip </li><li> Neem een ​​kleine druppel bloed van de staart en verspreid op een agar plaat te controleren bloed steriel is voorafgaand aan de infectie. </li><li> Injecteer 100 pl 10 7 CFU / ml bacteriecultuur (10 6 CFU totaal) intraveneus via de retro-orbitale of staart ader. Metingen van CFU genomen 5 min na injectie consistent zijn, ongeacht de injectieplaats. </li><li> Na een paar minuten, knip de staart en verdeel bloedmonster op agar platen met de juiste antibiotica met een 10-voudige verdunning om bloed CFU vestigen onmiddellijk na infectie. </li><li> Dicht de staart met weefsel lijm. </li><li> Na injectie verdunnen bacterieel inoculum en uitgespreid op agarplaten met geschikte antibiotica CFU stellen. </li><li> Laat de muizenom te herstellen op een warmte-pad totdat ze en verhuizen </li><li> Om 6 uur na infectie trek een kleine hoeveelheid bloed uit de staart, verdunnen en plaat CFU vast te stellen op 6 uur. </li><li> Incubeer alle agarplaten bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende de nacht. </li></ol></li></ol> 4. Offer <ol><li> Op het gekozen tijdstip van infectie verdoven muizen met ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) geïnjecteerd ip </li><li> Eenmaal in slaap, houd de muisknop warm met een warmte-pad. </li><li> Wanneer de pijn reflex is gegaan (teen-snuifje), knip het einde van de staart en bloed te trekken. </li><li> Verspreid bloed op agar platen met de juiste antibiotica, 5 pl directe en 10 pi 1:10 verdunning tot CFU vestigen. </li><li> Offer de muis door cervicale dislocatie. </li><li> Na het opofferen van de muis volgens alle relevante institutionele en ethische richtlijnen, bevestigt dood door gebrek aan hartslag. Maak een middellijn incisie, snijd ribbenkast, en maak een insnijding in het horent. </li><li> Verzamel zoveel mogelijk bloed uit het hart / borstholte en in een steriele buis. </li><li> Verwijder organen (bijv. lever, milt, hersenen) in een steriele plaat. </li><li> Verwijder de huid transplantaat en een deel van de huid van muizen in de steriele plaat. </li><li> Gooi de muis lichaam. </li><li> Na het verzamelde bloed is stollen voor 15 min, centrifuge het 15 min bij 3000 rpm. </li><li> Verwijder plasma uit bloed en bewaar bij -80 ° C voor latere analyse, bijvoorbeeld voor cytokine detectie door ELISA of FACS gebaseerde methoden. </li></ol> 5. Orgel CFU Tellingen <ol><li> Weeg homogeniseren buizen met 500 pi PBS elk voorafgaand aan het nemen van biopten. </li><li> Neem 4 mm biopsie monsters van elk weefsel met behulp van een steriele biopsie punch. </li><li> Plaats biopten in vooraf gewogen homogeniseren buisjes die 500 ul PBS. Homogeniseren huid monsters met 2 mm kralen, gebruiken kleinere kralen voor andere organen. </li><li> Leg de resterende tkwesties in 4% paraformaldehyde (PFA) en bewaar bij 4 ° C voor microscopie (zie hieronder). </li><li> Weeg homogeniseren buisjes met de biopten te biopsie gewicht vast te stellen (voor latere berekening van de CFU / mg weefsel). </li><li> Homogeniseren monsters. <ol><li> Homogeniseer lever, milt en hersenen, bij 6.000 tpm gedurende 30 sec. </li><li> Homogeniseren huid monsters bij 6000 rpm gedurende 30 seconden en herhaal indien nodig. </li></ol></li><li> Spread verdunningen van elk homogeniseren slang op agarplaten en groei overnacht bij 37 ° C in 5% CO2 van organen CFU tellingen stellen. </li></ol> 6. Histologie / Immunohistochemistry <ol><li> Bevestiging <ol><li> Bevestig de weefsels in 4% PFA gedurende de nacht bij 4 ° C. De fixatiestap kan langer zijn, als opslag voor langere periodes plaats de weefsels in 0,25% PFA. </li><li> Spoel de weefsels in PBS en daarna in 20% sucrose oplossing en overnacht of totdat de weefsels verzonken in de oplossing weer 4 ° C. </li><li> Was de weefsels in PBS, op maat gesneden en plaats in oktober oplossing (hetzij in een weefsel schimmel of acht aan een bodemplaat). </li><li> Snel invriezen de weefsels op een petrischaal drijven in vloeibare stikstof. </li><li> Na het bevriezen, zet de weefsels op droog ijs vóór de overdracht tot -80 ° C voor opslag. </li></ol></li><li> Snijden <ol><li> Verwijder weefsel uit -80 ° C om de temperatuur tot -20 ° C in een cryostaat. </li><li> Plak weefsels met een dikte van ongeveer 10-15 urn en plaatsen op gecoate microscoopglaasjes. </li><li> WINKEL glijdt bij -20 ° C totdat het nodig is. </li></ol></li><li> Kleuring <ol><li> Laat dia&#39;s op kamertemperatuur te komen. </li><li> Trekken rond het schijfje op de dia met een hydrofobe pen. Wacht 5-10 minuten. </li><li> Rehydrateren / was slice in PBS gedurende 5 minuten, tweemaal herhalen. </li><li> Permeabilize segment in 0,1% Triton in PBS gedurende 10 minuten. </li><li> Was in PBS 2-3x gedurende 5 minuten. </li><li> Blok in PBS0.1% Triton 1% BSA gedurende tussen 10-60 minuten afhankelijk van het antilichaam of vlek te gebruiken. </li><li> Verwijder blokkerende buffer en voeg primair antilichaam verdund zoals vereist in blok buffer. Incubeer gedurende bepaalde tijd. (Vaak 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C). </li><li> Was in PBS 2-3x gedurende 5 minuten. </li><li> Solliciteer secundair antilichaam verdund in voorkomend geval in bock buffer; DAPI is meestal opgenomen in deze stap. Incubeer gedurende bepaalde tijd, vaak 1-2 uur kamertemperatuur in het donker. </li><li> Was in PBS 2-3x gedurende 5 minuten. </li><li> Mount in fade beschermen montage media met een dekglas en afdichting met nagellak. </li><li> Afbeelding