Name: Differentiële Labeling van Cell-oppervlak en Internalized Eiwitten na Antibody Voeden van Levende gekweekte neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Leer differentiële labeling van oppervlakte- en geïnternaliseerde eiwitten in levende gekweekte neuronen met antilichamen. Deze methode onderscheidt celmembraanproteïnen van geïnternaliseerde pools via immunofluorescentiemicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Teele Palumaa voor hulp bij de cijfers. Gefinancierd door Project Grant 1008046 van de National Health and Medical Research Council, Australië.

1. Gedissocieerde Hippocampale Neuron Cultuur <ol><li> Bereid dekglaasjes (borosilicaatglas): <ol><li> Was in 100% ethanol. </li><li> Droging onder UV-bestraling. </li><li> Coat met Poly-D-lysine (0,5 mg / ml in 0,15 M boraatbuffer, overnacht bij 4 ° C). </li><li> Op de volgende dag (dag van cultuur) Was 3x in PBS smeer met laminine (2,5 ug / ml, natuurlijke muis laminine) + 5% v / v warmte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS) verdund in PBS gedurende 2 uur bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Ontleden embryonale dag 18 (E18) hippocampus rat en verzamelen in PBS met calcium en magnesium, gekoeld op ijs. OPMERKING: alle experimentele protocols waarbij dieren werden goedgekeurd door de Dier Ethische Commissie van de Universiteit van Melbourne. </li><li> Bereid de papaïne en DNase I oplossingen van de papaïne Dissociatie Kit volgens de instructies van de fabrikant. <ol><li> Voeg 50 ul DNase I oplossing 1 ml papaïne oplossing. </li><li> OPMERKING: Zodraeerst bereid, kan de oplossing papaïne en DNase I oplossingen afzonderlijk afgegeven in porties (0,5 ml en 25 pi aliquots van papaïne en DNase I, respectievelijk) en bewaard bij -20 ° C totdat het nodig is. </li></ol></li><li> Verwijder zoveel mogelijk PBS en incubeer hippocampus (ve nest embryo) met 1 ml papaïne / DNase I oplossing bij 37 ° C gedurende 15-20 minuten. Tik zachtjes tegen de buis om de inhoud tijdens de incubatieperiode twee keer mengen. </li><li> Vermaal de hippocampus weefsel voorzichtig (vermijden van de belletjes) met een vlam-gepolijste gesiliconiseerde Pasteur pipet 10-15x tot cel dispersie wordt verkregen en weinig of geen stukjes gedissocieerde weefsel blijft. </li><li> Layer zorgvuldig de gedissocieerde celsuspensie over een 3 ml-kussen van 4% w / v bovine serum albumine (BSA) in Hanks Balanced Salt Solution plus additieven (HBSS +; zie paragraaf 1.6.1). <ol><li> Bereid deze stapgradiënt oplossing door het oplossen van de BSA bij kamertemperatuur zonder roerring in HBSS bevattende 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO 4, 4 mM NaHCO 3 en 40 mM glucose (HBSS +) vervolgens steriel filter en bewaar bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Centrifuge, 100 xg, 7 min in een bench top centrifuge met een swing-out rotor. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig de cel pellet niet te aspireren. </li><li> Resuspendeer de gepelleteerde cellen voorzichtig met een vlam gepolijst (gesiliconiseerd) Pasteur pipet (of 1 ml blauwe pipetpunt) in 1 ml compleet Neurobasal medium (met 2% B27, 0,5 mM L-glutamine aangevuld met 1% FCS). </li><li> Count twee 10 pl porties behulp van een hemocytometer (NB tellen alleen fase-heldere cellen als &#39;live&#39; cellen). </li><li> Plate primaire neuronen op preprepared gecoat glas dekglaasjes (0.75-1 x 10 5/18 mm dekglaasje in 12-well plaat). Onmiddellijk vóór plateren, zuigen overmaat laminine / serum oplossing van dekglaasjes en vervang primaire neuron kweekmedium (zie hieronder). NB De vereiste nantal dekglaasjes moet worden bepaald van tevoren als dekglaasje voorbereiding is begonnen de dag voorafgaand aan de cultuur (zie stap 1.1). </li><li> Cultuur primaire rat hippocampale neuronen E18 tot 21 dagen in vitro (DIV) in Neurobasal medium, 2% B27, 0,5 mM L-glutamine aangevuld met 1% FCS (hitte geïnactiveerd). Voer een half medium verandering op 7 DIV en daarna wekelijks. De anti-mitotische fluordeoxyuridine / uridine wordt toegevoegd 7 DIV, 1/1, 000 verdunning van 10 mM voorraad van elk nucleoside) naar gliale overgroei te voorkomen. </li></ol> 2. Antilichaam incubatie met Live Neuronen <ol><li> Tijdens de eerste week van cultuur, zijn neuronen ontwikkelen dendritische bosjes en in week 2-3, hebben neuronen voldoende gerijpt te ondergaan synaptogenese 6,7. <ol><li> Op geselecteerde experimentele tijdstip / s, gelden de primaire antilichaam aan putjes die primaire embryonale neuronen op dekglaasjes drievoud. Voeg een hoeveelheid van het antilichaam direct in het kweekmedium vande primaire neuronen de gewenste uiteindelijke verdunning Opmerking: In ons voorbeeld, een konijn polyklonaal antiserum opgewekt tegen een recombinant uitgescheiden vorm van het eiwit werd verdund 1/500 door 2 pi tot 1 ml kweekmedium goed, een centrifugatie gedurende 10 min , 13.000 xg, RT kan worden voorafgaand aan het nemen van een monster van antilichaam, zoals deze opgenomen worden alle deeltjes te verwijderen en kan helpen verminderen achtergrond. </li><li> Voor de pre-immune serum, voeg een equivalente hoeveelheid pre-immuun serum (naar dezelfde uiteindelijke verdunning). Indien geen pre-immuun serum beschikbaar is, voeg de gelijkwaardige hoeveelheid Neurobasal medium of PBS (geen primair antilichaam controle). Als alternatief, als een geschikte primaire antilichaam