Name: Snelle en efficiënte zebravis Genotyping Met behulp van PCR met een hoge resolutie Melt Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Leer snelle genotypering van zebrafish met PCR en high-resolution melt analyse. Deze methode detecteert mutaties betrouwbaar en is sneller dan traditionele technieken zoals gelelektroforese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de leden van de Blaschke, Grunwald, en Wittwer labs voor advies en technische bijstand. Dit werk wordt ondersteund door de PCMC Foundation, NIH R01 MH092256 en DP2 MH100008, en de March of Dimes Foundation onderzoek subsidie ​​# 1-FY13-425, naar JLB.

1. DNA Voorbereiding <ol><li> Bereid DNA lysis buffer: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% Tween 20, 0,3% NP40. Voeg frisse Proteinase K tot een eindconcentratie van 1 mg / ml op de dag van gebruik 12. </li><li> Tissue collectie: <ol><li> Voor volwassen vis fin clip: <ol><li> Verdoven vis: Leg de vis in 0.004% MS-222 (tricaïne) oplossing. Wacht tot kieuw beweging vertraagt. </li><li> Leg vis op een stapel van 5-10 Kimwipes en snijd een klein stukje van de staartvin, ongeveer 2-3 mm, met een steriel scheermesje. </li><li> Plaats snel de vis in een gemerkte reservoir met vers water is voor invordering; zorgvuldig label zowel de tank en de bijbehorende buis die de vin clip zal bevatten. Ververs het water en om de andere dag de vissen voeren. </li><li> Pak de vin clip met een steriele pipet en breng het in een buis gevuld met 100 ul DNA lysebuffer. </li><li> Gooi de pipet tip, en het scheermesje weggooien in een naaldcontainer. </li></ol></li><li> Voor embryo staart clip: <ol><li> Plaats embryo&#39;s in 0.004% MS-222 (tricaïne) oplossing. Wacht 2 min. </li><li> Knip een stuk van de staart met een tang onder een dissectie microscoop. </li><li> Doe de staart in een gemerkte buis gevuld met 30 pi DNA lysebuffer. </li><li> Zet snel het embryo in een buis met 100 pi 4% paraformaldehyde. </li><li> Label buizen met embryo&#39;s en hun bijbehorende staart buizen. </li><li> Bewaar de flesjes met embryo bij 4 ° C overnacht voor bevestiging. </li><li> Reinig de tang met behulp van Milli-Q water en Kimwipes tussen elk embryo om besmetting te minimaliseren. </li></ol></li><li> Voor hele embryo&#39;s: <ol><li> Plaats embryo&#39;s in 0.004% MS-222 (tricaïne) oplossing. Wacht 2 min. </li><li> Zet 1-5 embryo&#39;s in een buis gevuld met 100 ul DNA lysisbuffer. Dechorionation is niet noodzakelijk. </li></ol></li></ol></li><li> DNA spijsvertering Incubeer buizen met weefsel (vin of staart clips of embryo&#39;s) bij 55 ° Cgedurende 4 uur tot overnacht 12. </li><li> Inactiveren de Proteinase K Warmte buizen 95 ° C gedurende 15 minuten 12. DNA worden gebruikt voor PCR direct of bewaard bij -20 ° C maximaal 3 maanden. </li></ol> 2. PCR <ol><li> Ontwerp Primers handmatig of primer design software (bijv. Lightscanner Primer Design Software-Biofire). PCR producten HRMA gewoonlijk 50-200 bp, PCR producten voor SNP detectie moet kleiner, kenmerkend 50-80 bp zijn. </li><li> PCR <ol><li> Voer PCR-reactie in een 96 putjes of 384 putjes. </li><li> Gebruik 10 pi totaal volume: 4 pi LightScanner master mix (0,1 U hot-start Taq-polymerase AB, buffer, 0,2 mM dNTPs, 2 mM magnesiumchloride en 1x TL dubbelstrengs-DNA-bindende kleurstof), 5 pmol van elke primer, en 1 pi genomische DNA template geëxtraheerd uit volwassen staartvin of 3 ul genomisch DNA uit embryonale staart 13. </li><li> Cover monsters met 30 ui minerale olie. </li&gt; <li> Bedek de plaat met een optisch-transparante lijm afdichting. </li><li> Optimaliseer PCR fietsomstandigheden typische condities 95 ° C gedurende 5 min en 30 cycli van 10 sec bij 95 ° C, 25 seconden bij 60 ° C, 30 seconden bij 72 ° C, eindigend met 95 ° C gedurende 30 seconden en afgekoeld tot 15 ° C. </li><li> Store PCR-platen bij 4 ° C of blijven, rechtstreeks dan HRMA. </li><li> Bevestigen onze PCR-product door analyse van de grootte met behulp van agarosegelelektroforese tijdens de eerste optimalisering van PCR en als aangegeven door sequentiebepaling van het PCR-product. </li></ol></li></ol> 3. HRMA <ol><li> Warmte platen <ol><li> Plaats plaat in een smelt analysesysteem. </li><li> Open de software (LightScanner Software Call-IT 2.0). </li><li> Warmte platen 60-95 ° C. </li><li> Maak een nieuwe data-opslag-bestand. </li></ol></li><li> Analyseer HRMA data (figuur 2). Meerdere stappen analyse mogelijk. We tonen de meest gebruikte set van gegevens manipulations. <ol><li> Deelverzameling instelling Klik op het tabblad subset. Selecteer de putjes monsters. </li><li> Normalisatie <ol><li> Selecteer het tabblad Normaliseren in het linkerpaneel. Fluorescentie variantie elimineren, handmatig de parallelle dubbele lijn in de pre-(initiële) positioneren en post (eind)-smelt regio&#39;s zoals afgebeeld (figuur 2C, pijlpunten) en normaliseren premelt en post-melt fluorescentie signalen van alle monsters