Systemische Injectie van neurale stamcellen / progenitorcellen in Muizen met chronische EAE
15 april 2014
De transplantatie van neurale stamcellen / progenitorcellen (NPC) houdt grote beloften in de regeneratieve neurologie. De systemische toediening van NPCs is in efficiënte, lage invasief en therapeutisch zeer effectief protocol om stamcellen te leveren in de hersenen en ruggenmerg van knaagdieren en niet-menselijke primaten die door experimentele chronische inflammatoire schade aan het centrale zenuwstelsel.
Het algemene doel van dit protocol is om neurale stamcellen via intraveneuze injectie te leveren aan het centrale zenuwstelsel bij muizen die zijn aangetast door experimentele auto-immuun encefalitis, een ziektemodel dat multiple sclerose nabootst. Dit wordt bereikt door eerst neurale stamcellen, of NPCs, af te leiden uit de subventriculaire zone van de hersenen van volwassen muizen. De tweede stap is om NPCs genetisch te markeren met virale vectortechnologie voor in vivo celidentificatie en -tracking.
Vervolgens worden prolifereren neurosferen gedissocieerd in een enkele cel suspensie, opnieuw opgeschort bij de gewenste dichtheid en geïnjecteerd in de staarvan van EAE muizen op het hoogtepunt van de ziekte. Uiteindelijk worden postmortem orgaan en weefsel pathologie en immunohistochemie uitgevoerd om de overleving, verdeling en integratie van geïnjecteerde stamcellen te identificeren en te karakteriseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een minimaal invasieve, veilige en effectieve methode biedt om stam- en voorlopercellen in het ontstoken zenuwstelsel te transplanteren.
Deze methode helpt bij het beantwoorden van drie belangrijke vragen met betrekking tot de veiligheid en werkzaamheid van systemisch geïnjecteerde stamcellen in modellen van inflammatoire ziekten van het zenuwstelsel. De visuele demonstratie van deze methode is vooral nuttig voor jonge wetenschappers omdat het helpt bij het begrijpen van kritieke experimentele stappen van hersenstamboceleisolatie tot voorbereiding voor systemische injectie in een muismodel voor multiple sclerose. De eerste stap is om alle oplossingen die nodig zijn voor dissectie bij elkaar te verzamelen. Gebruik de juiste steriele techniek.
Plaats een vers geïsoleerde hersenen op een hersenslicer matrix. Gebruik twee scheermessen om coronale secties te maken, twee millimeter van de voorste pool van de hersenen, met uitzondering van de optische banen en drie millimeter achter de vorige snede. Plaats de hersenslices op een schone petrischaal en werk onder een dissectiemicroscoop om het subventriculaire zone weefsel te isoleren.
Na het fijnsnijden van het weefsel, voeg het toe aan 30 milliliter van eerder bereide en gefilterde spijsverteringsoplossing. Schud voorzichtig en incubeer gedurende 30 minuten met elke 15 minuten schudden. Na centrifugatie, verwijder de supernatant en suspendeer de pellet in 200 microliters van complete groei.
Medium of CGM door pipetten. Eerst met een P 1000, en vervolgens met een P 200 pipette. Zodra een enkele cel suspensie is bereikt, breng het op vijf milliliter met CGM en breng over naar een nieuwe fles.
Plaats de cellen in een incubator en laat neurosferen gedurende vijf tot zeven dagen vormen. Wanneer klaar, verzamel de suspensie in een 15 milliliter buis en centrifugeer. Verwijder de supernatant en suspendeer de palate in 200 microliters van CGM.
Dissocieer de neurosferen mechanisch door ze 100 tot 150 keer door een P 200 pipettentip te laten passeren. Breng de suspensie op een milliliter met CGM. Verdun vervolgens de suspensie nauwkeurig.
Meng het juiste volume met een vitale kleurstof en vul een hemo cytometer om het aantal cellen te bepalen. Suspendeer de cellen opnieuw in de juiste concentratie en breng over naar een nieuwe fles. Herhaal deze stappen elke vier tot vijf dagen om de identificatie van getransplanteerde cellen in vivo te helpen.
NPC's worden 72 uur na NPC transductie getransduceerd met virale vectoren die coderen voor reporter genen. De expressie van fluorescerende reporter genen is verifieerbaar door middel van immunofluorescentie of flowcytometrie. Wanneer klaar, oogst de GFP expresserende neurosferen door centrifugatie en verwijder de supernatant.
