Name: Een gemodificeerde precipitatiewerkwijze isoleren Urinary exosomes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Leer een gemodificeerde precipitatiewerkwijze om exosomen uit urine te isoleren met centrifugatie en ExoQuick TC reagens. Deze schaalbare methode levert zuivere exosomen op voor Western blot en qPCR analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn de Roney Family Foundation dankbaar voor de ondersteuning van dit onderzoek. We erkennen de bijdrage van Dr. M. Lucrecia Alvarez aan het plannen en uitvoeren van de experimenten die in dit werk worden beschreven.

Opmerking. De stappen die betrokken zijn bij de isolatie van de urine exosomes met de gemodificeerde precipitatie werkwijze worden geïllustreerd in de Figuur 1 De eerste stappen omvatten het verwijderen van grote dode cellen en celresten door centrifugatie. De uiteindelijke pellet verkregen uit de vanuit elke volgende stap supernatant overeen met de exosoom, dat wordt opgelost in isolatieoplossing voor verdere extractie van eiwitten, RNA en DNA. 1. Het verzamelen van urine <ol><li> Vóór urine inzameling bereiden proteaseremmer cocktail volgens de instructies van de fabrikant en voeg 3.125 ml van deze cocktail een lege steriele houder. De buis met de proteaseremmer cocktail kan vervolgens worden gedistribueerd naar vrijwilligers voor urine collectie. OPMERKING: De reden voor het toevoegen proteaseremmer om eiwitafbraak te beperken in het urinemonster. Hoewel we specifiek gebruikt een proteaseremmer cocktail vanSigma, kunnen andere commercieel verkrijgbare proteaseremmers worden vervangen. </li><li> Verzamel ongeveer 10 ml van de eerste leegte urine. Verwerk de urine onmiddellijk na monstername zonder opslag of koeling. Isoleer de urine exosomes in duplo met de gemodificeerde precipitatie methode; één van de duplo voor DNA, totaal RNA en eiwit-extractie, terwijl de andere is voor het kwantificeren van urine exosome deeltjes. OPMERKING: Een 24 uur urine kan worden verzameld voor exosome isolatie door opslag bij 4 ° C. </li></ol> 2. Verwijdering van de Cel Debris en Tamm-Horsfall Protein (THP) <ol><li> Transfer urinemonsters 15 ml centrifugebuizen. Centrifugeer 10 ml urine bij 17.000 xg gedurende 10 min bij 37 ° C om cellen en celresten (figuur 1) te elimineren. </li><li> Met behulp van een pipet het supernatant naar een nieuwe buis voor verdere verwerking. Resuspendeer de pellet in 500 ui van isolatie-oplossing (250 mM sucrose, 10 mM beproeftanolamine, pH 7,6) gevolgd door 10 min incubatie met DL-dithiothreitol (DTT: eindconcentratie van 200 mg / ml) bij 37 ° C. OPMERKING: DTT toegevoegd aan THP die exosomes opsluit afbreken, wat leidt tot verminderde opbrengsten. Zorg ervoor dat de pellet ongestoord tijdens de overdracht van het supernatant te verlaten, en bevestigen dat het bovenstaande is duidelijk van pellet. </li><li> Vortex pellet samples elke 2 min totdat de pellet volledig is opgelost. Voeg vervolgens 500 ul van isolatie oplossing van de opgeloste pellet. </li><li> Onmiddellijk na de toevoeging van isolatie oplossing van de pellet gecentrifugeerd bij 17.000 xg gedurende 10 min bij 37 ° C. Pipetteer het supernatant en combineer met eerder verzamelde supernatant. </li><li> Resuspendeer de pellet in 50 ul van isolatie oplossing voor SDS-PAGE-analyse. OPMERKING: PBS of TBS kan worden gebruikt in plaats van isolatie oplossing van het pellet te resuspenderen. </li></ol> 3. Isolatie van exosome Pellet <ol><li> Tot 11 ml van de verzamelde supernatant, voeg 3,3 ml ExoQuick-TC reagens en incuberen bij 4 ° C gedurende ten minste 12 uur. OPMERKING: De verhouding van het volume supernatant aan ExoQuick-TC reagens kan worden aangepast aan verhogen of exosomaal opbrengst verlagen. We zagen dat mindere hoeveelheden toegevoegd reagens van kleinere opbrengsten van exosomen. </li><li> Na incubatie gecentrifugeerd sample / ExoQuick-TC mengsel bij 10.000 xg gedurende 30 min bij 25 ° C. </li><li> Breng het supernatant naar een nieuwe buis voor SDS-PAGE-analyse. </li><li> De exosome pellet kan worden opgeslagen bij -80 ° C voor DNA, RNA en eiwit-extractie en kwantificering van exosome deeltjes met CD9 ELISA 11. OPMERKING: De exosome pellet kan worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende 1 jaar met beperkte bevriezen en ontdooien. </li></ol> 4. Biomarker detectie en analyse van exosome Pellet <ol><li> Voor stroomafwaartse analyses extract DNA, RNA en eiwit van de exosoom pellet met de DNA / RNA / eiwit isolatie kit en een RNA isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant. Bepaal concentraties met een Nanodrop spectrofotometer door het meten van absorptie bij 260 en 280 nm met 2 pl monster. </li><li> Uitvoeren van kwantitatieve real-time RT-PCR (qPCR) met behulp van TaqMan microRNA assays (in ons geval, gebruikten we de menselijke miR-192- en miR-1207-5p-specifieke assays) of miRNA-specifieke primers. </li><li> Voor SDS-PAGE-analyse, gebruik 4-12% Bis-Tris gel en gescheiden eiwitmonsters door ééndimensionale elektroforese. Visualiseren gels met de zilverkleuring kit volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Voer western blot analyse met PVDF membranen volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik konijn polyklonale antilichaam tegen apoptose-gebonden gen-2 interactie eiwit X of ALIX en muis monoklonaal antilichaam tegen tumor gevoeligheid gen 101 eiwit of Tsg101 in de western blot detectie. Kwantificeren van de dichtheid van de bands door open toegang NIH ImageJ software (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ofeen soortgelijk programma. </li><li> Kwantificeren het aantal urine exosome deeltjes verkregen met een CD9 ELISA kit volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol>