beschikbaar dat intracellulaire gebied / s van het eiwit herkent, dit antilichaam kan worden toegevoegd aan een putje om specificiteit van het oppervlak kleuring testen. </li><li> De terugkeer van de cellen naar de incubator voor 1-4 uur (dit incubatieperiode kan empirisch worden bepaald). In onze experimegen, het antilichaam was aanwezig voor de gehele periode, hoewel de proefopzet een puls van antilichaam, gevolgd door een verdere incubatie periode na wash-out (een pulse-chase experiment) konden nemen om het tijdsverloop van internalisatie beoordelen. Optionele stap: Deze incubatie kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur of op ijs uitgevoerd om de mate van basale eiwitten internalisatie vertragen indien nodig. Indien uitgevoerd in een niet-CO 2 gecontroleerde omgeving, moet het medium aangepast tot een die niet bicarbonaat gebufferd voor toevoeging van het antilichaam / antiserum. LET OP: Mature neuron culturen (&gt; 14 dagen, en in het bijzonder gekweekte muis embryonale neuronen) niet vol midden veranderingen goed verdragen. </li></ol></li><li> We hebben incubatietijden voor deze primaire antilichaam internalisatie stap van 1 uur, 2 uur en 4 uur met goede resultaten, hoewel de optimale tijd zal afhangen rijkdom van het eiwit van belang en de dynamiek van proteïne transport in de cells onder studie. OPMERKING: De tweekleurige de afbeeldingen in Representatieve resultaten werden verkregen met een incubatie van 1 uur bij 37 ° C in een weefselkweek incubator. </li><li> Na incubatie gedurende de gewenste periode, zuigen uit de antilichaam-bevattend medium. Was de putjes voorzichtig maar snel eenmaal met PBS bij kamertemperatuur. </li></ol> 3. Secundair antilichaam Toepassing op Vast, Unpermeabilized Cells <ol><li> Fix neuronen met 4% paraformaldehyde in fosfaatbuffer pH 7,2, 5 minuten bij kamertemperatuur Let op: voor de beste resultaten, gebruik vers bereid fixatief alternatief gebruiken oplossing die is opgeslagen bij -20 ° C en volledig ontdooid zodat er geen neergeslagen paraformaldehyde is evident . LET OP: Paraformaldehyde fixatief moet bereid en verwerkt worden in een zuurkast. </li><li> Verwijder fix uit putten (transfer naar afvalcontainer in zuurkast vloeistof) en spoel 3x met PBS. <ol><li> Optionele stap: Indien gewenst, om te besparen op antilichaam reagentia, de dekglaasjes kanwordt voorzichtig verwijderd uit de 12-wells plaat met een pincet en geplaatst cel-side-up, op een stuk Parafilm vastgesteld op basis van een wegwerp kweekplaat. </li><li> Oplossingen kunnen vervolgens voorzichtig gepipetteerd op de dekglaasjes zodat deze volledig bedekt zonder de oplossing overstroming over de rand van het dekglaasje op de Parafilm. </li><li> Deze techniek is geschikt voor korte termijn incubatie (1-2 uur) echter langer incubaties (bijv. &#39;s nachts) moet worden uitgevoerd in een vochtige kamer uitgevoerd. Alternatief kan de dekglaasjes terug in de putjes van de 12-well plaat voor incubatie overnacht en voldoende volume worden gebracht, moet worden toegevoegd dat de dekglaasjes niet uitdrogen. </li></ol></li><li> Blok voor 30 min bij kamertemperatuur met 5% BSA in PBS (NB: geen wasmiddel aan de blokkerende oplossing in dit stadium is het belangrijk dat de cellen niet permeabel). </li><li> Om oppervlakte-eiwit labelen voordat u verder gaat met detectietie van geïnternaliseerde eiwit, gelden de eerste fluorescent gelabelde 2 ° antilichaam naar keuze. Opmerking: In het hier beschreven voorbeeld, werd de primaire antiserum bij konijnen (in-house antilichaam) een recombinant uitgescheiden isovorm 4. Aldus kan de eerste secundaire antilichaam aan het extracellulaire gebied van het transmembraan isovorm detecteren op het oppervlak van unpermeabilized neuronen, gebruikten we ezel anti-konijn DyLight 649 (1/200 verdund in PBS met 5% BSA). Het wordt aanbevolen om verdunde secundaire antilichaam oplossing (10 min., 13.000 xg, RT) voor gebruik centrifuge. </li><li> Incubeer de dekglaasjes gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Was dekglaasjes (in putjes), 2x 5 min. met PBS. </li></ol> 4. Blokkeren met Excess Ongelabeld 2 ° Antibody <ol><li> Blokkeer de unpermeabilized neuronen met een hoge concentratie (&gt; 0,1 mg / ml) niet-gemerkt antilichaam 2 °. <ol><li> De ongelabelde 2 ° antilichaam moet tegen de soort worden verhoogd in diehet primaire antilichaam werd opgewekt (in dit geval konijn) door incubatie overnacht bij kamertemperatuur. </li><li> Voor dit protocol AffiniPure Fab fragment geit anti-konijn IgG (H + L) werd gebruikt bij een concentratie van 0,13 mg / ml. OPMERKING: De incubatie overnacht bleek cruciaal als een kortere incubatietijd (2 uur) te zijn was onvoldoende voor volledige afscherming van primaire antistof die niet volledig gebonden was door de gelabelde secundaire antilichaam. </li></ol></li><li> Was dekglaasjes (in putjes), 2x 5 min. met PBS. </li><li> Na deze stap blokkeren, post-fix de cellen met 4% paraformaldehyde in fosfaatbuffer pH 7,2, 5 min bij kamertemperatuur geroerd. Spoelen met PBS (2x) na verwijdering van fixatief (transfer fixatief om afvalcontainer in zuurkast vloeistof). </li></ol> 5. Permeabilisatie en toepassing van de tweede fluorescent geconjugeerd 2 ° Antibody <ol><li> Doorlaatbaar en blokkeren de cellen met 5% BSA in PBS dat 0,1% Triton-X-100 bij kamertemperatuur temperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Verwijder de blokkering oplossing (zorg dat de dekglaasjes niet uitdrogen). Voeg de tweede fluorescent-geconjugeerde 2 ° antilichaam gelabeld met een andere fluorofoor. <ol><li> Opmerking: Het moet mogelijk zijn om deze fluorofoor label onderscheiden van de eerder gebruikte, afhankelijk van de beschikbare excitatie / emissie filters aan de confocale microscoop (zie hieronder). </li><li> Voor het voorbeeld in dit protocol, is een Alexa Fluor 488-geconjugeerd ezel anti-konijn 2 ° gebruikte antilichaam (1/200 in PBS, 5% BSA en 0,1% Triton-X-100). Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens de 2 ° antilichaam oplossing. </li></ol></li><li> Wash dekglaasjes 3x 5 minuten met PBS en tenslotte wassen met gedeïoniseerd water kort. </li></ol> 6. Montage en Imaging <ol><li> Mount coverslips op glasplaatjes met een waterig montage medium dat antifade (bijv. Vectashield) en laten drogen. Bewaren in het donker bij 4 ° C opTimal behoud van fluorescent signaal intensiteit. </li><li> Afbeelding immunologisch cellen op een confocale microscoop. <ol><li> Passende excitatie en emissie filters voor de detectie van de twee fluorofoor signalen beschikbaar zijn. </li><li> Als er verschillende experimentele condities moeten worden vergeleken (bijvoorbeeld internalisatie tarieven onder gedepolariseerd 8,9 of controle-omstandigheden), ervoor zorgen dat alle repliceren dekglaasjes van de verschillende voorwaarden wordt afgebeeld met het zelfde beeld acquisitie parameters. De geïntegreerde dichtheid van standaard regio&#39;s van belang of de puncta attributen (bijvoorbeeld het aantal, de grootte) van de resulterende beelden kunnen vervolgens worden gemeten met behulp van standaard software voor beeldanalyse (bijv. Fiji / ImageJ, Metamorph). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lewis, T. L. Jr, Mao, T., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+myosin+VI+in+the+localization+of+axonal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for myosin VI in the localization of axonal proteins.</a> PLoS Biol. 9, (2010).</li>
<li>von Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li>
<li>Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+gene+expression+patterns+in+developing+mouse+neocortex+using+serial+analysis+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression.</a> Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).</li>
<li>Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sez-6+proteins+affect+dendritic+arborization+patterns+and+excitability+of+cortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons.</a> Neuron. 56, 621-639 (2007).</li>
<li>Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin-4+Defines+a+Domain+for+Activity-Dependent+Exocytosis+in+Dendritic+Spines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines.</a> Cell. 141, 524-535 (2010).</li>
<li>Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-to-neuron+ratio+is+inversely+related+to+neuronal+density+in+mature+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures.</a> Brain Res. 1359, 44-55 (2010).</li>
<li>Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+in+primary+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture.</a> Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).</li>
<li>Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+underlying+reversible%2C+activity-dependent+dendrite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation.</a> Neuron. 34, 985-998 (2002).</li>
<li>Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+endosomes+supply+AMPA+receptors+for+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP.</a> Science. 305, 1972-1975 (2004).</li>
<li>Kennedy, M. J. &, Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelles+and+trafficking+machinery+for+postsynaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).</li>
<li>Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+early+endosomes+require+EHD1+for+L1%2FNgCAM+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking.</a> J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).</li>
<li>Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArancibia-C%C3%A1rcamo%2C+IL+%22The+Dynamic+Synapse%3A+Molecular+Methods+in+Ionotropic+Receptor+Biology%22">The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology</a>. Kittler, J. T., Moss, S. J. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).</li>
<li>Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+trafficking+and+recycling+maintain+a+pool+of+mobile+surface+AMPA+receptors+required+for+synaptic+potentiation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation).</a> Neuron. 63, 92-105 (2009).</li>
<li>Reider, A., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+adaptors+%E2%80%93+social+networking+at+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane.</a> J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De hier beschreven techniek complementair is aan die van celoppervlak biotinylering (beoordeeld door Arancibia-Cárcamo et al..) 12 en is de voorkeursmethode voor het bewaren van gegevens over de subcellulaire lokalisatie van de geïnternaliseerde proteïne, mits een geschikt primair antilichaam aan een extracellulaire epitoop beschikbaar. Bovendien kan kwantificering van proteïne transport / internalisatie tijd worden uitgevoerd (door het vaststellen dekglaasjes gedurende verschillende levende cel incu...

