Systemische Injectie van neurale stamcellen / progenitorcellen in Muizen met chronische EAE
April 15th, 2014
De transplantatie van neurale stamcellen / progenitorcellen (NPC) houdt grote beloften in de regeneratieve neurologie. De systemische toediening van NPCs is in efficiënte, lage invasief en therapeutisch zeer effectief protocol om stamcellen te leveren in de hersenen en ruggenmerg van knaagdieren en niet-menselijke primaten die door experimentele chronische inflammatoire schade aan het centrale zenuwstelsel.
Het algemene doel van dit protocol is om neurale stamcellen via intraveneuze injectie te leveren aan het centrale zenuwstelsel bij muizen die zijn aangetast door experimentele auto-immuun encefalitis, een ziektemodel dat multiple sclerose nabootst. Dit wordt bereikt door eerst neurale stamcellen, of NPCs, af te leiden uit de subventriculaire zone van de hersenen van volwassen muizen. De tweede stap is om NPCs genetisch te markeren met virale vectortechnologie voor in vivo celidentificatie en -tracking.
Vervolgens worden prolifereren neurosferen gedissocieerd in een enkele cel suspensie, opnieuw opgeschort bij de gewenste dichtheid en geïnjecteerd in de staarvan van EAE muizen op het hoogtepunt van de ziekte. Uiteindelijk worden postmortem orgaan en weefsel pathologie en immunohistochemie uitgevoerd om de overleving, verdeling en integratie van geïnjecteerde stamcellen te identificeren en te karakteriseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een minimaal invasieve, veilige en effectieve methode biedt om stam- en voorlopercellen in het ontstoken zenuwstelsel te transplanteren.
Deze methode helpt bij het beantwoorden van drie belangrijke vragen met betrekking tot de veiligheid en werkzaamheid van systemisch geïnjecteerde stamcellen in modellen van inflammatoire ziekten van het zenuwstelsel. De visuele demonstratie van deze methode is vooral nuttig voor jonge wetenschappers omdat het helpt bij het begrijpen van kritieke experimentele stappen van hersenstamboceleisolatie tot voorbereiding voor systemische injectie in een muismodel voor multiple sclerose. De eerste stap is om alle oplossingen die nodig zijn voor dissectie bij elkaar te verzamelen. Gebruik de juiste steriele techniek.
Plaats een vers geïsoleerde hersenen op een hersenslicer matrix. Gebruik twee scheermessen om coronale secties te maken, twee millimeter van de voorste pool van de hersenen, met uitzondering van de optische banen en drie millimeter achter de vorige snede. Plaats de hersenslices op een schone petrischaal en werk onder een dissectiemicroscoop om het subventriculaire zone weefsel te isoleren.
Na het fijnsnijden van het weefsel, voeg het toe aan 30 milliliter van eerder bereide en gefilterde spijsverteringsoplossing. Schud voorzichtig en incubeer gedurende 30 minuten met elke 15 minuten schudden. Na centrifugatie, verwijder de supernatant en suspendeer de pellet in 200 microliters van complete groei.
Medium of CGM door pipetten. Eerst met een P 1000, en vervolgens met een P 200 pipette. Zodra een enkele cel suspensie is bereikt, breng het op vijf milliliter met CGM en breng over naar een nieuwe fles.
Plaats de cellen in een incubator en laat neurosferen gedurende vijf tot zeven dagen vormen. Wanneer klaar, verzamel de suspensie in een 15 milliliter buis en centrifugeer. Verwijder de supernatant en suspendeer de palate in 200 microliters van CGM.
Dissocieer de neurosferen mechanisch door ze 100 tot 150 keer door een P 200 pipettentip te laten passeren. Breng de suspensie op een milliliter met CGM. Verdun vervolgens de suspensie nauwkeurig.
Meng het juiste volume met een vitale kleurstof en vul een hemo cytometer om het aantal cellen te bepalen. Suspendeer de cellen opnieuw in de juiste concentratie en breng over naar een nieuwe fles. Herhaal deze stappen elke vier tot vijf dagen om de identificatie van getransplanteerde cellen in vivo te helpen.