<ol><li>Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acids+within+urinary+exosomes%2Fmicrovesicles+are+potential+biomarkers+for+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease.</a> Kidney Int. 78, 191-199 (2010).</li>
<li>Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).</li>
<li>Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+quantitative+proteomics+strategy+for+protein+biomarker+studies+in+urinary+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes.</a> Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).</li>
<li>Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+systems+biology+principles+to+protein+biomarker+discovery%3A+urinary+exosomal+proteome+in+renal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation.</a> Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).</li>
<li>Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+exosomes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of exosomes in urine.</a> Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).</li>
<li>Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+storage%2C+preservation%2C+and+normalization+of+human+urinary+exosomes+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery.</a> Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Prot+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).</li>
<li>Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).</li>
<li>Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+proteomics+and+phosphoproteomics+of+urinary+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes.</a> J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).</li>
<li>Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methods+for+isolation+of+urinary+microvesicles+to+identify+biomarkers+of+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.</a> Kidney Int. 78, 810-816 (2010).</li>
<li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein%2C+microRNA%2C+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int.+Nov%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li>
<li>Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+association+of+-667+aquaporin-2+%28AQP-2%29+A%2FG+promoter+polymorphism+with+the+incidence+and+clinical+course+of+chronic+kidney+disease+in+Korea%5BTitle%5D)+AND+%22Renal+Fail%22%5BJournal%5D)">Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea.</a> Renal Fail. 29, 693-698 (2007).</li>
</ol>

Publicatie vergoedingen voor dit artikel werden betaald door SBI Biosciences.

De meeste methoden waarbij het neerslaan van exosomen uit urine niet te pakken verwijdering van de polymere netwerk gevormd door Tamm-Horsfall eiwit (THP). Dit eiwit is aanwezig in grote hoeveelheden in urine, waar het vermoedelijk vallen exosomes tijdens de eerste lage snelheid centrifugatie. In het gewijzigde methode gereduceerd we THP middels DTT vóór exosome precipitatie. Zoals getoond in figuur 2, werd een grotere hoeveelheid THP waargenomen in ongewijzigde urine en pellet, zonder THP in het uitein...