Bij het ​​vaststellen van de functie van nieuw geïdentificeerde eiwitten, kan onderzoek naar de subcellulaire lokalisatie van en handel van het eiwit in kwestie belangrijke aanwijzingen over de mogelijke rol / s van het eiwit 1,2 bieden. Bioinformatica analyse van de transcriptome van de zich ontwikkelende neocortex 3 gaf ons een lijst van genen veranderde expressie vertonen in de hersenen van muizen corticogenesis. Vervolgens heeft een knockout benadering vast te stellen dat het eiwit gecodeerd door een van deze genen, sez6, heeft een belangrijke rol in neuron ontwikkeling. We zagen dat de beslaglegging gerelateerde gen 6 of Sez6, eiwit in de ontwikkeling dendrieten en is ook aanwezig in dendritische gespecialiseerde structuren dendrieten ontvangt en integreert prikkelende signalen. Bovendien, wanneer dit eiwit ontbreekt, dendrieten en exciterende synapsen niet goed 4 vormen. De waarschijnlijke overheersende isovorm van het eiwit kenmerken van een transmembrane receptor hoewel, wanneer de subcellulaire verdeling van immunologisch eiwit werd onderzocht door confocale microscopie of immuno-elektronenmicroscopie meeste, zo niet alle, van het signaal bleek geassocieerd met kleine blaasjes in het somatodendritische compartiment met weinig of geen eiwit, dat op de plasmamembraan aan het celoppervlak. Om definitief te tonen dat dit vermeende receptor met een voorspeld extracellulair domein groot is verhandeld naar de plasmamembraan, we levende cellen benadering vastgesteld middels het antiserum we hadden gegenereerd aan een extracellulaire deel van het eiwit aan eiwit label op het celoppervlak. Door deze &quot;antilichaam feeding&quot; benadering twee toepassingen van differentieel-gelabelde secundaire antilichaam gescheiden door een uitgebreide blokkering stap en permeabilisatie stap konden we twee verschillende pools van eiwit onderscheidt identificeren door binding aan fluorescent gelabelde secundaire antilichamen onderdelen verschillende tlent tags. Zo konden wij eiwit dat werd geïnternaliseerd door endocytose in het antilichaam incubatiestap uit eiwitten die zijn gebleven op het celoppervlak of werd verhandeld aan het oppervlak tijdens deze periode onderscheiden. Met deze methode, hebben we vastgesteld dat het eiwit van belang wordt verhandeld en naar het celoppervlak in neuronen. Daarom deze relatief snelle en eenvoudige techniek bleek informatiever dan traditionele methoden immunocytochemie of pre-embedding immunogoud elektronenmicroscopie, hoewel we gebruikten dezelfde konijnen polyklonaal antiserum voor al deze technieken. Deze techniek is algemeen toepasbaar op elke transmembraan eiwit bood een goede antilichaam dat extracellulair domein epitopen beschikbaar. De techniek is al eerder gebruikt om receptor handel van de glutamaat receptor subeenheid GluR1 5 bestuderen.