NPC's worden 72 uur na NPC transductie getransduceerd met virale vectoren die coderen voor reporter genen. De expressie van fluorescerende reporter genen is verifieerbaar door middel van immunofluorescentie of flowcytometrie. Wanneer klaar, oogst de GFP expresserende neurosferen door centrifugatie en verwijder de supernatant.
Voeg vervolgens 200 microliters van cel aggregaat dissociatie oplossing toe en incubeer gedurende 10 minuten. Haal de cellen en suspendeer ze voorzichtig opnieuw om een enkele cel suspensie te verkrijgen. Zorg ervoor dat luchtbellen worden vermeden.
Na het tellen en verdunnen van de cellen, bewaar de celsuspensie op ijs tot het klaar is om te worden gebruikt. Zodra de neurosferen klaar zijn, haal de muizen die eerder waren voorbereid om als muismodel voor CNS te dienen. Schadebehandeling dient plaats te vinden op het hoogtepunt van de ziekteexpressie.
Begin door de muizen ongeveer 10 minuten in een verwarmingsbox te plaatsen om de staarvan te laten verwijden. Wanneer klaar, breng een muis over van de verwarmingsbox naar een muisbegrenzer. Sluit de begrenzer om beweging te beperken en isoleer de staar.
Steriliseer het injectiegebied op de staar met een geschikte topische oplossing. Vul een insuline spuit van één milliliter met 150 microliters cel suspensie en zorg ervoor dat alle bubbels worden verwijderd. Lokaliseer de ader op het dorsale oppervlak van de staar en plaats de naald parallel aan de ader in het midden van de onderste helft van de staar.
Hier is de ader dichter bij het huidoppervlak. Dit vergemakkelijkt dus de procedure. Breng de naald voorzichtig in de ader en zorg ervoor dat deze op de juiste positie staat door een paar microliters bloed terug te trekken.
Injecteer vervolgens langzaam de oplossing in de staarvan Na de injectie, verwijder de naald en oefen een paar seconden druk uit om de bloeding te vertragen. Plaats de muis in een schone kooi en controleer tot herstel. Herhaal dezelfde procedure voor alle muizen op vooraf bepaalde experimentele tijdstippen.
Steekproeven worden genomen van behandelde en controledieren en geanalyseerd om infiltratie en integratie van NPC's in het centrale zenuwstelsel en andere weefsels te bepalen wanneer ze als neurosferen prolifereren. NPC's die worden geplaat onder geschikte differentiatiecondities, expresseren markeren van mitotische activiteit zoals fosfo hison H drie getoond in groen en van ongedifferentieerde neurale cellen zoals nest in getoond in rood. NPC's expresseren markeren typisch voor de drie neurale lijnen zoals de astroglia marker, GFAP, de neuronale marker, micro tubulaire geassocieerde eiwit twee, en de oligo dyl gliale markers O vier en myeline basiseiwit kernen worden tegengekleurd met dpi ongedifferentieerde MPC's die therapeutisch effectief moeten zijn na transplantatie moeten celoppervlakte adhesiemoleculen uitdrukken die CD 44 en de alfa vier subeenheid
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de levering van neurale stamvoorlopercellen (NPC's) naar het centrale zenuwstelsel (CZS) via intraveneuze injectie bij muizen met experimentele auto-immuun encefalomyelitis, een model voor multiple sclerose. De methode benadrukt een minimaal invasieve aanpak voor effectieve stamceltransplantatie.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Regeneratieve geneeskunde
- Celtherapie
Achtergrond
- Neurale stam/voorlopercellen (NPC's) hebben potentieel in regeneratieve neurologie.
- Systemische levering van NPC's is een laag-invasieve en effectieve therapeutische protocol.
- Deze studie gebruikt een model dat multiple sclerose nabootst om NPC-levering te evalueren.
- Genetische tagging van NPC's maakt tracking en identificatie na transplantatie mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het leveren van NPC's aan het CZS via intraveneuze injectie.