Voeg vervolgens 200 microliters van cel aggregaat dissociatie oplossing toe en incubeer gedurende 10 minuten. Haal de cellen en suspendeer ze voorzichtig opnieuw om een enkele cel suspensie te verkrijgen. Zorg ervoor dat luchtbellen worden vermeden.
Na het tellen en verdunnen van de cellen, bewaar de celsuspensie op ijs tot het klaar is om te worden gebruikt. Zodra de neurosferen klaar zijn, haal de muizen die eerder waren voorbereid om als muismodel voor CNS te dienen. Schadebehandeling dient plaats te vinden op het hoogtepunt van de ziekteexpressie.
Begin door de muizen ongeveer 10 minuten in een verwarmingsbox te plaatsen om de staarvan te laten verwijden. Wanneer klaar, breng een muis over van de verwarmingsbox naar een muisbegrenzer. Sluit de begrenzer om beweging te beperken en isoleer de staar.
Steriliseer het injectiegebied op de staar met een geschikte topische oplossing. Vul een insuline spuit van één milliliter met 150 microliters cel suspensie en zorg ervoor dat alle bubbels worden verwijderd. Lokaliseer de ader op het dorsale oppervlak van de staar en plaats de naald parallel aan de ader in het midden van de onderste helft van de staar.
Hier is de ader dichter bij het huidoppervlak. Dit vergemakkelijkt dus de procedure. Breng de naald voorzichtig in de ader en zorg ervoor dat deze op de juiste positie staat door een paar microliters bloed terug te trekken.
Injecteer vervolgens langzaam de oplossing in de staarvan Na de injectie, verwijder de naald en oefen een paar seconden druk uit om de bloeding te vertragen. Plaats de muis in een schone kooi en controleer tot herstel. Herhaal dezelfde procedure voor alle muizen op vooraf bepaalde experimentele tijdstippen.
Steekproeven worden genomen van behandelde en controledieren en geanalyseerd om infiltratie en integratie van NPC's in het centrale zenuwstelsel en andere weefsels te bepalen wanneer ze als neurosferen prolifereren. NPC's die worden geplaat onder geschikte differentiatiecondities, expresseren markeren van mitotische activiteit zoals fosfo hison H drie getoond in groen en van ongedifferentieerde neurale cellen zoals nest in getoond in rood. NPC's expresseren markeren typisch voor de drie neurale lijnen zoals de astroglia marker, GFAP, de neuronale marker, micro tubulaire geassocieerde eiwit twee, en de oligo dyl gliale markers O vier en myeline basiseiwit kernen worden tegengekleurd met dpi ongedifferentieerde MPC's die therapeutisch effectief moeten zijn na transplantatie moeten celoppervlakte adhesiemoleculen uitdrukken die CD 44 en de alfa vier subeenheid
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de toediening van neurale stamcelvoorlopers (NPC's) aan het centrale zenuwstelsel (CZS) via intraveneuze injectie bij muizen met experimentele auto-immuunencefalomyelitis, een model voor multiple sclerose. De methode legt de nadruk op een minimaal invasieve benadering voor een effectieve stamceltransplantatie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Regeneratieve Geneeskunde
- Celtherapie
Achtergrond
- Neurale stam-/progenitorcellen (NPC's) hebben potentieel in de regeneratieve neurologie.
- Systemische toediening van NPC's is een weinig invasief en effectief therapeutisch protocol.
- Deze studie maakt gebruik van een model dat multiple sclerose nabootst om de toediening van NPC's te evalueren.
- Genetische labeling van NPC's maakt tracking en identificatie na transplantatie mogelijk.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het toedienen van NPC's aan het CZS via intraveneuze injectie.
- Om de overleving en integratie van getransplanteerde NPC's in een inflammatoire omgeving te beoordelen.
- Om een veilig en effectief protocol voor stamceltransplantatie te bieden.
Gebruikte methoden
- Afgeleiding van NPC's uit de subventriculaire zone van volwassen muizen.
- Genetische markering van NPC's met behulp van virale vectortechnologie.
- Dissociatie van prolifererende neurosferen tot een enkelcel-suspensie.
- Intraveneuze injectie van NPC's in EAE-muizen op het hoogtepunt van de ziekte.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle aflevering van NPC's in het centrale zenuwstelsel via intraveneuze injectie.
- Karakterisering van de overleving en distributie van NPC's in postmortale analyse.