<table><tbody><tr><td>PBS with Ca and Mg</td><td>Invitrogen</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>PDS</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Natural mouse laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>Ontdooi op ijs voor het maken van aliquots</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum HyClone</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorodeoxyuridine</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Round glass coverslips</td><td>Menzel Gläser</td><td>CB00180RA1</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD aqueous mounting medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1400</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit Dylight 649&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-495-152</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-007-003</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>P6148</td><td>TOXIC - hanteer in afzuigkap</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma Aldrich Australia</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2&deg; antibody</td><td>Invitrogen - Molecular Probes</td><td>A21206</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiële labeling van cell-oppervlak en internalized eiwitten na antibody voeden van levende gekweekte neuronen

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Om het celoppervlak lokalisatie van een vermoedelijke transmembraan receptor in gekweekte neuronen demonstreren we de gemerkte eiwit op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek primair antilichaam opgewekt tegen een extracellulair gedeelte van het eiwit. Aangezien receptoren worden verhandeld en naar de oppervlakte, wanneer cellen permeabel na fixatie dan zowel celoppervlak en interne eiwit wordt gedetecteerd door dezelfde gelabelde secundaire antilichaam. Hier passen wij een methode om eiwittransport (&quot;antilichaam feeding&quot;) bestuderen labelen eiwit dat werd geïnternaliseerd door endocytose in de antilichaam incubatiestap en eiwitten die zijn gebleven op het celoppervlak of werd verhandeld aan het oppervlak tijdens deze periode differentieel . De mogelijkheid om deze twee zwembaden van eiwit te onderscheiden werd mogelijk gemaakt door de integratie van een overnachting blokkering stap met sterk geconcentreerde ongelabelde secundair antilichaam na een eerste broen van unpermeabilized neuronen met een fluorescent gelabelde secundaire antilichaam. Na de blokkeringsstap, permeabilisatie van de neuronen toegestane detectie van de geïnternaliseerde zwembad met een fluorescent gelabeld secundair antilichaam met een andere fluorofoor. Met deze techniek konden we belangrijke informaties subcellulaire locatie van dit vermeende receptor verkrijgen, onthullen dat het inderdaad verhandeld het celoppervlak in neuronen. Deze techniek is breed toepasbaar op verschillende celtypes en cel-oppervlakte-eiwitten, die een passend antilichaam aan een extracellulair epitoop beschikbaar.

De dual-color fluorescent immunokleuring techniek hier gepresenteerde bruikbaar voor het labelen van extracellulaire domeinen van transmembraan eiwitten in levende cellen (schematisch getoond in Figuur 1). Gedurende de incubatieperiode, de immunoglobulinen binden toegankelijke epitopen en een deel van de populatie van eiwitmoleculen met gebonden antilichaam wordt endocytose. Bovendien kunnen nieuw gesynthetiseerde eiwit het celoppervlak bereiken via voren handel en gerecycleerd eiwitmoleculen kunnen wor...

We beschrijven een methode om eiwit label op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek polyklonaal antilichaam tegen extracellulaire epitopen. Eiwit door het antilichaam gebonden op het celoppervlak en vervolgens geïnternaliseerd via endocytose kunnen worden onderscheiden van eiwitten nog op of verhandeld bij het oppervlak tijdens de incubatie.

Differentiële Labeling van Cell-oppervlak en Internalized Eiwitten na Antibody Voeden van Levende gekweekte neuronen

