Rapid Synthese en Screening van chemisch geactiveerde transcriptie Factoren met GFP gebaseerde Reporters

Het algemene doel van deze procedure is het creëren, testen en valideren van genetisch gecodeerde, induceerbare kunstmatige transcriptiefactoren of ATF's met een gewenste specificiteit. Dit wordt bereikt door eerst de ATF te creëren via een eenvoudige gisttransformatie, waarbij de inclusie van een PCR-product van een DNA-bindend domein resulteert in een in-frame fusie met een menselijke oestrogeenreceptor en VP 16. De tweede stap van de procedure is het creëren van een GFP-reporterplasmid voor de ATF door de bindingsplaatsen in het plasmid PMN eight te vervangen door TF-doelsequenties.

De derde stap van de procedure is het analyseren van het vermogen van de ATF om de GFP-reporter te activeren en het beoordelen van het effect ervan op de gistfysiologie door de groeisnelheid te meten. De laatste stap van de procedure is het gebruik van de gevalideerde TF om een inheems genomisch doelwit conditioneel tot expressie te brengen. Uiteindelijk kan elk gewenst doelwitgen conditioneel actief worden gemaakt.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals galactose-gemedieerde inductie van genexpressie, is dat selectieve inductie kan worden bereikt onder diverse nutritionele en fysiologische omstandigheden zonder pleiotrope effecten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de gistbiologie door de snelle en reversibele introductie van gewenste genproducten, waardoor zowel gain- als loss-of-function-studies mogelijk worden gemaakt. Begin met het PCR-amplificeren van het DNA-bindingsdomein of DVD van belang met behulp van een high-fidelity polymerase.

Transformeer meer dan 1 µg van het gezuiverde PCR-product in gist met behulp van de lithiumacetaatmethode. Centrifugeer de cellen na transformatie op maximale snelheid gedurende 15 seconden in een microcentrifuge, verwijder het transformatiemengsel en resuspendeer de cellen in ongeveer 200 µL steriel water voordat ze op gistextract-pepton-dextrose (YPD) medium worden uitgeplaat. Voer de volgende dag een replica-plating uit van het YPD-medium naar vijf fluorotricinezuurplaten.

Na twee tot vier dagen groei worden ten minste vijf tot 10 kolonies uitgezaaid op YPD. Voer vervolgens een kolonie-PCR uit met de primers uit het tekstprotocol en bepaal de sequentie om de inclusie te verifiëren. Verdun de oligos van het gewenste bindingsregio tot equimolaire concentraties.

Fosforyleer de bindingsregio met T4-polynucleotidekinase en vervolgens met een neo thermocycler volgens de reactiecondities in het tekstprotocol. Digereer daarna ongeveer één tot twee microgram PMN 8 met not one HF en xb.1 gedurende één uur bij 37 °C gel.

Zuiver de backbone-band en verdun de gezuiverde backbone tot 10 nanogram per microliter. Verdun vervolgens de dubbelstrengse gefosforyleerde bindingsplaats tot vijf keer de molaire concentratie van de backbone per microliter. Ligeer de bindingsplaatsen met T4 DNA-ligase in de gedigesteerde backbone gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Voer de transformatie uit door de helft van de ligatiereactie toe te voegen aan 50 µL standaard chemisch competente EIA E. coli-cellen, en volg de procedure zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg na het herstel van de cellen 100 tot 200 µL cellen toe per Luria-Bertani (LB) plus ampicilline-plaat en incubeer deze gedurende de nacht. Kweek de volgende dag de E. coli op in LB plus ampicilline vloeibaar medium en isoleer het plasmid-DNA zoals beschreven in het tekstprotocol.

Verifieer vervolgens de sequentie van het nieuwe reporterplasmide uit de ligatiekolonies. Transformeer tot slot het nieuwe reporterplasmide in de E-stam die de A TF bevat middels lithiumacetaat-transformatie. Begin hiermee door een stam die TF plus reporter bevat gedurende één nacht te kweken in vijf milliliters synthetisch compleet medium zonder uracil.

Neem 9 schudkolven van 250 milliliters en voeg aan elke kolf 25 milliliters SC minus URA toe. Bereid vervolgens zeven van de kolven met verschillende verdunningen van beta-estradiol, zoals vermeld in het tekstprotocol, door middel van een tienvoudige seriële verdunning van een 25 millimolar beta-estradiol-voorraadoplossing; voeg 125 microliters van de overnight-culturen toe aan deze zeven kolven. Inoculeer de twee overgebleven kolven met een constitutief GFP-producerende stam en een stam die GFP mist. Deze zijn nodig voor het kalibreren van de flowcytometer.

