Een gemodificeerde precipitatiewerkwijze isoleren Urinary exosomes
16 januari 2015
Dit manuscript beschrijft een protocol voor het isoleren van exosomen uit menselijke urine met behulp van een gemodificeerde precipitatietechniek.
Het algemene doel van deze procedure is om een aangepaste exosoom precipitatiemethode te ontwerpen die een snelle, schaalbare en effectieve alternatief biedt voor de isolatie van exosomen uit urine. Dit wordt bereikt door eerst grote dode cellen en celafval uit het urinemonster te verwijderen door centrifugatie, en de snavel met de urinere exosomen wordt overgebracht naar een nieuwe buis. In de tweede stap wordt de pellet opgelost in isolatieoplossing die DTT bevat om het TAM-paardenval-eiwit te verwijderen.
Vervolgens wordt na verdere centrifugatie het TP-vrije supernatant overnacht met exo quick TC-reagens geïncubeerd om de exosomen de volgende dag te precipiteren. De met exo quick TC-reagens behandelde monsters worden nog een laatste keer gecentrifugeerd om het exosome-pellet te verkrijgen. Uiteindelijk kunnen downstream-processen zoals Western blot en realtime QPCR op de exosomen worden uitgevoerd om de biomarkers van belang te identificeren.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals ultra centrifugatiefiltratie en precipitatie is dat de arm-methode geen ultra-certificeringsstappen vereist, relatief eenvoudig uit te voeren is, en snel is, terwijl het nog steeds een hoog, relatief puur exosome-opbrengst levert voor verdere moleculaire analyse. Vóór de urineverzameling. Bij 3,125 milliliter vers bereide proteaseremmercocktail in een lege steriele opvangbak en verzamel vervolgens ongeveer 10 milliliter van de eerste void-urine in de opvangbak. Breng het monster over in 15 milliliter kegelbuizen.
Let op, een 24-uurs urinemonster dat is verzameld, kan ook worden gebruikt voor exosome-isolatie door het te bewaren bij vier graden Celsius. Draai de buizen gedurende 10 minuten bij 17.000 GS en 37 graden Celsius om cellulair afval uit urinaire exosomen te verwijderen of te scheiden. Neem vervolgens, zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort, het supernatant over naar een nieuwe buis en suspendeer de pellet in 500 microliter isolatieoplossing.
Incubeer de pellet met DTT bij een uiteindelijke concentratie van 200 milligram per milliliter bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Vortex het monster elke twee minuten. Wanneer de pellet volledig is opgelost, voeg dan 500 microliter isolatieoplossing toe aan het monster en centrifugeer de resulterende suspensie onmiddellijk.
Combineer het supernatant met het eerder verzamelde supernatant en suspendeer de nieuwe pellet in 50 microliter isolatieoplossing. Voor SDS-pagina-analyse om de exosomen te isoleren, incubeer eerst 11 milliliter van het gepoolde supernatant met 3,3 milliliter exo quick TC-reagens bij vier graden Celsius gedurende minimaal 12 uur. Na de incubatie centrifugeer het monster, breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis voor SDS-pagina-analyse en het pellet dat de urinaire exosomen bevat, wordt gebruikt om D-N-A-R-N-A of eiwit te extraheren, of bewaard bij min 80 graden Celsius.
Gebruik een NanoDrop-spectrofotometer om de concentraties DNA en RNA van elke extractie te bepalen door de absorptie bij 260 en 280 nanometer te meten met twee microliter monster hier. Een gemodificeerde reproductie van een SDS-pagina-analyse en biomarkerdetectie met behulp van westerse bloedanalyse wordt getoond in de banen met onbewerkte urine en de eerste urinaire pellet-eiwitbanen die overeenkomen met 90 tot 100 kilodalton, werden waargenomen, wat duidt op de aanwezigheid en de verwijdering van het TAM-paardenval-eiwit respectievelijk in de laatste supernatant en exosome-pelletbanen. De TAM-paardenval-eiwitband werd niet waargenomen, wat duidt op een verwijdering van het TAM-paardenval-eiwit in de eerdere stappen en resulteert in een verhoogde exosome-pellet-opbrengst.
In dit experiment werden biomarkers Alex en TSG 1 0 1 gedetecteerd, zelfs wanneer lage hoeveelheden monster werden gebruikt, wat wijst op een zeer zuiver exosome-pellet voor biomarkeranalyse en een afwezigheid van overvloedige oplosbare eiwitten, inclusief het TAM-paardenval-eiwit Na zijn ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van chronische nierziekte om urine-geïsoleerde exosomen te gebruiken voor de vroege detectie en diagnose van diabetische nefropathie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een protocol voor het isoleren van exosomen uit menselijke urine met behulp van een aangepaste precipitatietechniek. De methode beoogt een snel, schaalbaar en effectief alternatief te bieden voor de isolatie van exosomen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Exosoomonderzoek
Achtergrond
- Exosomen zijn kleine extracellulaire blaasjes die betrokken zijn bij intercellulaire communicatie.
- Het isoleren van exosomen uit urine kan inzicht bieden in diverse biologische processen.