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Het algemene doel van deze procedure is het labelen van eiwitten op het oppervlak van levende neuronen en het vervolgens onderscheiden van oppervlakte-eiwitten ten opzichte van geïnternaliseerde eiwitten middels differentiële labeling met secundaire antilichamen. Hiervoor worden primaire neuronen, gekweekt op dekglas, geïncubeerd met een antilichaam gericht tegen een oppervlakte-epitoop en vervolgens geïncubeerd om internalisatie mogelijk te maken. Na de incubatie wordt een fluorescent gelabeld secundair antilichaam toegevoegd om de aan het oppervlak blootgestelde eiwitten te identificeren.Vervolgens wordt een overmaat aan niet-gelabelde secundaire antilichamen toegevoegd om alle resterende complexen van primaire antilichamen aan oppervlakte-eiwitten te blokkeren. De gekweekte neuronen worden daarna gepermeabiliseerd en er wordt een secundair antilichaam van een andere kleur toegevoegd om geïnternaliseerde eiwitten te detecteren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die via immunofluorescentiemicroscopie de relatieve niveaus van geïnternaliseerde versus oppervlakte-eiwitten tonen.Door deze procedure te volgen, kan een tijdscursus van de internalisatie van oppervlakte-eiwitten worden verkregen, wat informatie oplevert over de eiwittransport-snelheden onder basale en gestimuleerde omstandigheden. Begin deze procedure met het voorbereiden van dekglasjes voor celcultuur; was met polylysine gecoate 18 millimeter borosilicaatglas dekglasjes, die een dag eerder zijn voorbereid door ze te dopen in drie afzonderlijke spoelbakjes met PBS. Voeg 500 µL laminaatoplossing toe aan de wells van een 12-well plaat en plaats vervolgens, met behulp van een pincet, de dekglasjes in elke well. Druk elk dekglasje aan om er zeker van te zijn dat het plat op de bodem van de well ligt. Incubeer gedurende twee uur bij 37 °C; dit protocol kan worden uitgevoerd met ofwel E 15 muiscortices of E 18 rathippocampi.In deze demonstratie worden muis-cortices gebruikt. Plaats de cortices van een half nest of één nest embryo's op ijs in een eppendorfbuisje van één milliliter met PBS met calcium en magnesium en zet deze op ijs. Verwijder vervolgens, met behulp van een micropipet van één milliliter, de PBS uit het corticale weefsel.Voeg vervolgens 500 µL van een Pappa DNA-oplossing toe aan het corticale weefsel van een half nest embryo's. Incubeer gedurende 15 tot 20 minuten bij 37 °C. Tik tijdens de incubatieperiode tweemaal voorzichtig tegen de buis om de inhoud te mengen. Gebruik na de incubatie een vlamgepolijste gesiliconiseerde Pasteurpipet om het weefsel voorzichtig 10 tot 15 keer te tritureren totdat celdispersie is bereikt.Er mogen weinig tot geen stukjes niet-gedissocieerd weefsel overblijven; voorkom de vorming van bellen. Breng de gedissocieerde cel-suspensie voorzichtig in laagjes aan bovenop een kussen van 3 mL 4%BS, A in Hank's BSS met additieven. Centrifugeer vervolgens in een benchtop-centrifuge met een swing-out rotor bij 100 ×g gedurende zeven minuten.Verwijder na het centrifugeren voorzichtig het supernatant, waarbij u erop let dat u de celpellet niet aspireert. Voeg vervolgens één milliliter compleet neurobasaal medium toe en pipetteer dit voorzichtig op en neer om de gepelletteerde cellen te resuspenderen. Gebruik daarna een hemocytometer om de concentratie levende cellen te bepalen.Alleen fase-heldere cellen mogen als levend worden beschouwd vlak voor het uitplaten. Aspireer de overtollige laminaat-serumoplossing van de dekglasjes in de putjes en vervang deze door primair neuronencultuurmedium. Voeg vervolgens 75.000 tot 100.000 primaire neuronen toe aan elk putje.Kweek de neuronen tot 21 dagen in neurobasaal medium bij 37 °C, 5% koolstofdioxide. Voeg op dag zeven, en elke week daarna, anti-mitotisch fluordeoxyuridine toe om overgroei van glia te voorkomen en voer een halve mediumverversing uit. Gedurende de eerste week in cultuur ontwikkelden de neuronen dendritische bomen, zoals te zien is in deze afbeelding van een tweedaagse cultuur. Tegen de tweede tot derde week zijn ze volgroeid en vindt synaptogenese plaats.Een uitgebreid netwerk van projecties is geïllustreerd in deze figuur, genomen na 14 dagen in vitro; om oppervlakte-blootgestelde eiwitten van belang te labelen, voegt u het primaire antilichaam direct toe aan het geconditioneerde medium in de juiste concentratie. Elke conditie dient in triplo te worden getest. Vier controles, pre-immuun serum of antilichamen die intracellulaire regio's van het eiwit herkennen die niet worden blootgesteld tijdens exocytose, kunnen worden gebruikt in dezelfde verdunning als het test-primaire antilichaam. Plaats de cellen terug in de cultuurincubator voor één, twee of vier uur; aspireer na de incubatie het