op 1 en 0 respectievelijk 14. </li><li> Pas de positie van de lijnen, zodat de smelt regio in het gebied tussen de pre-en post-smelt lijnen, maar niet geselecteerd. In het algemeen, de Tweede Min en Lower Max (en Upper Min en Upper Max) temperatuur lijnen moeten worden geplaatst ongeveer 1 ° C uit elkaar. </li><li> Kies temperatuur posities voor normalisatie zodanig dat alle monsters maximale of volledige (100%) fluorescentie voor de premelt regio en minimale of geen (0%) fluorescentie voor de post-smelt regio (zo goed als mogelijklijk). Normalisatie moet resulteren in een bijna horizontale lijn op de maximale fluorescentie van 1 dat zich uitstrekt tot het smeltpunt en een bijna horizontale lijn van het smeltpunt bij de minimale fluorescentie van 0, er mag geen fluorescentie niveaus boven of onder 1 0 . Bijvoorbeeld, in figuur 2C, normaliseren voorsmelten krommen met temperaturen van 79-80 ° C. </li></ol></li><li> Groepering / Clustering Onderscheid genotypes op basis van hun smelttemperatuur (figuur 2C, groene doos). Selecteer Groepering. <ol><li> Selecteer Autogroup uit de lijst Standards selectie onder de sectie Groepering. </li><li> Selecteer Normaal of Hoog voor het smelten van profielen met een enkele overgangen of meerdere overgangen respectievelijk uit de lijst Gevoeligheid selectie onder de sectie Groepering. </li><li> Selecteer ComputeGroepen onder de sectie Groepering. </li><li> Ga naar het menu Bestand en klik op Opslaan om de resultaten op te slaan. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Sander, J. D., Cade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li>
<li>Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li>
<li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting+analysis+%28HRMA%29%3A+more+than+just+sequence+variant+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutation%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening.</a> Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).</li>
<li>Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), (2012).</li>
<li>Liew, M., Pryor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+of+single-nucleotide+polymorphisms+by+high-resolution+melting+of+small+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons.</a> Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%3A+cross-platform+comparison+of+instruments+and+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes.</a> Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).</li>
<li>Carrillo, J., Martínez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+analysis+for+the+identification+of+novel+mutations+in+DKC1+and+TERT+genes+in+patients+with+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cell.+Mol.+Dis.%22%5BJournal%5D)">High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita.</a> Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).</li>
<li>Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melt+analysis+%28HRMA%29%3B+a+viable+alternative+to+agarose+gel+electrophoresis+for+mouse+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping.</a> PloS one. 7 (9), (2012).</li>
<li>Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+hotspot+mutation+scanning+by+a+novel+and+highly+sensitive+high-resolution+small+amplicon+melting+analysis+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method.</a> J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
<li>Xing, L., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+foxP2+zinc+finger+nuclease+mutant+has+normal+axon+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding.</a> PloS one. 7 (8), (2012).</li>
<li>Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+High+Resolution+Melting+analysis+as+an+alternate+tool+to+screen+for+risk+alleles+associated+with+small+kidneys+in+Indian+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns.</a> BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Expanded+instrument+comparison+of+amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping.</a> Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).</li>
<li>Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Genotyping+by+Amplicon+Melting+Analysis+Using+LCGreen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen.</a> Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).</li>
<li>Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+closed-tube+methylation-sensitive+high+resolution+melting+assay+%28MS-HRMA%29+for+the+semi-quantitative+determination+of+CST6+promoter+methylation+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples.</a> BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).</li>
<li>Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+two+broad-range+PCR+assays+for+pathogen+detection+in+positive-blood-culture+bottles%3A+PCR-high-resolution+melting+analysis+versus+PCR-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry.</a> J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