Urine exosomen zijn kleine interne blaasjes van 100 nm van multivesiculaire lichaampjes (MVB), afkomstig van alle soorten cellen onder normale en pathologische omstandigheden in de urine ruimte, met inbegrip van de glomerulaire podocytes, niertubuli-cellen en epitheelcellen van de urine drainagesystemen die lijken te worden verrijkt voor miRNAs 1 -2. Veel onderzoekers hebben verschillende eiwitten aangetroffen in exosomen geïsoleerd uit urine van gezonde individuen evenals die met nier- en / of systematische ziekten 3-5. Exosomes kan worden geïsoleerd met behulp van verschillende methoden zoals tweestaps differentiële ultracentrifugatie met of zonder sucrose 6-7 combineert nanomembrane filter met ultracentrifugatie 09/08, 11/10 of precipitatie. Recent hebben wij een eenvoudige, snelle, schaalbare en effectieve methode om urine exosomen te isoleren en op te sporen miRNA en eiwit biomarkers 11. Hoewel biomarkers kan worden gedetecteerd in verschillende biologische vloeistoffen, urine is de meest geschikte keuze voor patiënten met nier- en urinewegen omdat het kan worden verkregen in grote hoeveelheden in een relatief niet-invasieve wijze. Hoewel er verschillende manieren om urine exosomes isoleren 6-11, de meest gebruikte procedure is gebaseerd op differentiële ultracentrifugatie met een 30% sucrose kussen. Hoewel deze methode is efficiënt en de kwaliteit van de resulterende exosomes geïsoleerd met deze werkwijze is hoog, de techniek zelf vereist geschoold personeel en is tijdrovend en vereist verscheidene stappen ultracentrifugatie. Andere werkwijzen, zoals filtratie en precipitatie, zijn ontwikkeld voor de isolatie van exosomes, waaronder een die een eigen precipitatiereagens gebruikt (dwz ExoQuick-TC: System Biosciences, Mountain View, CA). Hoewel precipitatie met dit reagens snel en relatief eenvoudig, de zuiverheid van de geïsoleerde exosomes is laag in vergelijking met de ultracentrifugatie method. We hebben onlangs vergeleken zes voor de isolering van urine exosomes, waaronder een modificatie van de precipitatie methode met ExoQuick-TC dat we in ons laboratorium ontwikkeld 11. We vonden dat deze gewijzigde neerslag methode leverde hogere hoeveelheden eiwit, miRNA, en mRNA&#39;s en de procedure zelf sneller en eenvoudiger te implementeren dan ultracentrifugering was. Hier beschrijven we de experimentele protocol van onze gewijzigde neerslag methode stapsgewijs, en onder meer een bespreking van de voor- en nadelen van deze techniek in vergelijking met andere methoden van exosome isolement. De gemodificeerde precipitatie werkwijze omvat een initiële precipitatie van exosome deeltjes, gevolgd door verwijdering van Tamm-Horsfall eiwit, dat wordt gecorreleerd met exosomaal eiwitten en bekende exosome opbrengst van urine te verminderen. We vonden dat deze wijzigingen verhoogde de opbrengst en zuiverheid van de exosomaal preparaat uit urine.

