Snelle en efficiënte zebravis Genotyping Met behulp van PCR met een hoge resolutie Melt Analyse

Het algemene doel van deze procedure is om snel te screenen op verschillende genotypen, mutaties of transgenen in zebravissen. Dit wordt bereikt door eerst DNA te extraheren uit dunne clips en vervolgens het DNA te versterken door middel van PCR. De volgende stap is om de PCR Amplicons te denatureren terwijl de smeltcurven worden geregistreerd, die worden geanalyseerd door software.

Uiteindelijk laten de resultaten onderscheiden smeltcurven zien voor verschillende genotypen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals gelelektroforese volume PCR, is dat deze gevoelig is voor enkele nucleotide veranderingen, kleine inserties, alle deleties, en deze techniek is snel en betrouwbaar. Hoewel deze techniek kan worden gebruikt om snel en effectief zebravissen te genotyperen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen en modelorganismen, inclusief cellijnen, muizen en andere dieren.

Op de dag van de DNA-voorbereiding, voeg vers proteinase K toe aan de lysisbuffer met een concentratie van één milligram per milliliter. Weefsel kan worden verzameld van een volwassen vis met behulp van een dunne clip of van een embryonale vis. Anesthesiceer eerst de vis in Trica-oplossing.

Wacht tot de kieuwbwegingen langzaam worden. Leg de vis vervolgens op een stapel weefsels en snijd met een steriele scheermesje een klein stukje van de staartvin af van ongeveer twee tot drie millimeter lang. Plaats de vis snel in een gelabelde tank met vers water voor herstel.

Pak de vinclip op met een steriele pipettepunt en breng deze over in een buisje gevuld met 100 microliter DNA-lysisbuffer. Zorg ervoor dat zowel het dier als de buis gelabeld zijn, incubeer al het verzamelde weefsel gedurende minimaal vier uur en maximaal een nacht bij 55 graden Celsius na de incubatie. Deactiveer de proteïne ACE K door de buisjes gedurende 15 minuten te verwarmen tot 95 graden Celsius.

Deze monsters moeten onmiddellijk voor PCR worden gebruikt, maar kunnen ook worden bewaard bij min 20 graden Celsius gedurende maximaal drie maanden. Voer de PCR uit in een 96 of 384 well plate voor elke reactie. Combineer niet meer dan één microliter van het volwassen DNA met vier microliters van een lichte scanner.

Mastermix bevattende de fluorescerende sonde en primers bij een uiteindelijke concentratie van vijf pico molar elk. Als het DNA van een embryo was, gebruik dan maximaal drie microliters. Bedek de reacties met 30 microliters minerale olie en sluit ze vervolgens af.

Bedek vervolgens de geladen PCR plate met een optisch transparante zelfklevende afdichting. Optimaliseer nu de PCR-cyclusvoorwaarden. Een typische voorwaardenset begint met vijf minuten smelttijd.

Dit wordt gevolgd door 30 PCR-cycli met tien seconden smelten, 25 seconden knieltijd en 30 seconden verlenging. De reactie moet eindigen met een extra 32e smelt en vervolgens afkoelen tot 15 graden Celsius. Analyseer de PCR-plaat door deze in een smeltanalysesysteem in de software te plaatsen.

Stel de temperatuur in en maak een nieuw dataopslagbestand. Stel een subset in. Selecteer de putjes met monsters linksonder op het scherm.

Selecteer het genormaliseerde tabblad om fluorescente varianten te elimineren. Positioneer handmatig de parallelle dubbele lijn in de prem, smelt en post smelt-regio's en normaliseer de premel en post smelt fluorescente signalen van alle monsters naar één en nul respectievelijk. Onderscheid vervolgens de genotypen op basis van hun smelttemperatuur door eerst groepering te selecteren.

Selecteer vervolgens automatische groepering van de standaardselectielijst. Selecteer onder de groeperingssectie normaal of hoog voor smeltprofielen met enkele overgangen of meerdere overgangen respectievelijk. Ze staan in de selectielijst voor gevoeligheid onder de groeperingssectie.

Selecteer nu groepen berekenen onder de groeperingssectie en ga vervolgens naar het bestandsmenu en klik op opslaan om de resultaten op te slaan. Het protocol kan op één dag worden uitgevoerd of in stappen worden verdeeld over meerdere dagen. Bij het uitvoeren van PCR, zijn de temperaturen voor het smelten van de amplicon afhankelijk van de grootte en GC-gehalte, maar over het algemeen zijn start- en eindtemperaturen van 60 graden Celsius en 95 graden Celsius geschikt zodra het smelten is uitgevoerd.

Analyse van de fluorescerende smeltcurven vereist typisch normalisatie van de variatie van de verschillende monstercurven met behulp van pre en post smelt-regio's als standaarden. Dit verbetert de vergelijking van resultaten van verschillende monsters waarbij de variatie van fluorescentie gerelateerd is aan kleine experimentele variaties. Elk paar temperatuurlijnen voor normalisatie moet ongeveer één graad Celsius uit elkaar worden geplaatst.

De gegevens kunnen op twee manieren worden weergegeven door een grafiek die de smeltcurveprofielbestanden toont, of door een grafiek die een subtractief verschilplot toont in vergelijking met een referentiemonster. Na HRMA-analyse kunnen mutaties of transgenen worden gedetecteerd. Twee verschillende mutaties in het EIF twee B vijf-gen worden genoteerd door de rode en blauwe curven. Deze mutante monsters worden geïdentificeerd door hun significante verschil in hun smeltcurve, vormen of verandering in fluorescentie in vergelijking met de standaard wildtype-curven.

Dit voorbeeld van vier verschillende genotypen in een enkele verzameling embryo's illustreert de kracht en gevoeligheid van de methode. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in minder dan acht uur worden uitgevoerd. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe HRMA wordt uitgevoerd voor efficiënt grootschalig screening van zebravisgenotypen.