gekleurde coupes onmiddellijk of bewaar bij 4 ° C. </li><li> Voer beeldvorming met een confocale of fluorescentie microscopie opgezet met filters / lasers passend fluoroforen gebruikt. </li></ol></li><li> Histologie <ol><li> Laat dia&#39;s worden gebruikt voor histologie op kamertemperatuur komen. </li><li> Vlek slides gebruiken alstandaard hematoxyline / eosinekleuring protocol. <ol><li> Plaats de dia&#39;s in een diavoorstelling rack. </li><li> Transfer rack met glijbanen tussen oplossingen in de volgende volgorde: </li><li> 2 sec in stromend water. </li><li> 3 min in gefilterd hematoxyline oplossing. </li><li> 10 sec in stromend water. </li><li> 10 sec in gedistilleerd water. </li><li> 10 sec in 100% ethanol. </li><li> 2 sec in gefilterd eosine. </li><li> 10 sec in stromend water. </li><li> 10 sec in 100% ethanol </li><li> 2 minuten in xyleen x 3 (bad I, II, III). </li><li> Onmiddellijk overdragen en voeg enkele druppels fixatie lijm op elke dia, plaats dekglas op de top, verwijder luchtbellen, laten drogen voor een paar uur. </li><li> Beeld schuift onder een standaard wit licht microscoop. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Davis, C. E., Arnold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+meningococcal+endotoxin+in+Meningococcal+purpura%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Role of meningococcal endotoxin in Meningococcal purpura.</a> J. Exp. Med. 140, 159-171 (1974).</li>
<li>Mairey, E., et al. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMairey%2C+E+%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. 203, 1939-1950 (2006).</li>
<li>Brandtzaeg, P., van Deuren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+and+pathogenesis+of+meningococcal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Classification and pathogenesis of meningococcal infections.</a> Methods Mol. Biol. 799, 21-35 (2012).</li>
<li>Guarner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+diagnosis+of+human+meningococcal+disease+using+immunohistochemical+and+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays.</a> Am. J. Clin. Pathol. 122, 754-764 (2004).</li>
<li>Hill, W. R., Kinney, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutaneous+lesions+in+acute+meningococcemia%3B+a+clinical+and+pathologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">The cutaneous lesions in acute meningococcemia; a clinical and pathologic study.</a> J. Am. Med. Assoc. 134, 513-518 (1947).</li>
<li>Capecchi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+NadA+is+a+new+invasin+which+promotes+bacterial+adhesion+to+and+penetration+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 55, 687-698 (2005).</li>
<li>Merz, A. J., Enns, C. A., So, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+pili+of+pathogenic+Neisseriae+elicit+cortical+plaque+formation+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IV pili of pathogenic Neisseriae elicit cortical plaque formation in epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 32, 1316-1332 (1999).</li>
<li>Morand, P. C., Tattevin, P., Eugene, E., Beretti, J. L., Nassif, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adhesive+property+of+the+type+IV+pilus-associated+component+PilC1+of+pathogenic+Neisseria+is+supported+by+the+conformational+structure+of+the+N-terminal+part+of+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The adhesive property of the type IV pilus-associated component PilC1 of pathogenic Neisseria is supported by the conformational structure of the N-terminal part of the molecule.</a> Mol. Microbiol. 40, 846-856 (2001).</li>
<li>Taha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+induces+the+expression+of+the+TNF-alpha+gene+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis induces the expression of the TNF-alpha gene in endothelial cells.</a> Cytokine. 12, 21-25 (2000).</li>
<li>Kirchner, M., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PilC+adhesin+of+the+Neisseria+type+IV+pilus-binding+specificities+and+new+insights+into+the+nature+of+the+host+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The PilC adhesin of the Neisseria type IV pilus-binding specificities and new insights into the nature of the host cell receptor.</a> Mol. Microbiol. 56, 945-957 (2005).</li>
<li>Mikaty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, (2009).</li>
<li>Johansson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD46+in+meningococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CD46 in meningococcal disease.</a> Science. 301, 373-375 (2003).</li>
<li>Kirchner, M., Heuer, D., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD46-independent+binding+of+Neisserial+type+IV+pili+and+the+major+pilus+adhesin%2C+PilC%2C+to+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">CD46-independent binding of Neisserial type IV pili and the major pilus adhesin, PilC, to human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 73, 3072-3082 (2005).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li>
<li>Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors+for+transferrin+in+pathogenic+bacteria+are+specific+for+the+host%27s+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Receptors for transferrin in pathogenic bacteria are specific for the host's protein.</a> Can. J. Microbiol. 36, 145-147 (1990).</li>
