Voorbereiding van Segmented Microtubules om Motions Gedreven door het demonteren uiteinden van microtubuli Studie
15 maart 2014
Microtubules zijn inherent instabiel polymeren en hun schakelen tussen groei en bakvet stochastische en moeilijk te controleren. Hier beschrijven we protocollen gebruiken gesegmenteerde microtubuli met photoablatable stabiliserende caps. Depolymerisatie van gesegmenteerde microtubuli kan worden geactiveerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het bijstaan van de analyse van bewegingen met de demontage uiteinden van microtubuli.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de bewegingen van eiwitmoleculen en met eiwitten bedekte kralen te bestuderen met de uiteinden van depolymeriserende microtubuli. Dit wordt bereikt door een herbruikbare flowkamer samen te stellen met een schoon, gedimensioneerde dekglas. Vervolgens worden microtubuli-zaden voorbereid die aan het dekglas zijn bevestigd en worden gebruikt om microtubuli te nucleëren, die vervolgens tijdelijk worden gestabiliseerd met foto-destructieve caps.
Vervolgens worden GFP-gelabelde eiwitten of met eiwitten bedekte kralen in de flowkamer gebracht en binden ze zich aan gesegmenteerde microtubuli. Microtubuli-depolymerisatie wordt dan geactiveerd door de caps te verwijderen door middel van foto-ablatie. Beelden worden geanalyseerd met CH om te bepalen of de gelabelde eiwitten tip-trackinggedrag vertonen, wat beweging is met de uiteinden van depolymeriserende microtubuli.
Het grootste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om microtubuli-depolymerisatie met hoge temporele en speciale resolutie te activeren. De visuele demonstratie van deze methode is cruciaal. Het protocol begint met de voorbereiding en assemblage van de flowkamer met behulp van ultrasoon malen.
Pas gewone microscoopglazen aan om twee groeven te hebben. Maak de groeven 14 millimeter uit elkaar. Plus of min één millimeter, wat optimaal is voor kamers die zijn samengesteld met vierkante 22 millimeter dekglazen.
Plaats vervolgens een 100 millimeter lange polyethyleenbuis in elke groef in de schuif, waarbij ongeveer vijf millimeter overhang aan de binnenkant van de groeven overblijft. Bevestig de buizen in de groeven met cyanoacrylaatlijm, waarbij de buizen volledig in de groeven worden ingebed. Vul de groeven voorzichtig met epoxylijm zonder morsen.
Laat het een dag drogen. De volgende dag. Gebruik een scherp scheermes om de verstevigde lijm drie tot vier millimeter vanaf het distale uiteinde van elke bevestigingsplaats af te snijden.
Verwijder de delen die dicht bij het midden van de schuif liggen. De buizen moeten in hun groeven blijven en de sneden moeten vlakke oppervlakken met buisopeningen maken. Vul vervolgens een spuit met water en test of de buizen goed werken.
Als de vloeistof vrij stroomt, breng dan een druppel epoxylijm van ongeveer vijf millimeter in diameter aan op de buitenste uiteinden van de groeven en laat deze ongeveer een dag drogen. De voltooide flowkamers zijn dus duurzaam en kunnen vele maanden herhaaldelijk worden gebruikt. Dit drie uur durende protocol bereidt 12 dekglazen voor.
Het vereist een afzuigkap, een keramische dekglashouder, drie 15 milliliter, kleurenpotten en 1 250 milliliter glazen pot met een deksel. De kleurenpotten moeten vier, normale nummer 1 22 millimeter dekglazen in een stapel passen. Begin met een stapel van 12 vooraf gereinigde en gedroogde dekglazen in de keramische houder.
Vul de pot met plus een repel silene-oplossing en laat de schuiventopjes langzaam zakken. Sluit de pot en incubeer deze vijf minuten op kamertemperatuur. De meest cruciale stap om een uniforme dekglasbeschaving te garanderen, is het vermijden van watersporen tijdens de incubatie van de dekglazen in Selene-oplossing.
Deze stap is essentieel voor de strakke bevestiging van microtubulaire zaden. Later in een protocol, wanneer de dekglazen klaar zijn, verwijdert u de keramische houder uit de pot. Breng vervolgens de dekglazen afzonderlijk over met behulp van met Teflon gecoate pincetten van de keramische houder naar met methanol geladen kleurenpotten.