<table><tbody><tr><td>Corning 15 ml Centrifuge Tube</td><td>Corning (Sigma Aldrich)</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9779</td><td>gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 200 mg/ml</td></tr><tr><td>Novex NuPAGE SDS-PAGE systeem (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td>Voor SDS-PAGE analyse</td></tr><tr><td>ECL Advance Western blotting detectiekit</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2135</td><td>Voor western blot detectie van biomarkers</td></tr><tr><td>Exoquick-TC Reagens</td><td>System Biosciences (SBI)</td><td>EXOTC50A-1</td><td>Voor exosome isolatie</td></tr><tr><td>Exosome CD9 ELISA Complete Kit</td><td>System Biosciences (SBI)</td><td>EXOEL-CD9-A-1</td><td>Voor exosome kwantificering</td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit</td><td>Qiagen</td><td>80004</td><td>Voor DNA, RNA, Eiwit isolatie</td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Voor Eiwit Kwantificering</td></tr><tr><td>ProteoSilver Zilver Stain Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PROTSIL1-1KT</td><td>Voor het kleuren van SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell Elektroforese Systeem</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Voor het uitvoeren van de SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA assays</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Voor RT-PCR assays</td></tr><tr><td>qBasePlus v1.5 software</td><td>Biogazelle NV</td><td></td><td>Voor analyse van RT-PCR assay data</td></tr><tr><td>Konijn polyklonaal antilichaam tegen ALIX</td><td>Millipore</td><td></td><td>Voor western blot detectie van biomarkers</td></tr><tr><td>Muis monoklonaal antilichaam tegen TSG101</td><td>Abcam</td><td></td><td>Voor western blot detectie van biomarkers</td></tr></tbody></table>

een gemodificeerde precipitatiewerkwijze isoleren urinary exosomes

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

De identificatie van biomarkers die een vroege detectie van nierziekten in urine en plasma mogelijk maken, is al enkele jaren een gebied van actief belang. Urinaire exosome vesicles, 40-100 nm groot, worden onder normale omstandigheden vrijgegeven in de urine door cellen uit alle nefronsegmenten en kunnen eiwitten, mRNA en microRNA bevatten die representatief zijn voor hun celtype van herkomst. Onder omstandigheden van nierdisfunctie of -letsel kunnen exosomen veranderde verhoudingen van deze componenten bevatten, die kunnen dienen als biomarkers voor ziekten. Er zijn momenteel verschillende methoden beschikbaar voor het isoleren van urinaire exosomen en we hebben eerder een experimentele vergelijking van elk van deze benaderingen uitgevoerd, waaronder drie gebaseerd op ultracentrifugeren, een met behulp van een nanomembraan ultrafiltratie concentrator, een met behulp van een commercieel precipitatie reagens en een met behulp van een modificatie van de precipitatietechniek met behulp van ExoQuick reagens dat we in ons laboratorium hebben ontwikkeld. We ontdekten dat de gemodificeerde precipitatiemethode de hoogste opbrengst aan exosomedeeltjes, miRNA en mRNA produceerde, waardoor deze aanpak geschikt is voor het isoleren van exosomen voor daaropvolgend RNA-profilering. We concluderen dat de gemodificeerde exosome precipitatiemethode een snelle, schaalbare en effectieve alternatief biedt voor het isoleren van exosomen uit urine. In dit rapport beschrijven we onze gemodificeerde precipitatietechniek met behulp van ExoQuick reagens voor het isoleren van exosomen uit menselijke urine.

Urine exosomen dragen eiwit, miRNA en mRNA biomarkers afgescheiden van renale epitheelcellen. De isolatie en detectie van deze exosomes kan een nuttig diagnostisch hulpmiddel voor vroege detectie van nier- ziekten zoals diabetische nefropathie. Er zijn verschillende methoden voor de isolatie van exosomen van urinemonsters verzameld van menselijke proefpersonen. We hebben eerder dan zes werkwijzen urine exosome isolatie en onderzocht resulterende eiwit, mRNA en miRNA niveaus 11. Ons doel hier was om te beschri...

Dit manuscript beschrijft een protocol voor het isoleren van exosomen uit menselijke urine met behulp van een gemodificeerde precipitatietechniek.