PCR gecombineerd met HRMA is een krachtige technologie voor zebravis genotypering. De voordelen van deze benadering zijn snelheid, robuustheid en gevoeligheid voor zelfs puntmutaties te detecteren. De gehele protocol, van fin-clip te smelten-curve analyse kunnen worden in minder dan acht uur uitgevoerd door een enkel individu. Bovendien is de techniek vatbaar voor hoge-doorvoer screening, niet het gebruik van ethidium bromide vereist, en is afgesloten voor alle PCR en analysestappen die helpt minimaliseren verontreinigi...

Zebravis (Danio rerio) is een gewerveld dier modelsysteem op grote schaal gebruikt voor onderzoek naar ontwikkeling en ziekte modellering. Onlangs hebben talrijke transgene en mutatie technologieën ontwikkeld voor zebravis. Snelle transgenese technieken, meestal gebaseerd op een Tol2 transposon systeem 1, zijn gecombineerd met verbeterde klonen opties voor meerdere DNA-fragment assembly 2. Zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) zijn gebruikt om loci richten zowel somatische en kiemlijn cellen in zebravis 3,4. Deze technieken kunnen efficiënt genereren van genetisch gemodificeerde dieren, met een hoge frequentie mutatie creatie en kiem-lijn transmissie 3,4. Ondanks deze vooruitgang, traditionele genotypering technieken in zebravis beperken de volledige kracht van de mutagenese en transgenese gereedschappen. PCR gevolgd door gelelektroforese, soms gecombineerd met BEPERKINGEn enzymdigestie, wordt veel gebruikt om genoom modificatie detecteren, maar is tijdrovend en minder gevoelig voor kleine inserties of deleties identificeren. TaqMan probe assays hebben hoge initiële kosten en vereisen een zorgvuldige optimalisatie. Sequencing van PCR-producten kan enkele dagen duren en is niet praktisch voor grootschalige screening. Restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP) analyse kan alleen onderscheid SNP&#39;s die een beperkt aantal restrictie-enzym herkenningsplaatsen. Hoge-resolutie smeltpunt analyse (HRMA), een gesloten buis na PCR analysemethode, is een recent ontwikkelde methode die snelle, gevoelige, goedkoop en vatbaar voor het screenen van grote aantallen monsters. HRMA kan worden gebruikt om SNPs, mutaties en transgenen 5-7 detecteren. HRMA is gebaseerd op thermische denaturatie van dubbelstrengs DNA, en elke PCR-amplicon een unieke dissociatie (smelt) karakteristiek 5. Monsters kunnen worden gediscrimineerd te wijten to hun verschillende nucleotide samenstelling GC inhoud of diepte, typisch in combinatie met een fluorescente kleurstof die alleen bindt dubbelstrengs DNA 8. Aldus kan HRMA verschillende genotypen onderscheiden op basis van de verschillende smelt-curve karakteristieken. Omdat HRMA gebruikt goedkope reagentia en is een stap na PCR-proces kan worden gebruikt voor high-throughput strategieën. HRMA wordt destructief, dus na de analyse van de PCR amplicons worden gebruikt voor andere toepassingen. HRMA is toegepast in vele organismen en systemen, waaronder cellijnen, muizen en mensen 9-11. Het gebruik ervan is onlangs in de zebravis is beschreven dat mutaties veroorzaakt door zinc finger nucleases (ZFNs) Talens en 6,12,13 detecteren. In dit artikel beschrijven we hoe de PCR-gebaseerde HRMA voeren in embryonale en volwassen zebravissen (figuur 1). Dit protocol is geschikt voor het detecteren van SNPs, transgenen en mutaties, zoals single veranderingen baseparen, inserties of deleties.