<li>Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+utilising+human+transferrin+to+study+protection+against+Neisseria+meningitidis+serogroup+B+induced+by+outer+membrane+vesicle+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26, 75-82 (1999).</li>
<li>Zarantonelli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+expressing+human+transferrin+as+a+model+for+meningococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection.</a> Infect. Immun. 75, 5609-5614 (2007).</li>
<li>Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Dumenil, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Neisseria+meningitidis+to+dermal+vessels+leads+to+local+vascular+damage+and+purpura+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Murray, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cell-mediated+destruction+of+allogeneic+dermal+microvessels+in+a+severe+combined+immunodeficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human T-cell-mediated destruction of allogeneic dermal microvessels in a severe combined immunodeficient mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9146-9150 (1994).</li>
<li>Nassif, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+of+pilin+regulates+adhesion+of+Neisseria+meningitidis+to+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation of pilin regulates adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 8, 719-725 (1993).</li>
<li>Geoffroy, M. C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+the+meningococcus+genome+by+gene+disruption%3A+resistance+to+complement-mediated+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis.</a> Genome Res. 13, 391-398 (2003).</li>
<li>Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHo%2C+M+%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. 192, 1205-1211 (2000).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Diermodellen zijn van cruciaal belang om bacteriële pathogenese onderzoek. Het is onmogelijk om de in vivo omgeving celkweek volledig nabootsen en het wordt duidelijk dat gastheer-pathogeen interactie wordt beïnvloed door veel dynamische factoren. De menselijke specificiteit van enkele klinisch belangrijke ziekteverwekkers, zoals N. meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes, en Salmonella typhi heeft beperkt het gebruik van in vivo modellen voor deze infecties. Aangezien we beginnen te begrijpen die infectueus stappen betrokken bij de specificiteit, gehumaniseerde modellen ontwikkeld. De hier beschreven protocol is een demonstratie van deze met de introductie van menselijke microvaten in muizen, waardoor uitgebreide in vivo infectie met N. meningitidis, waardoor vasculaire schade en soms de ontwikkeling van purpura huiduitslag. Met behulp van dit model,we kunnen definiëren die de kleefeigenschappen van Tfp betrokken bij vasculaire kolonisatie in vivo met bacteriemutanten en de vasculaire schade in afwezigheid van hechting 18 verminderd is. Eerder hebben circulerende bacteriële producten betrokken bij deze schade maar onze resultaten suggereren een beslissende rol voor lokale vasculaire adhesie en kolonisatie. Dit opent nieuwe mogelijkheden voor de ontwikkeling van nieuwe behandeling targets. Als adhesie van pathogene bacteriën farmaceutisch zou kunnen worden geblokkeerd het zou kunnen voorkomen dat de ontwikkeling van het huidletsel en leiden tot betere resultaten voor meningokokken overlevenden in termen van weefsel necrose, debridement en amputaties. Het werk heeft ook aangetoond dat de complexiteit van de infectie en de betrokkenheid van de immuunrespons en coagulatie cascade. Wij identificeerden menselijke cytokine signalering in het serum van geïnfecteerde muizen, ondanks de relatief kleine hoeveelheid humaan endotheel aanwezig 18.Dit bleek een belangrijke cytokine respons, samen met de infiltratie van immune muizen celpopulaties in het gebied. Diermodellen kan natuurlijk nooit volledig repliceren menselijke ziekte en alle resultaten oogstte van hen moet worden geacht met dit in gedachten. Bijvoorbeeld in dit model het bloed circulerende cellen van muizen oorsprong kunnen we niet gelaten omdat ze anders kunnen gedragen aan menselijke cellen. Een voordeel hiervan echter, zoals aangetoond in onze recente publicatie 18, is de mogelijkheid om signalering afkomstig onderscheiden van de humane endotheel van die van de circulerende muiscellen. De immunocompromised achtergrond van de muizen die in dit model zou het ook mogelijk voor de allogene overdracht van menselijke immuuncelpopulaties, het toevoegen van een verdere &#39;vermenselijking&#39; aspect. De achtergrond van de immuungecompromitteerde muizen kunnen echter masker een rol van NK, T of B-cellen, die alle ontbreken of defect in dit model. De relatief short tijdsbestek (24 uur) in dit model betreft voornamelijk de aangeboren respons, maar langere termijn infecties en de ontwikkeling van immuniteit andere opties moeten worden onderzocht. De huid is een belangrijke infectie site voor N. meningitidis maar met een relatief kleine hoeveelheid menselijke voertuigen betekent ook dat extrapolatie van de gegevens tot een systemische infectie met vele organen moeilijk. Hoewel dit model maakt voor de studie van dermale laesies ontwikkelen, zijn belangrijke stappen meningokokken infectie zoals epitheel en bloed-hersenbarrière niet overschrijden. Verdere ontwikkeling van deze gehumaniseerde modellen nodig die andere aspecten van de infectie te pakken. Toch Dit model biedt enorm potentieel voor talrijke menselijke specifieke pathogenen, met name gericht op de bloedvaten.