Een gemodificeerde precipitatiewerkwijze isoleren Urinary exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwerpen van een aangepaste methode voor exosomenprecipitatie die een snel, schaalbaar en effectief alternatief biedt voor de isolatie van exosomen uit urine. Dit wordt bereikt door eerst grote dode cellen en celresten uit het urinemonster te verwijderen via centrifugatie, waarna het supernatant met de urinaire exosomen wordt overgebracht naar een nieuwe buis. In de tweede stap wordt de pellet opgelost in een isolatie-oplossing die DTT bevat om TAM horse fall-eiwit te verwijderen.Na verdere centrifugatie wordt het TP-vrije supernatant gedurende de nacht geïncubeerd met exo quick TC-reagens om de exosomen de volgende dag neer te slaan. De met exo quick TC-reagens behandelde monsters worden voor de laatste keer gecentrifugeerd om het exosomenpellet te verkrijgen. Ten slotte kunnen downstream-processen, zoals Western blot en real-time QPCR, worden uitgevoerd op de exosomen om de biomarkers van belang te identificeren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals ultracentrifugatiefiltratie en precipitatie, is dat deze methode geen ultracentrifugatiestappen vereist, eenvoudig uit te voeren is en relatief snel verloopt, terwijl er toch een hoge opbrengst aan relatief zuivere exosomen wordt verkregen voor daaropvolgende moleculaire analyse. Voeg vóór de urinecollectie 3,125 milliliter vers bereid protease-remmingscocktail toe aan een leeg steriel opvangvat en verzamel vervolgens ongeveer 10 milliliter van de eerste urinestroom in het vat. Breng het monster over in 15 milliliter conische buisjes.Let op: een verzamelde 24-uurs urinevloeistof kan ook worden gebruikt voor exosoomisolatie door deze bij 4 °C te bewaren. Centrifugeer de buisjes 10 minuten bij 17.000 ×g en 37 °C om cellulair debris te verwijderen of te scheiden van de urinaire exosomen. Draag vervolgens zorg dat het pellet niet wordt verstoord, breng het supernatant over naar een nieuw buisje en resuspendeer het pellet in 500 µL isolatie-oplossing.Incubeer het pellet met DTT bij een eindconcentratie van 200 mg/mL bij 37 °C gedurende 10 minuten. Vortex het monster elke twee minuten. Wanneer het pellet volledig is opgelost, voegt u 500 µL isolatie-oplossing toe aan het monster en centrifugeert u de resulterende suspensie onmiddellijk.Voeg het supernatant samen met het eerder verzamelde supernatant en resuspendeer de nieuwe pellet in 50 µL isolatie-oplossing. Om de exosomen te isoleren voor SDS-PAGE-analyse, wordt eerst 11 mL van het samengevoegde supernatant gedurende ten minste 12 uur bij 4 °C geïncubeerd met 3,3 mL exo quick TC-reagens. Centrifugeer na de incubatie het monster en breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis voor SDS-PAGE-analyse; de pellet die de urinaire exosomen bevat, wordt gebruikt voor de extractie van DNA/RNA of proteïnen, of bewaard bij -80 °C.Gebruik een NanoDrop-spectrofotometer om de concentraties DNA en RNA van elke extractie te bepalen door de absorptie bij 260 en 280 nanometer te meten met twee µL monster. Een aangepaste reproductie van een SDS-PAGE-analyse en biomarkerdetectie met behulp van western blot-analyse wordt getoond in de lanes; in de lanes met onbewerkte urine en het eerste urinepellet waren eiwitbanden waargenomen die overeenkomen met 90 tot 100 kDa, wat respectievelijk wijst op de aanwezigheid en de verwijdering van het TAM-horse fall-eiwit in de uiteindelijke supernatant- en exosoompellet-lanes. De band van het TAM-horse fall-eiwit werd niet waargenomen, wat duidt op een verwijdering van het TAM-horse fall-eiwit in de eerdere stappen, wat resulteerde in een verhoogde opbrengst van het exosoompellet.In dit experiment werden de biomarkers Alex en TSG 1 0 1 gedetecteerd, zelfs bij het gebruik van kleine hoeveelheden monster, wat duidt op een zeer zuiver exosoompellet voor biomarkeranalyse en de afwezigheid van overvloedige oplosbare eiwitten, waaronder het TAM horse fall protein na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van chronische nierziekten om uit urine geïsoleerde exosomen te gebruiken voor de vroege detectie en diagnose van diabetische nefropathie.

a-modified-precipitation-method-to-isolate-urinary-exosomes

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

The plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of the biomarkers for early detection and disease progression. This video describes the protocol for the separation of exosomes from the plasma samples of non-small cell lung cancer patients, which could be used for DNA and protein extractions.