- Demonstratie van de effectiviteit van de minimaal invasieve transplantatiemethode.
- Inzichten in de integratie van NPC's in een ontstoken zenuwstelsel.
Conclusies
- Het protocol biedt een levensvatbare aanpak voor NPC-transplantatie bij CZS-aandoeningen.
- Minimaal invasieve technieken kunnen de veiligheid en effectiviteit van stamceltherapieën verbeteren.
- Verdere studies kunnen het therapeutische potentieel van NPC's bij neuro-inflammatoire aandoeningen uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Systemische toediening van neurale stam-/progenitorcellen (NPC's) biedt een minimaal invasieve benadering om ontstekingslaesies in het centrale zenuwstelsel te targeten, waarmee een belangrijke uitdaging in de regeneratieve neurologie voor multifocale aandoeningen zoals multiple sclerose wordt aangepakt. Deze methode maakt biodistributie naar perivasculaire schadeplaatsen mogelijk, wat bijdraagt aan het mechanistische minimaliseren van risico's bij celtherapieën voor neuro-inflammatoire aandoeningen. Het biedt een translationele brug voor het evalueren van de engraftment van NPC's, het immunomodulerende potentieel en de target-interactie in preklinische modellen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar het pathotropisme en homing van NPC's naar inflammatoire CNS-laesies via intraveneuze toediening mogelijk.
- Operationele waarde: Ondersteunt de functionele validatie van NPC-gemedieerde immunomodulatie en weefseltrofe effecten in vivo.
- Voorspellende waarde: Faciliteert de beoordeling van target engagement en biologische activiteit in een ziekterelevant EAE-model.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare biodistributiegegevens via immunohistochemie en reportergen-tracking.
- Operationele waarde: Stelt reproduceerbare protocollen vast voor de preparatie en dissociatie van NPC's voor de toediening van enkelcellige suspensies.
- Klaarheid voor assay: Maakt gestandaardiseerde evaluatie mogelijk van celoverleving, integratie en lineage-differentiatie na transplantatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Modelleert systemische NPC-toediening bij chronische inflammatoire demyelinisatie, relevant voor therapeutica tegen MS.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt NPC-interacties met gastheercellen via oppervlakte-adhesiemoleculen (bijv. CD44, VLA-4 alpha subunit) in vivo.
- Continuïteit van de pijplijn: Ondersteunt risicogecorrigeerde voortgang door het definiëren van het NPC-gedrag in inflammatoire omgevingen over een periode van 45 dagen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze workflow past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische evaluatie, in het bijzonder voor immunomodulerende celtherapieën bij neuro-inflammatoire ziekten.
- Discovery Biology: Test NPC-homingmechanismen en paracriene signalering in een gedissemineerd inflammatoir CZS-model.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, blaasjesvrije NPC-suspensies die geschikt zijn voor intraveneuze toediening en tracking.
- Analytics: Maakt kwantitatieve beoordeling van NPC-distributie, overleving en multilineage-differentiatie mogelijk via postmortale histologie en immunofluorescentie.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt NPC-toediening met immunomodulerende uitkomsten in een model met temporele en spatiale laesiedisseminatie.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een herbruikbaar platform voor het evalueren van diverse NPC-lijnen of genetische modificaties in EAE en aanverwante modellen.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in de werkingswijze van NPC's door perivasculaire accumulatie en immuunregulatie in vivo aan te tonen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde procedures voor neurosfeer-dissociatie, celtelling en injectie via de staartвена.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door de veiligheid, biodistributie en doelwitmodulatie van NPC's te valideren in een klinisch relevant model.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicostratificatie en prioritering van NPC-kandidaten op basis van CNS-engraftment en fenotypische stabiliteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in dissectie van neuraal weefsel, neurosfere-cultuur en virale transductie voor reportergen-labeling.
- Afhankelijk van steriele chirurgische technieken, precisie bij intraveneuze injectie en weefselverwerking na transplantatie voor histologie.
- Vereist standaardisatie tussen laboratoria voor dissociatie, concentratie en injectievolume van NPC's om reproduceerbaarheid te waarborgen.
- Er moet rekening worden gehouden met variabiliteit in de timing en ernst van de EAE-ziekte bij het afstemmen van de injectie op de piek van de klinische symptomen.
- Beperkt door de noodzaak van postmortale analyse om de biodistributie te beoordelen, waardoor longitudinale in vivo imaging zonder aanvullende labelingstrategieën is uitgesloten.