<table><tbody><tr><td>100 Reaction LightScanner Master Mix</td><td>BioFire</td><td>HRLS-ASY-0002</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSP9665</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Microseal 'B' Adhesive Seals</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSB1001</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>96-well LightScanner Instrument</td><td>BioFire</td><td>LSCN-ASY-0040</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>LightScanner Software with Call-IT 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>High-resolution Melting Analysis 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>LightScanner Primer Design Software</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Vector NTI Software</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

snelle en efficiënte zebravis genotyping met behulp van pcr met een hoge resolutie melt analyse

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebravis is een krachtig gewerveld modelsysteem voor het bestuderen van de ontwikkeling, ziekte modelleren en uitvoeren drug screening. Onlangs zijn ingevoerd verschillende genetische hulpmiddelen, waaronder meerdere strategieën voor het induceren mutaties en transgene lijnen. Echter, grootschalige screening beperkt door genotypering traditionele methoden, die tijdrovend en arbeidsintensief zijn. Hier beschrijven we een techniek om zebravis genotypen door PCR in combinatie met hoge-resolutie smeltende analyse (HRMA) te analyseren. Deze aanpak is snel, gevoelig en goedkoop, met een lager risico van besmetting artefacten. Genotypering door PCR met HRMA kan worden voor embryo&#39;s en volwassen vis, met inbegrip van hoog-protocollen.

Het protocol kan gedurende een dag worden uitgevoerd of gescheiden stappen over meerdere dagen (stroomdiagram van werk wordt getoond in Figuur 1). DNA-extractie wordt gevolgd door de smelt en analyse van PCR amplicons. De temperatuur van de smelt van het amplicon afhankelijk van de grootte en de GC inhoud, maar algemeen beginnen en eindigen temperatuur van 50 ˚ C en 95 ˚ C geschikt (Figuren 2A en 2B). Zodra de smelt wordt uitgevoerd, analyse van de fluorescentie smelt c...

PCR in combinatie met hoge-resolutie smelt analyse (HRMA) wordt aangetoond als een snelle en efficiënte methode om zebravis genotype.