Laad nu de drie potten in het waterreservoir van een sonische bad met een metalen of glazen voetstuk erin. Het waterniveau moet op twee derde van de hoogte van de potten zijn. Soniceert de potten op 70 watt gedurende 20 minuten. Tijdens de sonicatie, ververs de methanoloplossing elke vijf minuten.
Wanneer de sonicatie voltooid is, spoelt u de dekglazen 10 keer schoon met gedeïoniseerd water. Als de siloisatie goed heeft gewerkt, zullen de dekglazen er droog uitzien wanneer ze uit het water worden gehaald. Ongeacht het uiterlijk, verwijdert u alle resterende water grondig. Gebruik stikstofgas om de gedroogde dekglazen over te brengen naar een met stikstof gedroogde, afsluitbare container.
Leg Kim-doekjes tussen de dekglazen. Ze kunnen op deze manier enkele weken op kamertemperatuur worden bewaard. Dit protocol vereist één tot twee uur, één flowkamer en voorbereide G-M-P-C-P-P gestabiliseerde microtubulaire zaden.
Monteer eerst de flowkamer. Bevestig twee stukken dubbelzijdig plakband langs het centrale vijf millimeter brede gebied van de voorbereide schuif en druk het dekglas stevig op het plakband. Vul de kamer met behulp van een ene milliliter spuit met 100 microliters van B rrb 80-oplossing via een buis.
Pers vervolgens een kleine druppel van twee kleuren quick cast-afdichting op een kleine plastic petrischaal. Meng het snel en grondig met een tandenstoker. Het zal groen worden.
Breng de afdichting onmiddellijk langs alle randen van het dekglas aan. Controleer of de afdichting te diep onder het dekglas doordringt. Als een buis geblokkeerd is, ontkoppelt u de spuit en tilt u de buis op om lichte druk uit te oefenen om te voorkomen dat de afdichting lekt in Na 10 minuten, zorg ervoor dat de oplossingstroom niet wordt beperkt.
Breng vervolgens de kamer over naar een verwarmd microscoopplatform op 32 graden Celsius. Bevestig een van de buizen aan een pomp voor oplossingsverwijdering. Dompel het vrije uiteinde van de inlaatbuis in een 0,5 millimeter flesje met warm BRB 80-buffer.
Stel de pomp in op 100 microliters per minuut en gebruik deze indien nodig om voorzichtig luchtbellen uit te drukken. Dit kan ook handmatig worden gedaan. Gebruik nu de pomp om 30 microliters warme antigeenantilichamen te laden.
Schakel de pomp uit en wacht vijf minuten. Schakel de pomp tijdens alle incubaties uit. Was vervolgens de kamers met ongeveer 100 microliters warm
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de dynamiek van eiwitmoleculen en eiwitgecoate kraaltjes die interageren met depolymeriserende microtubuli. Door gebruik te maken van gesegmenteerde microtubuli met fotoablateerbare stabiliserende caps, kunnen onderzoekers het depolymerisatieproces met hoge precisie beheersen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Biofysica
Achtergrond
- Microtubuli zijn onstabiele polymeren die een stochastische groei en verkorting ondergaan.
- Inzicht in de dynamiek van microtubuli is cruciaal voor het begrijpen van cellulaire processen.
- Fotoablateerbare caps maken gecontroleerde depolymerisatie van microtubuli mogelijk.
- Het volgen van eiwitbewegingen kan interacties met de uiteinden van microtubuli onthullen.
Doel van de studie
- Om de bewegingen van eiwitten en bolletjes aan de uiteinden van depolymeriserende microtubuli te analyseren.
- Om een methode te ontwikkelen voor het triggeren van microtubuli-depolymerisatie met een hoge temporele en spatiale resolutie.
- Om het tip-trackinggedrag van gelabelde eiwitten te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Assemblage van een herbruikbare flowkamer met een schoon dekglas.
- Voorbereiding van microtubuli-zaden op het dekglas voor nucleatie.
- Tijdelijke stabilisatie van microtubuli met behulp van fotodestructeerbare caps.