Meningokokkensepsis is een vaak fatale bloed geboren infectie veroorzaakt door de bacteriële pathogenen Neisseria meningitidis. Meningokokkensepsis patiënten vaak aanwezig met een petechiën of purpura uitslag op hun huid die eerder is geassocieerd met vasculaire vernietiging veroorzaakt door de verspreiding van bacteriën en bacteriële producten 1. Huid biopten van klinische patiënten vertonen bacteriën geassocieerd met microvaatjes, vaak vullen van de vaten 2. Naast de bacteriën uitgebreide trombose, coagulatie, congestie en vasculair lekken wordt gezien in de purpura gebieden 3-5. Deze vasculaire schade kan leiden tot uitgebreide necrose van de huid en de omringende weefsels, waardoor debridement en zelfs amputatie meningokokken overlevenden. Begrijpen hoe infectie veroorzaakt dit vasculaire schade belangrijk om preventie en behandeling te optimaliseren. Het merendeel van het onderzoek naar meningokokkensepsis is uitgevoerd in vitro ophumane cellijnen door de menselijke specificiteit van N. meningitidis. Veel aspecten van de infectie in vitro werd onderzocht waaronder bacteriële hechting gastheercel zelf en cytokine respons 6-9. Type IV pili (Tfp) zijn geïmpliceerd als de belangrijkste hechting organel voor N. meningitidis zowel epitheel-en endotheelcellen 10. Ook is aangetoond dat de aanhechting van N. meningitidis aan gastheercellen is schuifspanning afhankelijk en derhalve vermoedelijk samen met bloedstroomsnelheden in de microvasculatuur 11. Dit suggereert de dynamische spanningen van de bacteriën worden geconfronteerd in vivo zijn cruciaal voor de pathogenese. Het is echter moeilijk te voorspellen het micromilieu van kleine vaartuigen in vitro. De adhesie receptor voor Neisseria Tfp is nog onbekend en daarom knock-strategieën om bacteriële hechting in een diermodel bereiken momenteel niet denkbaar. CD46 werd voorgesteld als Tfp receptor en transgene dieren geproduceerd om als muismodellen. Echter, infectie bij deze dieren niet tot uitgebreide infectie of ontwikkeling 12,13 huiduitslag. Andere diermodellen die zijn beschreven voor de bacteremia aspect van Neisseria infectie rekening gehouden met de bacteriële voorkeur voor humaan transferrine als ijzerbron 14,15. Ofwel aanvulling humaan transferrine of expressie uit een transgen resulteert in een verhoogde hoeveelheid bacteriën in de bloedstroom gedurende een langere periode, maar dit model vertoont geen bacteriële hechting of uitslag ontwikkeling 16,17. In dit protocol beschrijven we een gehumaniseerd muismodel waarin de menselijke huid, zoals de huid microvasculatuur is getransplanteerd op immuungecompromitteerde muizen 18,19. Dit resulteert in functionele menselijke vaten, geperfuseerd met de muis circulatie. Gecombineerd met menselijke transferrine suppletie, dit mOdel een ten minste twee van de humaan specifieke aspecten van N. meningitidis, namelijk humane endotheel en humaan transferrine, in een in vivo omgeving. N. meningitidis intraveneus ingebracht in dit model specifiek hechten aan de menselijke endotheel, waardoor een pathologie die vergelijkbaar is met wat in klinische patiënten, omvattende vasculaire schade en purpura uitslag ontwikkeling 18.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>31885-023</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine 500</td><td>Virbac France</td><td></td><td>lot no. VAL4243</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Healthcare</td><td>AMM N° FR/8146715 2/1980</td><td>lot no. KPO809S</td></tr><tr><td>Optigel&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Europhta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lacrigel&nbsp;</td><td>Medicament Autorisé</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tronothane</td><td>Lisa Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC agar base</td><td>Conda</td><td>1106</td><td></td></tr><tr><td>Human endothelium SFM media</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>11111</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>P A A</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Human transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>UEA lectin - rhodamine</td><td>Vector Labs</td><td>RL-1062</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Sober Hand Dermatome</td><td>Humeca BV, Holland</td><td>4.SB01</td><td></td></tr><tr><td>Animal housing</td><td>Innovive</td><td>M-BTM-C8</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy punch (4 mm)</td><td>Dominic Dutscher</td><td>30737</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Prep lysing matrix M tubes</td><td>MP Bio</td><td>116923050</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer Green Beads</td><td>Roche</td><td>3358941001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer</td><td>Roche</td><td>3358976001</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD mounting media</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>Weefsel lijm</td></tr><tr><td>OCT tissue tek</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