- Om de overleving en integratie van getransplanteerde NPC's in een inflammatoire omgeving te beoordelen.
- Om een veilig en effectief protocol voor stamceltransplantatie te bieden.
Gebruikte methoden
- Afleiding van NPC's uit de subventriculaire zone van volwassen muizen.
- Genetische tagging van NPC's met behulp van virale vectortechnologie.
- Dissociatie van prolifererende neurosferen in een enkele celsuspensie.
- Intraveneuze injectie van NPC's in EAE-muizen op het hoogtepunt van de ziekte.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle levering van NPC's aan het CZS via intraveneuze injectie.
- Karakterisering van NPC-overleving en distributie in postmortem-analyse.
- Demonstratie van de effectiviteit van de minimaal invasieve transplantatiemethode.
- Inzichten in de integratie van NPC's in een inflammatoir zenuwstelsel.
Conclusies
- Het protocol biedt een haalbare aanpak voor NPC-transplantatie in CZS-ziekten.
- Minimaal invasieve technieken kunnen de veiligheid en effectiviteit van stamceltherapieën verbeteren.
- Verdere studies kunnen het therapeutische potentieel van NPC's in neuro-inflammatoire aandoeningen uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Systemic delivery of neural stem/progenitor cells (NPCs) offers a minimally invasive approach to target inflammatory lesions in the central nervous system, addressing a key challenge in regenerative neurology for multifocal diseases like multiple sclerosis. This method enables biodistribution to perivascular sites of damage, supporting mechanistic de-risking of cell therapies in neuroinflammatory conditions. It provides a translational bridge for evaluating NPC engraftment, immunomodulatory potential, and target engagement in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of NPC pathotropism and homing to inflammatory CNS lesions via intravenous delivery.
- Operational Value: Supports functional validation of NPC-mediated immunomodulation and tissue trophic effects in vivo.
- Predictive Value: Facilitates assessment of target engagement and biological activity in a disease-relevant EAE model.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable biodistribution data through immunohistochemistry and reporter gene tracking.
- Operational Value: Establishes reproducible NPC preparation and dissociation protocols for single-cell suspension delivery.
- Assay Readiness: Enables standardized evaluation of cell survival, integration, and lineage differentiation post-transplantation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Models systemic NPC delivery in chronic inflammatory demyelination, relevant to MS therapeutics.
- Mechanistic De-risking: Clarifies NPC interactions with host cells via surface adhesion molecules (e.g., CD44, VLA-4 alpha subunit) in vivo.
- Pipeline Continuity: Supports risk-adjusted advancement by defining NPC behavior in inflammatory environments over 45 days.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for immunomodulatory cell therapies in neuroinflammatory diseases.
- Discovery Biology: Tests NPC homing mechanisms and paracrine signaling in a disseminated inflammatory CNS model.
- Screening: Delivers standardized, vesicle-free NPC suspensions suitable for intravenous administration and tracking.
- Analytics: Enables quantitative assessment of NPC distribution, survival, and multilineage differentiation via postmortem histology and immunofluorescence.
- Translational Research: Links NPC delivery to immunomodulatory outcomes in a model with temporal and spatial lesion dissemination.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable platform for evaluating diverse NPC lines or genetic modifications in EAE and related models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in NPC mode of action by demonstrating perivascular accumulation and immune regulation in vivo.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized neurosphere dissociation, cell counting, and tail vein injection procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating NPC safety, biodistribution, and target modulation in a clinically relevant model.
- Portfolio Impact: Supports risk-stratified prioritization of NPC candidates based on CNS engraftment and phenotypic stability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue dissection, neurosphere culture, and viral transduction for reporter gene labeling.
- Dependent on sterile surgical techniques, intravenous injection precision, and post-transplantation tissue processing for histology.
- Necessitates standardization across laboratories for NPC dissociation, concentration, and injection volume to ensure reproducibility.
- Must account for variability in EAE disease timing and severity when aligning injection with peak clinical symptoms.
- Limited by the need for postmortem analysis to assess biodistribution, precluding longitudinal in vivo imaging without additional labeling strategies.