medium dat het antilichaam bevat en was de wells één keer voorzichtig maar snel met PBS.Breng de wells op kamertemperatuur door oplossing toe te voegen en deze vervolgens af te zuigen. Voeg daarna vers bereide 4% paraformaldehyde toe en laat dit vijf minuten incuberen. Voeg na fixatie kamertemperatuur toe om de cellen te fixeren.Verwijder de paraformaldehyde-oplossing uit de wells en gooi deze af in een container voor vloeibaar afval in de zuurkast. Spoel de cellen vervolgens snel drie keer met PBS, zoals eerder beschreven. Laat de derde wasbeurt in de wells staan, zodat het dekglas gemakkelijk kan worden verwijderd.Gebruik vervolgens een pincet om de dekglasjes voorzichtig uit de plaat te verwijderen en plaats deze met de celzijde naar boven op een vel parafilm op de bodem of het deksel van een wegwerpkweekplaat. De rest van het kleuringsprotocol zal op dit oppervlak worden uitgevoerd. Pipetteer voorzichtig blokkeringsoplossing van PBS 5%BSA op de cellen, zodat er een ronde, bubbelvormige druppel op het dekglasje ontstaat om uitdroging te voorkomen. Incubeer gedurende 30 minuten.Het is belangrijk om te onthouden dat er geen detergent aan de blokkeringsoplossing mag worden toegevoegd. In deze fase mogen de cellen niet worden gepermeabiliseerd wanneer alleen oppervlakte-eiwitten van de cel gelabeld moeten worden. Zuig na het blokkeren de blokkeringsoplossing af. Breng vervolgens, om de aan het oppervlak blootgestelde eiwitten te labelen, een fluorescent gelabeld secundair antilichaam aan en incubeer dit twee uur bij kamertemperatuur. Zuig na de incubatie het secundaire antilichaam af en was de dekglasjes twee keer met PBS gedurende vijf minuten per keer om elk eiwit op het celoppervlak dat niet gebonden is door het gelabelde secundaire antilichaam te blokkeren.Incubeer de niet-permeabele neuronen gedurende de nacht met een hoge concentratie ongelabelde secundaire antilichamen bij kamertemperatuur. De incubatie gedurende de nacht is cruciaal.Kortere incubatieperiodes zullen primaire antilichamen die niet volledig door het gelabelde secundaire antilichaam zijn gebonden, niet volledig blokkeren. Was de dekglasjes de volgende dag tweemaal gedurende vijf minuten met PBS, zoals eerder beschreven. Fixeer de cellen vervolgens opnieuw met 4% paraformaldehyde in fosfaatbuffer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, waarna het fixatief wordt verwijderd.Spoel de cellen snel twee keer af met PBS. Voor intracellulaire labeling worden de cellen vervolgens gepermeabiliseerd en geblokkeerd met PBS dat 5%BSA en 0,1%Triton X 100 bevat, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na de permeabilisatie de blokkeringsoplossing.Zorg ervoor dat de dekglasjes niet uitdrogen. Voeg een secundair antilichaam met een andere markering toe en incubeer twee uur bij kamertemperatuur. Nadat het tweede secundaire antilichaam is verwijderd, worden de dekglasjes drie keer gedurende vijf minuten gewassen met PBS.Was ze vervolgens kort met gedeïoniseerd water. Plaats de dekglasjes op objectglazen met een waterig montage-medium dat een anti-fade middel bevat en laat ze drogen. Bewaar de objectglazen in het donker bij 4 °C voor een optimale bewaring van het fluorescentiesignaal. Beeld de immunogekleurde cellen af op een confocale microscoop met gebruik van de juiste excitatie- en emissiefilters.Gebruik voor alle replicaten en condities na de beeldvorming dezelfde parameters voor de beeldacquisitie. Gebruik standaard software voor beeldanalyse, zoals Fiji Image J of metamorph, om de geïntegreerde densiteit van standaard regions of interest of de puncta-attributen, zoals aantal en grootte, te bepalen om vast te stellen of seizure related gene six of says six aanwezig was op en geïnternaliseerd was vanuit het neuronale oppervlak. Dubbelkleurige markering van gecultiveerde hippocampale neuronen van ratten werd uitgevoerd zoals beschreven in deze video.In deze afbeelding is het celoppervlakte-eiwit in cyaan weergegeven en het geïnternaliseerde eiwit in groen. Dubbele kleuring, aangegeven door de pijlpuntsymbool, werd alleen waargenomen in een cel die ongezond leek. Om te bepalen of het eiwit dat tijdens de incubatie voor antilichaam-feeding werd geïnternaliseerd gelokaliseerd was in endosomen, werden neuronen die de marker voor vroege recycle-endosomen transferrine mCherry tot expressie brachten, na permeabilisatie immunogekleurd. Zoals te zien is in dit gebied van de dendritische boom, was er een uitgebreide overlap van de punctate kleuring met transferrine, wat bevestigt dat het geïnternaliseerde eiwit in endosomen gelokaliseerd was. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat een enkel antilichaam kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen de pools van celoppervlakte- en geïnternaliseerd eiwit.