gehumaniseerd muismodel om te studeren bacteriële infecties targeting microvasculature

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis veroorzaakt een ernstige, vaak fatale sepsis als het de menselijke bloedbaan komt. Infectie leidt tot grote schade aan de bloedvaten waardoor vasculair lekken, de ontwikkeling van purpura uitslag en eventuele weefselnecrose. Het bestuderen van de pathogenese van deze infectie is eerder beperkt door de menselijke specificiteit van de bacteriën, waardoor in vivo modellen moeilijk. In dit protocol beschrijven we een gehumaniseerd model voor infectie waarin de menselijke huid, bevattende dermale microvaatjes wordt geënt op immuungecompromitteerde muizen. Deze schepen anastomoseren met de muis circulatie met behoud van hun menselijke eigenschappen. Eenmaal geïntroduceerd in dit model, N. meningitidis zich uitsluitend aan de menselijke vaten resulteerde in uitgebreide vasculaire beschadiging, ontsteking en in sommige gevallen de ontwikkeling van purpura uitslag. Dit protocol beschrijft het enten, infectie en evaluatie stappen van dit model in de context van N. meningitidis infectie. De techniek kan worden toegepast op tal van humaan specifieke pathogenen die de bloedstroom infecteren.

CFU tellingen De N. meningitidis stam die in deze representatieve resultaten is N. meningitidis 8013 kloon 12, een serogroep C klinisch isolaat, het uitdrukken van een klasse I SB pilin, Opa -, Opc -, PilC1 + / PilC2 + 20. De stam was ontworpen om groen fluorescerend eiwit (GFP) uiten van een chromosomale insertie 18. Bacteriële kolonievormende eenheid tellingen worden vastgesteld door tellen van het aantal kolonies op agarplaten en het berekenen of CFU / ml bloed of CFU / mg weefsel van de bekende volumes uitgeplaat. Bloedceltellingen bleek dat 5 minuten na intraveneuze injectie van 10 6 CFU bacteriën was gemiddeld 1,5 x 10 5 CFU / ml in het bloed (Figuur 1A). Na 6 uur de tellingen gemiddeld 4,8 x 10 4 CFU / ml. Door 24 uur de gemiddelde tellingen waren 2,4 x 10 4 CFU / ml maar deze groep van 10 muizen, 5 hadgeen detecteerbare circulerende bacteriën terwijl de andere 5 een betrekkelijk hoge tellingen (Figuur 1A). CFU tellingen uit de huid monsters vertonen de meeste muizen hebben aanzienlijke tellingen in de menselijke huid, gemiddeld 2,1 x 10 4 CFU / mg weefsel bij 6 uur en 4,4 x 10 2 CFU / mg weefsel bij 24 uur (Figuur 1B) . De contralaterale muis huid monsters vertoonden geen kiemgetal bij 24 uur en slechts een zeer klein aantal om 6 uur, hetgeen de sterke voorkeur voor N. meningitidis de menselijke bloedvaten in de geënte huid (Figuur 1B). In het algemeen waren bacterietellingen zeer laag bij detecteerbare in de andere organen bemonsterde hoewel 2 dieren vertoonde wel tellingen die kunnen worden toegeschreven aan verontreiniging van het bloed, omdat ze gecorreleerd met grote circulerende hoeveelheid bacteriën (Figuur 1C). Het model kan ook worden gebruikt om de rol van virulentiefactoren in vivo te bepalen, bijvoorbeeld het type IV pili. Bacteriële stammen met gedefinieerde mutaties in het gen pilD 21, waardoor een stam ontbreekt Tfp, evenals de pilC1 gen 8, zonder de voorgestelde Tfp &quot;adhesine&quot; werden in het model. Deze mutaties resulteerden in geen bacteriële hechting in de menselijke huid transplantaat, bevestigt de cruciale rol Tfp speelt in de hechting in vivo (figuur 1D). Immunohistochemistry / Histologie In deze experimenten gebruikten we N. meningitidis stammen die groene fluorescentie eiwit (GFP) uiten naar fluorescerende detectie mogelijk te maken zonder de noodzaak van secundaire kleuring. Human schepen werden gekleurd met behulp van een marker voor menselijke endotheel, ofwel CD31 (PECAM-1) of de lectine Ulex europaeus agglutinine (UEA) 18,22. De UEA werd geconjugeerd aan rhodamine waardoor een stap kleuring (figuren 2A-C). Celkernen kunnen worden vleked met DAPI te helpen identificeren weefselstructuren (Figuren 2A-B). Histologie werd uitgevoerd met een standaard hematoxyline / eosine kleuring. De epidermale / dermale grens van de huid was duidelijk herkenbaar. Ontstekingen, trombose en vasculaire lek werden geconcentreerd aan schepen in de buurt van deze grens 24 uur na infectie (figuur 2D). Trombose is zichtbaar in verscheidene kleine dermale vaten, vaak gepaard met congestie en ontsteking. Lekkage van rode bloedcellen uit in de weefsels zou kunnen worden gezien, duidt op een uitgebreide omvang van de schade vaartuig. De histopathologie van geënte huid in niet-geïnfecteerde muizen bleek normale zonder onderscheiden ontsteking 18. In ongeveer 30% van de infecties bacteriële hechting aan de huid leidt tot de ontwikkeling van macroscopisch waarneembare purpura (figuren 2E en 2F). <img alt="Figuur 1" fo:content-width=<html> &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg&quot; /&gt; Figuur 1. CFU tellingen. (A) Bacteriële CFU tellingen per ml bloed op 5 min., 6 uur, en 24 uur na infectie. (B) Bacteriële CFU telt van huidsteekproeven vergelijken van de menselijke huid (GS) en de huid van muizen (MS) zowel na 6 uur en 24 uur na infectie. (C) Bacteriële CFU telt van andere organen genomen 24 uur na infectie. (D) Het vergelijken van bacteriële CFU tellingen van mens en muis huid monsters genomen bij 24 uur na infectie van muizen geïnfecteerd met het wild type N. meningitidis 2C43 vlek (WT), een stam met een mutatie in het gen pilD (pilD) of een stam met een mutatie in het gen pilC1 (pilC1). Alle grafieken worden weergegeven als ruwe gegevens mediaan. Cijfer is gewijzigd van Melican et al.. 18&quot;_blank&quot;&gt; Klik hier voor grotere afbeelding. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" /> Figuur 2. Microscopie. (A) Projectie van een confocale stapel toont een mens microvessel gekleurd met UEA lectine (rood) in de buurt van de huid (d) epidermale (e) grens. Het schip is geïnfecteerd met N. meningitidis (groen) 2 uur na infectie. (B) Een optisch schijfje en een plakje projectie (C) toont N. meningitidis microkolonies (groen) infectie een menselijk vat (UEA - rood) binnen een huidtransplantatie 2 uur na infectie. (D) hematoxyline / eosine kleuring van menselijke huid graft 24 uur geïnfecteerd met N. meningitidis. De epidermale (e), de huid (d) grens is duidelijk zichtbaar en uitgebreide trombose en congestie van microvessels (pijlen) wordt gezien in de dermis. Ontsteking en sommige vasculaire lek (pijlpunt) kan ook worden geïdentificeerd. (E) De menselijke huid transplantaat voorafgaand aan infectie. (F) Dezelfde huidtransplantatie als (E) 24 uur na infectie met N. meningitidis tonen purpura regio&#39;s (pijlen). figuren 2B, 2D, 2E en 2F zijn gewijzigd ten opzichte van Melican et al.. 18 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> .