Snelle en efficiënte zebravis Genotyping Met behulp van PCR met een hoge resolutie Melt Analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Het algemene doel van deze procedure is het snel screenen op verschillende genotypen, mutaties of transgenen in zebravissen. Dit wordt bereikt door eerst DNA te extraheren uit kleine weefselbiopten en vervolgens het DNA te amplificeren via PCR. De volgende stap is het denatureren van de PCR-ampliconen terwijl de smeltcurven worden geregistreerd, welke vervolgens door software worden geanalyseerd.Uiteindelijk laten de resultaten onderscheidbare smeltcurves zien voor verschillende genotypen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals gel-elektroforese volume PCR, is dat deze gevoelig is voor enkelvoudige nucleotideveranderingen, kleine inserties en deleties, en dat deze techniek snel en betrouwbaar is. Hoewel deze techniek kan worden gebruikt om zebravissen snel en effectief te genotyperen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen en modelorganismen, waaronder cellijnen, muizen en andere dieren.Voeg op de dag van de DNA-preparatie verse proteinase K toe aan de lysisbuffer tot een concentratie van 1 mg/mL. Weefsel kan worden afgenomen van een volwassen vis met behulp van een dunne clip of van een embryonale vis. Anestheseer de vis eerst in een Trica-oplossing.Wacht tot de kieuwbewegingen vertragen. Plaats de vis vervolgens op een stapel tissues en snijd met een steriel scheermesje een klein stukje van de staartvin af van ongeveer twee tot drie millimeter lang. Plaats de vis snel in een gelabeld aquarium met vers water voor het herstel.Pak het vinniveau op met een steriele pipetpunt en breng het over in een buis gevuld met 100 µL DNA-lysisbuffer. Zorg ervoor dat zowel het aquarium van het dier als de buis worden gelabeld; incubeer alle verzamelde weefsels gedurende ten minste vier uur en maximaal een nacht bij 55 °C. Inactiveer het eiwit ACE K door de buizen 15 minuten lang te verhitten bij 95 °C.Deze monsters moeten onmiddellijk voor PCR worden gebruikt, maar kunnen ook tot drie maanden worden bewaard bij -20 °C. Voer de PCR uit in een plaat met 96 of 384 wells voor elke reactie. Combineer maximaal 1 µL van het volwassen DNA met 4 µL light scanner.Mastermix bevat de fluorescerende probe en primers in een uiteindelijke concentratie van vijf pM per stuk. Indien het DNA afkomstig was van een embryo, gebruik dan maximaal 3 µL. Bedek de reacties met 30 µL minerale olie en sluit ze vervolgens met een dop.Dek vervolgens de gevulde PCR-plaat af met een optisch transparante plakfolie. Optimaliseer nu de PCR-cycluscondities. Een typische set condities begint met vijf minuten smelttijd.Dit wordt gevolgd door 30 PCR-cycli met denaturaties van tien seconden, een annealingtijd van 25 seconden en 30 seconden elongatie. De reactie moet worden afgesloten met een extra 32ste denaturatie en vervolgens afkoelen tot 15 °C. Analyseer de PCR-plaat door deze in een smeltanalyse-systeem in de software te plaatsen.Stel de temperatuur in en maak een nieuw bestand voor gegevensopslag aan. Stel een subset in. Selecteer de wells met monsters aan de linkeronderzijde van het scherm.Selecteer het tabblad 'normalized' om fluorescente varianten te elimineren. Positioneer de parallelle dubbele lijn handmatig in de prem-, melt- en post-meltregio's en normaliseer de premelt- en post-meltfluorescentiesignalen van alle monsters respectievelijk naar één en nul. Maak vervolgens het onderscheid tussen de genotypen op basis van hun smelttemperatuur door eerst 'grouping' te selecteren.Select vervolgens auto group uit de standaardselectielijst. Selecteer onder het gedeelte grouping 'normal' of 'high' voor smeltprofielen met respectievelijk enkele transities of meerdere transities. Deze opties staan in de selectielijst voor sensitivity onder het gedeelte grouping.Select nu compute groups onder de sectie grouping, ga vervolgens naar het bestandmenu en klik op save om de resultaten op te slaan. Het protocol kan op één dag worden uitgevoerd of in stappen over meerdere dagen worden verdeeld. Bij het uitvoeren van PCR hangen de temperaturen voor het smelten van het amplicon af van de grootte en het GC-gehalte, maar over het algemeen zijn start- en eindtemperaturen van 60 °C en 95 °C passend zodra de smeltcurve is bepaald.De analyse van de fluorescente smeltcurves vereist doorgaans normalisatie van de variatie tussen de verschillende monstercurves, waarbij pre- en post-smeltregio's als standaarden worden gebruikt. Dit verbetert de vergelijking van resultaten van verschillende monsters waarbij de variatie in fluorescentie samenhangt met kleine experimentele variaties. Elk paar temperatuurlijnen voor normalisatie moet ongeveer één graad Celsius uit elkaar worden geplaatst.De gegevens kunnen op twee manieren worden weergegeven: door een grafiek die de smeltcurveprofielen toont, of door een grafiek met een subtractieve verschilplot in vergelijking met een referentie Monster; na HRMA-analyse kunnen mutaties of transgenen worden gedetecteerd. Twee verschillende mutaties in het EIF2B5-gen worden aangeduid door de rode en blauwe curven. Deze mutante monsters worden geïdentificeerd door hun significante verschil in de vorm van de smeltcurve, of de verandering in fluorescentie in vergelijking met de standaard wild-type curven.Dit voorbeeld van vier verschillende genotypen in één collectie embryo's illustreert de kracht en gevoeligheid van de methode. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in minder dan acht uur worden uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe HRMA moet worden uitgevoerd voor efficiënte grootschalige screening van zebravisgenotypen.

rapid-efficient-zebrafish-genotyping-using-pcr-with-high-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft DNA-extractie uit zebravisstaartclip. Het protocol demonstreert een snelle en efficiënte methode om zebravis genotypen te analyseren.

