Gehumaniseerd muismodel om te studeren Bacteriële infecties Targeting microvasculature

Het algemene doel van deze procedure is om de mechanismen te bestuderen waarmee de bacteriën van meningitis de menselijke bloedvaten in vivo infecteren. Dit wordt bereikt door eerst menselijke huid op een immuungebrekkige muis te enten, waardoor menselijke dermale bloedvaten worden geïntroduceerd. In de tweede stap worden de gehumaniseerde muizen geïnfecteerd met de bacteriën.

De infectie wordt vervolgens gedurende een vooraf bepaalde tijdsperiode gedurende laten verlopen. In de laatste stap worden bloed- en weefselmonsters verkregen om de uitkomst van de infectie te evalueren. Uiteindelijk wordt een combinatie van histologie, immunofluorescentie en bloed- en weefselanalyse gebruikt om de progressie van de infectie in de menselijke bloedvaten te bestuderen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande technieken zoals celcultuurmodellen of diermodellen, is dat we voor het eerst de typische klinische pathologie kunnen observeren die plaatsvindt tijdens deze infecties. Zo snel mogelijk na het verzamelen, reinig de menselijke huidoppervlakte met 70% ethanol en leg deze vervolgens plat op een goed schoon oppervlak, bij voorkeur onder een stromende kap. Gebruik vervolgens een dermatoom met een vooraf ingestelde dikte om 200 tot 400 micrometer plakjes van de bovenkant van de huid te snijden.

Controleer de plakjes op integriteit en trim ze vervolgens verder tot vierkantjes van twee bij twee centimeter. Plaats de vierkantjes in PBS en reinig vervolgens het geschoren gebied van een chirurgisch voorbereide geanestheseerde zes tot acht weken oude, ernstig gecombineerde immuungebrekkige beige muis met 70% ethanol. Na het aanbrengen van lokaal verdovingsmiddel op de graftplaats, gebruikt u gebogen scharen om voorzichtig de oppervlakkige laag muishuid te verwijderen in een gebied dat iets kleiner is dan de graftstukken, zorg ervoor dat u de onderliggende vaatwand niet verstoort.

Beweeg snel om uitdroging van de graft te voorkomen, plaats een van de menselijke huidplakken over het graftbed, zorg ervoor dat de opperhuidzijde naar boven gericht is. Lijn de rand van het weefsel uit en fixeer het met weefsellijm. Pas vervolgens zorgvuldig de rest van de menselijke huid toe op het graftbed, plaats kleine hoeveelheden weefsellijm rond elke rand.

Trim altijd de menselijke huid op maat in plaats van het graftbed groter te maken. Nadat u hebt bevestigd dat elke hoek is vastgemaakt, maakt u het gebied schoon met een jodiumoplossing en brengt u een pleister stevig maar niet strak aan met de kussenszijde over de graft, zorg ervoor dat de ademhaling van het dier niet wordt beïnvloed, bevestig vervolgens de pleister met verbandtape en laat het dier herstellen op een warm oppervlak. Eenmaal wakker, brengt u het dier terug in zijn kooi totdat de bacteriële injectie een overnachts platencultuur opnieuw in vloeibare cultuur wordt geïnoculeerd.

Op de ochtend van de infectie, wanneer de bacteriën de gewenste concentratie bereiken, verdunt u de cellen tot één maal 10 tot de zevende kolonievormingseenheden per milliliter. Bevestig vervolgens na anesthesie de sedatie van de geënte muizen door op de teen te knijpen en plaats de dieren op een verwarmingskussen.

Breng oogzalf aan op de ogen van het dier en injecteer vervolgens elke muis met acht milligram humane transfer in zoutoplossing. Snijd vervolgens voor elk dier het uiteinde van de staart af en verdeel een kleine druppel bloed van de staart op een agarplaat om te bevestigen dat het bloed steriel is vóór infectie.

Injecteer vervolgens 100 microliter van de bacteriecultuur intraveneus via retroorbitale injectie. Snijd na een paar minuten het uiteinde van de staart opnieuw af en verdeel dit bloedmonster ook op verse agarplaten. Om de kolonievormingseenheden in het bloed onmiddellijk na infectie vast te stellen, verzegelt u de staart met weefsellijm en verdunt u het bacteriële inoculum en verdeelt u het op agarplaten met de juiste antibiotica.

Om de inoculumkolonievormingseenheden zes uur na infectie vast te stellen, neemt u nogmaals een kleine hoeveelheid bloed uit elke muisstaart en verdunt en plateert u de bloeddruppels zoals zojuist is gedemonstreerd om de kolonievormingseenheden op zes uur vast te stellen. Vervolgens incubeert u alle platen een nacht bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide om de kolonievormingseenheden in de organen van de geïnfecteerde dieren te tellen.

Begin door een middenlijnsnede te maken in elke geëuthaniseerde muis. Snijd vervolgens voor elk dier door de rib en maak een snede in het hart. Gebruik een steriele spuit om zoveel mogelijk bloed uit het hart en de borstholte te trekken en verdeel het in individuele steriele buisjes voor elke monster.

Vervolgens verwijdert u de organen van belang en brengt u de huidtransplantaten en bijbehorende secties van muishuid over naar één steriele plaat per dier. Laat het verzamelde bloed gedurende 15 minuten stollen en centrifugeer het vervolgens. Verwijder vervolgens het plasma uit het bloed en bewaar het bij minus 80 graden Celsius voor latere analyse.

Weeg vervolgens homogeniseringsbuisjes met elk 500 microliter PBS. Gebruik vervolgens een steriele biopsiepons om vier millimeter biopsiemonsters te nemen van elk gedissecteerd weefsel. Plaats de biopsies afzonderlijk in de homogeniseringsbuisjes met één twee millimeter kraal in elk buisje dat een huidmonster bevat.

Bewaar de resterende weefsels in 4% paraformaldehyde bij vier graden Celsius voor microscopie en weeg de homogeniseringsbuisjes om het biopsiegewich t te bepalen. Homogeniseer vervolgens de monsters bij 6.000 RPM gedurende 30 seconden, herhaal de huidhomogenisatie totdat het homogenaat troebel is. Verspreid vervolgens de celslurries uit elk buisje op verse agarplaten en laat de culturen een nacht bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide groeien.

Om de kolonievormingseenheden in de organen in deze representatieve resultaten vast te stellen. Er werd een GFP-positieve stam van N meningitis. Serogroep C gebruikt.

Bloedtellingen toonden aan dat vijf minuten na intraveneuze injectie van eenma