Neisseria meningitidis is een humaan specifieke ziekteverwekker die de bloedvaten infecteert. In dit protocol menselijke bloedvaten in een muis worden geïntroduceerd door enten menselijke huid op immuungecompromitteerde muizen. Bacteriën zich uitgebreid naar menselijke vaten, waardoor vasculaire beschadiging en ontwikkeling van de purpura uitslag typisch waargenomen in menselijke gevallen.

Gehumaniseerd muismodel om te studeren Bacteriële infecties Targeting microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Het uiteindelijke doel van deze procedure is om de mechanismen te bestuderen waarmee de bacterie Neisseria meningitidis menselijke bloedvaten in vivo infecteert. Dit wordt bereikt door eerst menselijke huid te transplanteren op een immuundeficiënte muis, waardoor menselijke dermale bloedvaten worden geïntroduceerd. In de tweede stap worden de gehumaniseerde muizen geïnfecteerd met de bacterie.Vervolgens krijgt de infectie de tijd om gedurende een vooraf bepaalde periode voort te schrijden. In de laatste stap worden bloed- en weefselmonsters verzameld om het resultaat van de infectie te evalueren. Uiteindelijk wordt een combinatie van histologie, immunofluorescentie en bloed- en weefselanalyse gebruikt om de progressie van de infectie in de menselijke vaten te bestuderen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals celkulturmodellen of diermodellen, is dat we voor het eerst de typische klinische pathologie kunnen observeren die tijdens deze infecties optreedt. Reinig zo kort mogelijk na afname het menselijke huidoppervlak met 70% ethanol en leg het vervolgens plat op een schoon oppervlak, bij voorkeur onder een laminaire flowkast. Gebruik daarna een dermatoom met een vooraf ingestelde dikte om plakjes van 200 tot 400 micrometer van de bovenkant van de huid te snijden.Controleer de coupes op integriteit en trim deze vervolgens verder tot vierkanten van twee bij twee centimeter. Plaats de vierkanten in PBS en reinig vervolgens het geschoren gebied van een chirurgisch voorbereide, geanestheseerde, zes tot acht weken oude, severe combined immunodeficient beige muis met 70% ethanol. Breng na het aanbrengen van een plaatselijke verdoving op de graftplaats een gebogen schaar aan om voorzichtig de oppervlakkige laag van de muishuid te verwijderen over een gebied dat iets kleiner is dan de graftstukken, waarbij nauwkeurig wordt opgelet dat de onderliggende vasculatuur niet wordt verstoord.Plaats een van de menselijke huidplakjes snel over het transplantaatbed om uitdroging van het transplantaat te voorkomen, waarbij u erop let dat de epidermale zijde naar boven is gericht. Lijn de rand van het weefsel uit en fixeer dit met weefsellijm. Pas vervolgens de rest van de menselijke huid zorgvuldig aan op het transplantaatbed door kleine hoeveelheden weefsellijm rond elke rand aan te brengen.Trim altijd de menselijke huid op maat in plaats van het graftbed te vergroten. Nadat is bevestigd dat elke hoek is gefixeerd, dient het gebied te worden gereinigd met een jodiumoplossing en moet een pleister stevig, maar niet te strak, worden aangebracht met de zachte zijde over het transplantaat, waarbij erop gelet wordt dat de ademhaling van het dier niet wordt belemmerd; fixeer vervolgens de pleister met wondtape en laat het dier herstellen op een warm oppervlak. Zodra het dier is ontwaakt, dient het terug in de kooi te worden geplaatst totdat de bacteriële injectie de overnight plate-cultuur opnieuw in een vloeibare cultuur inoculeert.Op de ochtend van de infectie, wanneer de bacteriën de gewenste concentratie hebben bereikt, worden de cellen verdund tot 1 × 10⁷ colony forming units per milliliter. Bevestig vervolgens, na de anesthesie, de sedatie van de gegraftede muizen via de knijptest bij de teen en plaats de dieren op een warmteplaat.Breng oogzalf aan op de ogen van het dier en injecteer vervolgens i.p. Injecteer elke muis met acht milligram humaan transferrin in zoutoplossing. Snijd vervolgens voor elk dier de punt van de staart af en verspreid een kleine druppel bloed van de staart op een agarplaat om te bevestigen dat het bloed steriel is vóór de infectie.Inject vervolgens 100 µL van de bacteriële cultuur intraveneus via een retro-orbitale injectie. Knip na enkele minuten het uiteinde van de staart opnieuw af en strijk dit bloedmonster eveneens uit op verse agarplaten. Om de colony forming units in het bloed direct na de infectie vast te stellen, verzegelt u de staart met weefsellijm, waarna u het bacteriële inoculum verdunt en uitstrijkt op agarplaten met de juiste antibiotica.Om de colony forming units van het inoculum zes uur na