Schud de kolf gedurende 12 tot 18 uur bij 200 RPM en 30 °C. Neem vervolgens 500 µL van elke cultuur af en centrifugeer deze in afzonderlijke 1,7 ml eppendorfbuisjes. Aspireer na centrifugatie het supernatant, spoel de gepelletteerde cellen één keer met flowcytometrie-buffer en resuspendeer de cellen vervolgens in één ml van dezelfde buffer.

Voeg vervolgens één milliliter flowcytometriebuffer toe aan negen Falcon-buisjes. Voeg de resuspendeerde cellen toe aan de buffer in de Falcon-buisjes tot een eindvolume van twee milliliter. Voer tot slot de flowcytometrie uit.

Gebruik forward scatter en side scatter om gistcellen te identificeren. Stel de stroomsnelheid in op ongeveer 3000 cellen per seconde. Meet het GFP via kanaal 50 en ga verder zoals beschreven in het tekstprotocol: strijk vanuit bevroren stocks zowel een stam met A TF als een stam zonder A TF uit op YPD. Na twee dagen groei worden aparte cultuurbuizen met vijf milliliter vloeibare YPD geïnoculeerd en wordt elke stam gedurende één nacht gekweekt bij 30 graden Celsius.

Voer tienvoudige seriële verdunningen uit van een 0,25 millimolaire bèta-estradiol-stockoplossing tot 10.000-voudig in 100%ethanol. Voeg 40 µL van elke overnight-cultuur toe aan 10 mL YPD-medium. Voeg voor elke stam 96 µL van de verdunde cellen toe aan 18 putjes van een 96-wellplaat.

Voeg vervolgens vier µL bèta-estradiol toe aan de cellen. Een essentieel punt is om ervoor te zorgen dat elke well dezelfde totale hoeveelheid ethanol bevat. Voer een triplikaat uit waarbij drie van de wells per stam enkel ethanol bevatten.

Dek de 96-wells plaat af met een gasdoorlatbaar membraan. Monitor de groei bij een optische dichtheid van 600 nanometer in een plaatlezer. Kwantificeer de groeisnelheden met behulp van diverse methoden, zoals het bepalen van de maximale helling.

Nadat het plasmide is voorbereid volgens de instructies in het tekstprotocol PCR, wordt de can MX promoter-cassette geamplificeerd. Transformeer het PCR-product in een A TF-expresserende stam met de lithiumacetaatmethode; plaat de getransformeerde cellen op YPD en maak de volgende dag een replica-plaat op YPD plus G 418 antibioticum. Bevestig tot slot de juiste insertie van de promoter met de forward-primer en een reverse-primer die intern ligt ten opzichte van het gen waarvan de promoter is vervangen.

Het uiteindelijke PCR-product is ongeveer 1,2 KB. Hier wordt de inductie van GFP getoond door drie verschillende a TF-promotorparen Z vier EV, Z drie EV of GEV over een bepaalde tijd als reactie op 1 µM beta-estradiol. Let op de toename in GFP-productie als reactie op de ATF's die geen gist-DNA-bindingsdomeinen bevatten. Dit kan het gevolg zijn van het feit dat deze factoren een single-gene specificiteit bereiken in het gistgenoom.

GEV-inductie alleen leidt tot activering of repressie van honderden genen, terwijl Z three EV en Z four EV alleen de expressie activeren van een doelgen dat stroomafwaarts van een synthetische promotor met passende bindingsplaatsen is geplaatst. Hier wordt de inductie van GFP door Z three EV getoond in reactie op nul nanomolar bèta-estradiol, en één micromolar bèta-estradiol na 18 uur inductie. De fluorescentie werd ook gemeten in cellen die geen GFP bevatten om de strikte regulatie van het Z three EV-systeem te illustreren. Het vermogen van Z three EV om GFP te induceren over een reeks bèta-estradiolconcentraties wordt hier getoond.

De gemiddelde fluorescentie van de distributies onthult dat de relatie tussen de inducerconcentratie en de expressie-output gradueel is, met een Hill-coëfficiënt van ongeveer één, wat duidt op onafhankelijke binding van Z three EV. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals gene expression microarrays, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe de verandering in de expressie van een enkel gen de genoombrede genexpressiepatronen beïnvloedt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u kunstmatige transcriptiefactoren kunt ontwerpen, testen en de effectiviteit ervan kunt valideren. Deze kunstmatige transcriptiefactoren controleren conditioneel de expressie van genen die stroomafwaarts van geschikte DNA-doelsequenties zijn geplaatst.