Exosome Isolation: A Technique to Separate Exosomes from the Plasma of Non-small Cell Lung Cancer Patients

This video describes a density-based ultracentrifugation technique for isolating exosomes from conditioned media harvested from human embryonic kidney cell cultures using a 25% (w/w) sucrose cushion prepared in deuterium oxide. The isolated exosomes can be used for downstream applications.

Exosome Isolation: A Density-based Ultracentrifugation Technique Using Sucrose Cushion to Separate Exosomes from Conditioned Media of Cultured Cells

In dit artikel wordt een methode gepresenteerd voor het isoleren van exosomen uit vol bloed en verdere analyse door middel van nanodeeltjestracking met behulp van een semi-automatisch instrument. De gepresenteerde technologie biedt een uiterst gevoelige methode voor het visualiseren en analyseren van deeltjes in vloeibare suspensie.

Een innovatieve methode voor exosome kwantificering en Size Measurement

Galvocht is een waardevolle bron van extracellulaire vesiclen/exosomen die potentieel belangrijke biomarkers bevatten. Dit protocol vertegenwoordigt een robuuste methode om exosomen uit menselijk gal te isoleren voor verdere analyses, inclusief miRNA-profilering.

Isolatie en profilering van MicroRNA-bevattende exosomes van Human Bile

Hier presenteren we een protocol om te zuiveren van exosomes van plasma en serum met verminderde CO zuivering van niet-exosomal bloedeiwitten. Het geoptimaliseerde protocol bevat ultrafiltratie, protease behandeling en grootte uitsluiting chromatografie. Verbeterde zuivering van exosomes voordelen downstream analyses, met inbegrip van nauwkeuriger kwantificering van blaasjes en proteomic karakterisering.

Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum

Hier beschrijven we twee extracellulaire vesikel isolatie protocollen, ultrafiltratie centrifugeren en ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren, te isoleren van extracellulaire blaasjes van lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeibare steekproeven. De extracellulaire blaasjes lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeistof door beide methoden afgeleid zijn gekwantificeerd en gekenmerkt.

Isolatie van extracellulaire blaasjes aan de lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof met behulp van een techniek van ultrafiltratie centrifugeren

Hier presenteren we een protocol om Transient hartfunctie bij Duchenne spierdystrofie muizen door exosomes afgeleid van normale myogenic voorlopercellen verplanten.

Zuivering en transplanteren van Myogenic Progenitor cel afgeleid Exosomes ter verbetering van de hartfunctie bij Duchenne Muscular Dystrofe muizen

Dit protocol illustreert de 1) de isolatie en kweek van primaire fibroblasten uit de gastrocnemius-spier van volwassen muizen, evenals 2) zuivering en karakterisering van exosomen met behulp van een differentiële ultracentrifugatiemethode in combinatie met sucrosedichtheidsgradiënten gevolgd door western blot-analyses.

Isolatie en karakterisering van exosomen uit skeletspierfibroblasten

Dit protocol biedt gedetailleerde beschrijvingen voor de efficiënte isolatie van extracellulaire blaasjes in de urine met behulp van gefunctionaliseerde magnetische kralen. Bovendien omvat het latere analyses, waaronder western blotting, proteomics en phosphoproteomics.

Chemische affiniteit-gebaseerde isolatie van extracellulaire blaasjes uit biovloeistoffen voor proteomics en fosfoproteomics-analyse

Extracellulaire blaasjes zijn veelbelovend voor biomedische toepassingen, maar de huidige isolatiemethoden zijn tijdrovend en onpraktisch voor klinisch gebruik. In deze studie presenteren we een microfluïdisch apparaat dat de directe isolatie van extracellulaire blaasjes uit grote hoeveelheden biovloeistoffen op een continue manier met minimale stappen mogelijk maakt.

Isolatie in één stap van extracellulaire blaasjes uit monsters met een groot volume met een gespleten A4F-microfluïdisch apparaat

Leer een gemodificeerde precipitatiewerkwijze om exosomen uit urine te isoleren met centrifugatie en ExoQuick TC reagens. Deze schaalbare methode levert zuivere exosomen op voor Western blot en qPCR analyse.

Een gemodificeerde precipitatiewerkwijze isoleren Urinary exosomes

Meer video's verkennen