infectie vast te stellen, wordt er opnieuw een kleine hoeveelheid bloed uit de staarten van de muizen afgenomen, waarna de bloeddruppels worden verdund en uitgeplaat zoals zojuist gedemonstreerd om de colony forming units na zes uur te bepalen. Incubeer vervolgens alle platen gedurende de nacht bij 37 °C in 5% CO2 om de colony forming units in de organen van de geïnfecteerde dieren te tellen.Begin met het maken van een midline-incisie bij elke geëuthanaseerde muis. Maak vervolgens voor elk dier een insnijding door de rib en in het hart. Gebruik een steriele spuit om zoveel mogelijk bloed uit het hart en de borstholte te onttrekken en verdeel dit over individuele steriele buisjes voor elk monster.Verwijder vervolgens de relevante organen en breng daarna de huidtransplantaten en de bijbehorende secties muishuid over op één steriele plaat per dier. Laat het verzamelde bloed 15 minuten stollen en centrifugeer het vervolgens. Verwijder daarna het plasma uit het bloed en bewaar dit bij minus 80 °C voor latere analyse.Weeg vervolgens homogenisatiebuisjes die elk 500 µL PBS bevatten. Gebruik daarna een steriele biopsietang om biopsie monsters van vier millimeter te nemen uit elk gedissecteerd weefsel. Plaats de biopsieën individueel in de homogenisatiebuisjes, waarbij in elk buisje met een huidmonster één kraal van twee millimeter wordt geplaatst.Bewaar de overgebleven weefsels in 4% paraformaldehyde bij vier graden Celsius voor microscopie, en weeg de homogenisatiebuisjes om het gewicht van het biopt vast te stellen. Homogeniseer vervolgens de monsters bij 6.000 RPM gedurende 30 seconden, en herhaal de homogenisatie van de huid totdat het homogenaat troebel is. Verdeel tenslotte de cel-slurry's uit elke buis over verse agarplaten en kweek de culturen gedurende de nacht bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide.Om de tellingen van organ colony forming units in deze representatieve resultaten vast te stellen, werd een GFP-positieve stam van N. meningitis serogroep C gebruikt.Bloedkellingen toonden aan dat er vijf minuten na IV-injectie van 1 x 10⁶ kolonievormende eenheden bacteriën gemiddeld 1,5 x 10⁵ kolonievormende eenheden per milliliter in het bloed circuleerden. Na zes uur bedroegen de tellingen gemiddeld 4,8 x 10⁴ kolonievormende eenheden per milliliter; na 24 uur bedroegen de gemiddelde tellingen 2,4 x 10⁴ kolonievormende eenheden per milliliter.Maar in deze groep van 10 muizen hadden vijf muizen geen detecteerbare circulerende bacteriën, terwijl de andere vijf relatief hoge aantallen hadden. De staven in deze grafieken tonen de mediaanwaarden van de CFU-aantallen afgenomen van de huid voor elke groep. De monsters laten zien dat de meerderheid van de muizen aanzienlijke aantallen in de menselijke huid had, gemiddeld 2,1 × 10⁴ CFU per milligram weefsel na zes uur, en 4,4 × 10² CFU per milligram weefsel na 24 uur.De contralaterale muishuidmonsters vertoonden geen bacteriële tellingen na 24 uur en slechts een zeer laag aantal na zes uur, wat de sterke voorkeur van end meningitis voor de menselijke vaten in het gegrafts weefsel aantoont. In het algemeen waren de bacteriële tellingen zeer laag tot niet detecteerbaar in de andere bemonsterde organen, hoewel twee dieren wel tellingen vertoonden, wat gecorreleerd kan zijn met hoge circulerende bacteriële aantallen. Dit model kan ook worden gebruikt om de rol van virulentiefactoren in vivo te bepalen.In dit experiment werden bijvoorbeeld bacteriële stammen gebruikt die geen functionele type vier pili I bezitten; muizen die met deze mutante stammen waren geïnfecteerd, vertoonden geen bacteriële adhesie in de menselijke huidtransplantaten, wat de cruciale rol bevestigt die type vier pili I speelt bij adhesie in vivo. In deze confocale beelden van een huidtransplantaat, twee uur na infectie, kunnen menselijke vaten worden waargenomen die zijn gekleurd met lectine UEA geconjugeerd aan rhodamine. De epidermale-dermale grens van de huid is duidelijk identificeerbaar en de infecterende GFP-positieve meningitis kan duidelijk worden waargenomen in de vaten.Dit met H&amp;E gekleurde menselijke huidtransplantaat vertoont ontsteking en vasculaire lekken, evenals trombose geconcentreerd in vaten nabij de epidermale-dermale grens. 24 uur na infectie leidde bacteriële adhesie in de huid bij ongeveer 30% van de infecties tot de ontwikkeling van macroscopisch detecteerbare purpura. De ontwikkeling van deze techniek baant zo de weg voor onderzoekers die zich bezighouden met onderzoek naar interacties tussen gastheer en pathogeen om de mechanismen van ziekten te bestuderen in de context van menselijke vaten.