- Introductie van GFP-gelabelde eiwitten of eiwitgecoate kraaltjes in de flowkamer.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle tracking van eiwitbewegingen bij depolymeriserende microtubulusuiteinden.
- Demonstratie van gecontroleerde depolymerisatie met behulp van fotoablatie.
- Analyse van het tip-trackinggedrag van gelabelde eiwitten.
- Inzichten in de dynamiek van microtubulusinteracties met cellulaire componenten.
Conclusies
- De methode maakt een precieze controle over de microtubulidynamiek mogelijk.
- De bevindingen verbeteren het begrip van eiwitinteracties met microtubuli.
- Deze aanpak kan worden toegepast op verdere studies in de celbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Gecontroleerde studie van de beweging van eiwitten en vracht bij desintegrerende microtubuli-uiteinden vult een kritieke leemte in het begrip van krachtgeneratie en moleculair transport tijdens de celdeling. Deze methode maakt kwantitatieve, hoge-resolutie analyse van eiwit-microtubuli-interacties mogelijk, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie en doelwitvalidatie in de vroege ontdekkingsfase. De aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen voor R&D-teams die cytoskeletale doelwitten en transportmechanismen evalueren die relevant zijn voor oncologie- en celbiologieportfolio's.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe bevraging van eiwitfuncties mogelijk aan dynamische microtubule-uiteinden onder gedefinieerde biochemische condities.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door onderscheid te maken tussen tip-tracking en niet-tracking eiwitgedragingen.
- Faciliteert kwantitatieve analyse van de stoichiometrie van eiwitcomplexen met behulp van fluorescentie-intensiteitsmetingen.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets in onderzoek naar het cytoskelet en mitotische pathways.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt een reproduceerbaar platform voor het evalueren van de mobiliteit van eiwitten en vracht in reactie op gecontroleerde microtubuli-depolymerisatie.
- Maakt standaardisatie van kwantitatieve fluorescentie-assays mogelijk via geoptimaliseerde signaal-ruisprotocollen.
- Ondersteunt de schaalbaarheid en herbruikbaarheid van assays via duurzame, herbruikbare stroomkamers en gesegmenteerde microtubuli-preparatie.
- Levert robuuste resultaten voor het screenen van verbindingen of constructen die gericht zijn op microtubuli-geassocieerde processen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro mobiliteitsassays aan ziekte-relevante mechanismen, zoals chromosoomsegregatie en mitotische fouten.
- Biedt continuïteit van moleculair mechanisme naar preklinische modelvalidatie voor cytoskelettargets.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang mogelijk door eiwitfuncties in dynamische cellulaire contexten te verduidelijken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege mechanistische studies tot assayontwikkeling en translationeel onderzoek naar cytoskeletdoelwitten.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing over proteïne-microtubuli-koppeling en mechanismen voor krachtgeneratie.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten van motiliteit en tip-tracking voor de evaluatie van constructen of verbindingen.
- Analytics: Biedt fluorescentiegebaseerde kwantificering van de grootte van proteïnecomplexen en motiliteitsparameters.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro mechanistische bevindingen en ziekterelateerde cellulaire processen zoals mitose.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een gestandaardiseerd, herbruikbaar assayplatform voor meerdere proteïneconstructen en screeningscampagnes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van cytoskeletale targets.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid, standaardisatie en doorvoer van assays via herbruikbare kamers en geoptimaliseerde protocollen.
- Strategische waarde: Ondersteunt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het targetmechanisme in een vroeg stadium te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van programma's voor cytoskeletale en mitotische pathways mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie, eiwitlabeling en microtubuli-biochemie.
- Vereist toegang tot beeldvormingssystemen met fotoablatie-mogelijkheden en software voor kwantitatieve analyse.
- Noodzaakt tot zorgvuldige voorbereiding van dekglasjes en assemblage van de kamer voor een consistente assay.
- Protocollen moeten indien nodig worden aangepast voor verschillende eiwitconstructen en bead-coatings.
- Optimalisatie van de signaal-ruisverhouding en illuminatiecorrectie zijn cruciaal voor kwantitatieve resultaten.