- Huidige methoden kunnen tijdrovend en minder efficiënt zijn.
- Een gemodificeerde precipitatietechniek zou het herstel van exosomen kunnen verbeteren.
Doel van de studie
- Om een snelle methode te ontwikkelen voor de isolatie van exosomen uit urine.
- Om de schaalbaarheid en effectiviteit van de extractie van exosomen te verbeteren.
- Om downstream-toepassingen, zoals de identificatie van biomarkers, te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Centrifugatie om grote cellen en debris uit urine monsters te verwijderen.
- Oplossen van het pellet in isolatie-oplossing met DTT.
- Overnacht incuberen van het supernatant met exo quick TC-reagens.
- Finale centrifugatie om het exosoompellet te verkrijgen.
Belangrijkste resultaten
- De aangepaste methode isoleert met succes exosomen uit urine.
- Exosomen kunnen worden gebruikt voor downstream-analyses zoals Western blot en qPCR.
- Efficiënte verwijdering van contaminanten verhoogt de zuiverheid van de geïsoleerde exosomen.
- Het protocol is schaalbaar voor grotere monstergroottes.
Conclusies
- De gemodificeerde precipitatietechniek is een levensvatbare methode voor de isolatie van exosomen.
- Deze aanpak kan het onderzoek naar exosomen in diverse biologische studies stroomlijnen.
- Toekomstige studies kunnen aanvullende toepassingen van geïsoleerde exosomen onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Het isoleren van urinaire exosomen maakt niet-invasieve biomarker-ontdekking voor nierziekten mogelijk, wat vroege detectie en mechanische risicoreductie bij de ontwikkeling van renale therapieën ondersteunt. De gemodificeerde precipitatiemethode biedt een schaalbaar, hoogrendement alternatief voor ultracentrifugatie, waardoor de reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid voor workflows voor target-validatie worden verbeterd. Deze benadering verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid bij de identificatie van biomarkers door contaminatie te verminderen en de zuiverheid van exosomen voor downstream moleculaire profilering te vergroten.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door exosomen te isoleren die de celtype-specifieke lading van nefronsegmenten reflecteren.
- Operationele waarde: Biedt een snelle, schaalbare methode voor het isoleren van exosomen zonder ultracentrifugatie, waardoor de technische variabiliteit wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van biomarkerdetectie door exosomenpellets van hoge zuiverheid op te leveren die verrijkt zijn met miRNA en mRNA voor profilering.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde exosoommonsters voor voor downstream-analyses, zoals Western blot en qPCR, om ziekte-geassocieerde biomarkers te detecteren.
- Operationele waarde: Standardiseert de isolatie van exosomen via een workflow op basis van precipitatie die compatibel is met high-throughput monsterverwerking.
- Klaar voor analyse: Genereert consistente exosoomopbrengsten die geschikt zijn voor RNA-extractie en eiwitanalyse, wat reproduceerbare biomarker-screening ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt de progressie van biomarker-ontdekking in urine naar preklinische validatie door ziekterelevante exosoomvracht te leveren.
- Mechanische risicoreductie: Maakt detectie van gewijzigde exosoominhoud bij renale dysfunctie mogelijk, waardoor pathofysiologische routes worden verduidelijkt.
- Predictieve betrouwbaarheid: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door exosoombiomarkers te koppelen aan vroege tekenen van diabetische nefropathie.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, wat niet-invasieve isolatie van biomarkers mogelijk maakt die de doelwitselectie en preklinische continuïteit ondersteunen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door exosomen te isoleren die de cel-origine-specifieke cargo van cellen uit de urinewegen weerspiegelen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve exosome-outputs die geschikt zijn voor de ontwikkeling van biomarker-assays en compound-screening.
- Analytics: Maakt meting van exosome-geassocieerde RNA- en proteineniveaus mogelijk via qPCR en Western blot voor comparatieve conditieanalyse.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt urinaire exosome-biomarkers met preklinische modellen van nierziekten via detectie van ziekterelevante cargo.
- Enterprise Reuse: Vestigt een schaalbaar, gestandaardiseerd isolatieplatform dat toepasbaar is op meerdere typen urine-monsters en onderzoeksprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert de validatie van targets door mechanische ambiguïteit te verminderen via zuivere exosoomisolatie voor biomarker-profilering.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid door ultracentrifugatiestappen te elimineren en de workflow te vereenvoudigen.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen door het vertrouwen in vroege biomarkerdetectie voor nierziekten te vergroten.
- Portfolio-impact: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van renale therapeutische kandidaten mogelijk op basis van robuuste exosoom-biomarkergegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in exosoombiologie en moleculaire technieken zoals RNA-extractie en qPCR.
- Toegang tot centrifugatieapparatuur, ExoQuick TC-reagens en spectrophotometrische instrumenten voor RNA/DNA-kwantificatie is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist om consistente incubatietijden, temperaturen en de behandeling van reagentia te garanderen.
- Aanpassingen moeten worden overwogen bij het toepassen van de methode op verschillende urinecollectieprotocollen of opslagcondities.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van incubatie gedurende de nacht en zorgvuldige hantering om verlies van exosomen tijdens overdrachten te voorkomen.