humanized-mouse-model-to-study-bacterial-infections-targeting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier beschrijven we een methode om menselijk navelstrengbloed afgeleide endotheel kolonie-vormende cellen (ECFCs) en beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's), ingebed in een collageen / fibronectine gel, subcutaan in immunodeficiënte muizen. Te leveren Deze cel / gel combinatie genereert een humane vasculaire netwerk dat verbindt met de muis vaatstelsel.

Bioengineering Human Microvasculaire Netwerken in immunodeficiënte muizen

Source: Valentine, M. E., et al., Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the use of a bioluminescence-based imaging approach to monitor bacterial infection in a live mouse model. Sequential bioluminescent and X-ray imaging enables real-time visualization and anatomical localization of infection spread throughout the host.

Real-Time Imaging of Bacterial Infection in a Mouse Model Using Bioluminescence

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

This video demonstrates in vivo imaging to study the neutrophil recruitment dynamics at an infection site in an immunocompromised, transgenic mouse with GFP-expressing neutrophils. It involves injecting luminescent bacteria to cause an infection. This leads to neutrophil recruitment to the infection site, whose tracking is done by imaging.

Monitoring Neutrophil Recruitment Dynamics and Bacterial Burden at the Infection Site in a Murine Model

This video demonstrates a technique to generate a murine model of skin wound infection. Upon infecting mice — engineered to express a fluorescent protein in neutrophils — with a genetically modified bioluminescent Staphylococcus aureus — a pathogenic bacteria. The bacterial burden at the infection site and the neutrophil recruitment dynamics can be studied using whole animal imaging.

A Murine Skin Wound Infection Model to Study the Immune Response against a Bacterial Pathogen

Hier beschrijven we een experimentele techniek van fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire inflammatie en trombose in levende muizen. Deze microscopische techniek waardevol zal zijn voor het moleculaire mechanisme van vasculaire ziekte te bestuderen en farmacologische middelen testen onder pathofysiologische omstandigheden.

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

Diermodellen hebben bewezen waardevolle instrumenten definiëren gastheer en pathogeen specifieke mechanismen die bijdragen aan de ontwikkeling van chronische ontsteking. Hier beschrijven we een muismodel van orale infectie met het humaan pathogeen Porphyromonas gingivalis en detail methoden om de progressie van inflammatie lokale en systemische plaatsen.

Een muismodel voor pathogenen geïnduceerde Chronische ontsteking op lokale en systemische sites

Om de interactie van bacteriën met de bloedvaten onder afschuifspanning te bestuderen, worden een stromingskamer en een in vivo mesenteriale intravitale microscopiemodel beschreven die het mogelijk maken om de bacteriële en gastheerfactoren die bijdragen aan vasculaire adhesie te ontleden.

In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen

Terwijl in vitro studie van gastheer-pathogeen interacties de karakterisering van specifieke immuunresponsen mogelijk maakt, zijn in vivo modellen vereist om de effecten van complexe responsen te observeren. Door gebruik van Candida albicans blootstelling gevolgd door Pseudomonas aeruginosa-gemedieerde longinfectie, hebben we een muismodel gevestigd van microbiële interacties betrokken bij de pathogeniteit van ventilateur-geassocieerde pneumonie.

Bestuderen van microbiële gemeenschappen<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen<em&gt; Candida albicans</em&gt; En<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In het Airways

Een aanpak wordt beschreven voor real-time detectie van de ingeboren immune reactie op het verwonden van cutane en Staphylococcus aureus -infectie van muizen. Door vergelijking LysM-EGFP muizen (die bezitten fluorescerende neutrofielen) met een LysM-EGFP gekruist immunodeficiëntie muis stam, we vooraf ons begrip van de infectie en de ontwikkeling van benaderingen ter bestrijding van de infectie.

Een muismodel te beoordelen ingeboren immuunreactie op Staphylococcus aureus -infectie

Leer hoe Neisseria meningitidis menselijke bloedvaten infecteert met een gehumaniseerd muismodel. Deze methode maakt observatie van klinische pathologie en vasculaire schade in vivo mogelijk voor infectieziektenonderzoek.

Gehumaniseerd muismodel om te studeren Bacteriële infecties Targeting microvasculature

Meer video's verkennen