DNA-extractie uit staartclip: een methode die wordt gebruikt bij het genotyperen van zebravissen

In this video, we describe a high-resolution melting PCR technique to determine the length polymorphism of DNA fragments of varying sequence lengths, based on melting temperature analysis.

High-Resolution Melting PCR to Determine Sequence Variations in Mutant DNA Sequences

Terwijl hoge resolutie smeltende analyse biedt de mogelijkheid om te differentiëren tussen single nucleotide polymorfismen in een heterogene populatie, kunnen mutante allel amplificatie vertekening zijn vermogen allelen aanwezig betrekkelijk lage percentages in een monster te detecteren verhogen. Dit protocol beschrijft verbeteringen die de gevoeligheid van hoge resolutie smeltende analyse te verbeteren.

Methoden om de gevoeligheid van hoge resolutie Melting Single Nucleotide Polymorphism genotypering in Malaria Verhoog

Genotypering techniek beschreven voor koppeling fluorescent polymerasekettingreactie (PCR) met capillaire gelelektroforese, maakt genotypering van nuclease-gemedieerde knockout klonen. Het omzeilt beperkingen geconfronteerd met andere genotyperingstechnieken en kosteneffectiever is dan sequencing methoden.

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

Gerichte genoom bewerken in het modelsysteem Danio rerio (zebravis) is sterk bevorderd door de opkomst van de CRISPR gebaseerde benaderingen. Hierin beschrijven we een gestroomlijnde, robuust protocol voor generatie en van onzin CRISPR afkomstige allelen waarin de heteroduplex mobility assay en identificatie van mutaties met behulp van de volgende generatie sequencing.

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Zebravis onlangs gewend waren als een modelsysteem in vivo DNA replicatie timing tijdens ontwikkeling bestuderen. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van embryo's de zebravis profiel replicatie timing. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van replicatie timing mutanten, individuele celtypes, ziekte modellen en andere soorten.

Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo

Zebravis als betrouwbare genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek, vooral met de komst van gen-bewerken technologieën zijn gebruikt. Wanneer larvale fenotypen verwachting, kan DNA-extractie en genotype identificatie worden uitdagende. Hier beschrijven we een efficiënte genotypering procedure voor zebrafish larven, door de staart knippen, zo spoedig 72 uur na bevruchting.

High-throughput DNA-extractie en de genotypering van 3dpf Zebrafish larven door Fin knippen

Genbewerkingstechnologieën hebben onderzoekers in staat gesteld om zebravissen mutanten te genereren om de genfunctie relatief eenvoudig te onderzoeken. Hier bieden we een gids voor het uitvoeren van parallelle embryogenotypering en kwantificering van in situ hybridisatiesignalen bij zebravissen. Deze onbevooroordeelde aanpak zorgt voor een grotere nauwkeurigheid in fenotypische analyses op basis van in situ hybridisatie.

Genotyping en kwantificering van In Situ Hybridization Kleuring in Zebrafish

Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door weefsel ingezeten spierstamcellen, die bij veel spierziekten zoals spierdystrofie worden aangetast, en dit resulteert in het onvermogen van spieren om te regenereren. Hier beschrijven we een protocol dat het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte.

Het onderzoeken van Spierregeneratie in Zebrafish Modellen van Spierziekte

CRISPR-Cas-technologieën hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van genoombewerking. Het vinden en isoleren van de gewenste kiembaanbewerking blijft echter een groot knelpunt. Daarom beschrijft dit protocol een robuuste methode voor het snel screenen van F0 CRISPR-geïnjecteerd zebravissperma op kiembaanbewerkingen met behulp van standaard PCR-, restrictieverterings- en gelelektroforesetechnieken.

Screening van sperma op de snelle isolatie van kiembaanbewerkingen bij zebravissen

Hier presenteren we een protocol om eiwitten te labelen met een fluorescentie-eiwitlabel in zebravislarven, een nieuw ontwikkeld en aangepast in vivo systeem dat vooral nuttig is voor het visualiseren van eiwitten met een lage abundantie in zebravissen.

Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

Leer snelle genotypering van zebrafish met PCR en high-resolution melt analyse. Deze methode detecteert mutaties betrouwbaar en is sneller dan traditionele technieken zoals gelelektroforese.

Snelle en efficiënte zebravis Genotyping Met behulp van PCR met een hoge resolutie Melt Analyse

Meer video's verkennen