differential-labeling-cell-surface-internalized-proteins-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We demonstreren het gebruik van het gen pistool op fluorescente kleurstoffen, zoals DII, te introduceren in neuronen in de hersenen plakjes van knaagdieren en niet-menselijke primaten van verschillende leeftijden. In dit specifieke geval maken we gebruik van volwassen muizen (3-6 maanden oud) en volwassen cynomologus apen (9-15 jaar oud). Deze techniek, die oorspronkelijk beschreven door het laboratorium van Dr Lichtman...

DiOLISTIC Labeling van neuronen van de knaagdieren en niet-menselijke primaten Brain Slices

Een snelle benadering van interacties en effecten op moleculaire mechanismen van de aanwezigheid van antilichamen in een intracellulaire omgeving onderzoeken beschreven. De werkwijze omvat transfectie van antilichamen in levende cellen met een niet-covalente complexvorming gebaseerd op een lipide formulering. De techniek is toepasbaar voor geïmmortaliseerde cellijnen en primaire cellen.

Antilichaam Transfectie in Neuronen als een instrument om de ziekte Pathogenese Studie

Source: Becker-Kojić, Z. A., et. al., GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates a protocol for preparing neural cells derived from reprogrammed peripheral blood cells for fluorescence microscopy, showcasing distinct cell types and developmental stages through immunofluorescence imaging.

Immunofluorescence Microscopy of Neural Cells Differentiated from Peripheral Blood-Derived Cells 

We een techniek voor etikettering enkele neuronen in het centrale zenuwstelsel (CNS)...

Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Microglia vormen de bewoner immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) met een hoge capaciteit te fagocyteren of overspoelen materiaal in hun extracellulaire omgeving. Hier wordt een breed toepasbare, betrouwbaar en zeer kwantitatieve assay voor het visualiseren en meten-gemedieerde microglia afblazen van synaptische componenten beschreven.

Een Engulfment Assay: Een protocol bij interacties tussen CNS Fagocyten en Neuronen Assess

We bieden een gedetailleerde beschrijving van een protocol voor flowcytometrische analyse van oppervlakte-antigenen en/of intracellulaire antigenen in neurale celtypen. Kritische aspecten van experimentele planning, stap-voor-stap methodologische procedures en fundamentele principes van flowcytometrie worden uitgelegd om neurobiologen in staat te stellen deze krachtige technologie te benutten.

Flowcytometrie Protocollen voor Surface en intracellulaire Antigen Analyses van Neural Cell Types

Receptor handel moduleert signalering en celgevoeligheid liganden en zelf, reagerend op celomstandigheden, zoals ligand-geïnduceerde signalering. Hier beschrijven we een krachtige en flexibele techniek voor het kwantitatief beoordelen van geneesmiddel-geïnduceerde receptor handel met immunolabeling en colocalizational analyse.

Tracking-Drug geïnduceerde veranderingen in Receptor Post-internalisatie mensenhandel door Colocalizational Analyse

Het onderzoek naar membraanhandel is cruciaal voor het begrijpen van neuronale functies. Hier introduceren we een methode voor het kwantificeren van vesikelmotiliteit in neuronen. Dit is een handige methode die kan worden aangepast aan de kwantificering van membraanhandel in het zenuwstelsel.

Kwantificering van Endosome en Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Neuronale prikkelbaarheid kan worden gedifferentieerd door middel van een dynamisch proces van endo- en exocytose van excitatory ionotropic glutamaat receptoren. Hier beschreven is een toegankelijke, hoge-inhoud assay voor het kwantificeren van de groepen van de bevolking van de oppervlakte en interne receptor.

Een High-inhoud Assay voor het toezicht op AMPA Receptor mensenhandel

Dit artikel presenteert een methode voor de studie van glutamaat receptor (glur) handel in gezien primaire hippocampal culturen. Met behulp van een antilichaam-voedende benadering voor het etiket van endogene of overexpressie receptoren in combinatie met farmacologische benaderingen, deze methode maakt het mogelijk voor de identificatie van moleculaire mechanismen regulering van GluR oppervlakte expressie door modulerende processen voor internalisatie of recycling.

Een aanpak van antilichamen voeding te bestuderen glutamaat receptor handel in Dissociated primaire Hippocampal culturen

Het neuronale membraanproteasoom (NMP) werd onlangs geïdentificeerd in een subset van somatosensorische neuronen als een belangrijke regulator van perceptie van aanraking, pijn en jeuk. Dit artikel presenteert een robuuste workflow voor het analyseren van celtype-specifieke NMP-expressie en -functie met behulp van celsortering, transcriptoomprofilering en op cultuur gebaseerde immunofluorescentieanalyses.

Celsubtype-specifieke analyse van neuronaal membraanproteasoom in somatosensorische neuronen

Leer differentiële labeling van oppervlakte- en geïnternaliseerde eiwitten in levende gekweekte neuronen met antilichamen. Deze methode onderscheidt celmembraanproteïnen van geïnternaliseerde pools via immunofluorescentiemicroscopie.

Differentiële Labeling van Cell-oppervlak en Internalized Eiwitten na Antibody Voeden van Levende gekweekte neuronen

Meer video's verkennen