Een gemodificeerde precipitatiewerkwijze isoleren Urinary exosomes
January 16th, 2015
Dit manuscript beschrijft een protocol voor het isoleren van exosomen uit menselijke urine met behulp van een gemodificeerde precipitatietechniek.
Het algemene doel van deze procedure is om een aangepaste exosoom precipitatiemethode te ontwerpen die een snelle, schaalbare en effectieve alternatief biedt voor de isolatie van exosomen uit urine. Dit wordt bereikt door eerst grote dode cellen en celafval uit het urinemonster te verwijderen door centrifugatie, en de snavel met de urinere exosomen wordt overgebracht naar een nieuwe buis. In de tweede stap wordt de pellet opgelost in isolatieoplossing die DTT bevat om het TAM-paardenval-eiwit te verwijderen.
Vervolgens wordt na verdere centrifugatie het TP-vrije supernatant overnacht met exo quick TC-reagens geïncubeerd om de exosomen de volgende dag te precipiteren. De met exo quick TC-reagens behandelde monsters worden nog een laatste keer gecentrifugeerd om het exosome-pellet te verkrijgen. Uiteindelijk kunnen downstream-processen zoals Western blot en realtime QPCR op de exosomen worden uitgevoerd om de biomarkers van belang te identificeren.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals ultra centrifugatiefiltratie en precipitatie is dat de arm-methode geen ultra-certificeringsstappen vereist, relatief eenvoudig uit te voeren is, en snel is, terwijl het nog steeds een hoog, relatief puur exosome-opbrengst levert voor verdere moleculaire analyse. Vóór de urineverzameling. Bij 3,125 milliliter vers bereide proteaseremmercocktail in een lege steriele opvangbak en verzamel vervolgens ongeveer 10 milliliter van de eerste void-urine in de opvangbak. Breng het monster over in 15 milliliter kegelbuizen.
Let op, een 24-uurs urinemonster dat is verzameld, kan ook worden gebruikt voor exosome-isolatie door het te bewaren bij vier graden Celsius. Draai de buizen gedurende 10 minuten bij 17.000 GS en 37 graden Celsius om cellulair afval uit urinaire exosomen te verwijderen of te scheiden. Neem vervolgens, zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort, het supernatant over naar een nieuwe buis en suspendeer de pellet in 500 microliter isolatieoplossing.
Incubeer de pellet met DTT bij een uiteindelijke concentratie van 200 milligram per milliliter bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Vortex het monster elke twee minuten. Wanneer de pellet volledig is opgelost, voeg dan 500 microliter isolatieoplossing toe aan het monster en centrifugeer de resulterende suspensie onmiddellijk.
Combineer het supernatant met het eerder verzamelde supernatant en suspendeer de nieuwe pellet in 50 microliter isolatieoplossing. Voor SDS-pagina-analyse om de exosomen te isoleren, incubeer eerst 11 milliliter van het gepoolde supernatant met 3,3 milliliter exo quick TC-reagens bij vier graden Celsius gedurende minimaal 12 uur. Na de incubatie centrifugeer het monster, breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis voor SDS-pagina-analyse en het pellet dat de urinaire exosomen bevat, wordt gebruikt om D-N-A-R-N-A of eiwit te extraheren, of bewaard bij min 80 graden Celsius.
Gebruik een NanoDrop-spectrofotometer om de concentraties DNA en RNA van elke extractie te bepalen door de absorptie bij 260 en 280 nanometer te meten met twee microliter monster hier. Een gemodificeerde reproductie van een SDS-pagina-analyse en biomarkerdetectie met behulp van westerse bloedanalyse wordt getoond in de banen met onbewerkte urine en de eerste urinaire pellet-eiwitbanen die overeenkomen met 90 tot 100 kilodalton, werden waargenomen, wat duidt op de aanwezigheid en de verwijdering van het TAM-paardenval-eiwit respectievelijk in de laatste supernatant en exosome-pelletbanen. De TAM-paardenval-eiwitband werd niet waargenomen, wat duidt op een verwijdering van het TAM-paardenval-eiwit in de eerdere stappen en resulteert in een verhoogde exosome-pellet-opbrengst.
In dit experiment werden biomarkers Alex en TSG 1 0 1 gedetecteerd, zelfs wanneer lage hoeveelheden monster werden gebruikt, wat wijst op een zeer zuiver exosome-pellet voor biomarkeranalyse en een afwezigheid van overvloedige oplosbare eiwitten, inclusief het TAM-paardenval-eiwit Na zijn ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van chronische nierziekte om urine-geïsoleerde exosomen te gebruiken voor de vroege detectie en diagnose van diabetische nefropathie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een protocol voor het isoleren van exosomen uit menselijke urine met behulp van een gemodificeerde precipitatietechniek. De methode beoogt een snelle, schaalbare en effectieve alternatief te bieden voor exosome-isolatie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biologie
- Exosomenonderzoek
Achtergrond
- Exosomen zijn kleine extracellulaire blaasjes die betrokken zijn bij intercellulaire communicatie.
- Het isoleren van exosomen uit urine kan inzicht geven in verschillende biologische processen.
- Huidige methoden kunnen tijdrovend en minder efficiënt zijn.
- Een gemodificeerde precipitatietechniek zou de herstel van exosomen kunnen verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om een snelle methode te ontwikkelen voor het isoleren van exosomen uit urine.
- Om de schaalbaarheid en effectiviteit van exosome-extractie te verbeteren.
- Om downstream toepassingen zoals biomarkeridentificatie te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Centrifugatie om grote cellen en puin uit urinemonsters te verwijderen.
- Het oplossen van het pellet in isolatieoplossing met DTT.
- Het incuberen van het supernatant met exo quick TC reagens overnacht.
- Eindcentrifugatie om het exosome-pellet te verkrijgen.
Belangrijkste resultaten
- De gemodificeerde methode isoleert met succes exosomen uit urine.
- Exosomen kunnen worden gebruikt voor downstream-analyses zoals Western blot en qPCR.
- Efficiënte verwijdering van contaminanten verbetert de zuiverheid van geïsoleerde exosomen.
- Het protocol is schaalbaar voor grotere monstergrootten.
Conclusies
- De gemodificeerde precipitatietechniek is een haalbare methode voor exosome-isolatie.
- Deze aanpak kan exosome-onderzoek in verschillende biologische studies stroomlijnen.
- Toekomstige studies kunnen aanvullende toepassingen van geïsoleerde exosomen onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolating urinary exosomes enables non-invasive biomarker discovery for kidney disease, supporting early detection and mechanistic de-risking in renal therapeutic development. The modified precipitation method offers a scalable, high-yield alternative to ultracentrifugation, improving reproducibility and throughput for target validation workflows. This approach enhances predictive confidence in biomarker identification by reducing contamination and increasing exosome purity for downstream molecular profiling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating exosomes that reflect cell-type-specific cargo from nephron segments.
- Operational Value: Provides a quick, scalable method for isolating exosomes without ultracentrifugation, reducing technical variability.
- Predictive Value: Increases confidence in biomarker detection by yielding high-purity exosome pellets enriched in miRNA and mRNA for profiling.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated exosome samples for downstream assays such as Western blot and qPCR to detect disease-associated biomarkers.
- Operational Value: Standardizes exosome isolation through a precipitation-based workflow compatible with high-throughput sample processing.
- Assay Readiness: Generates consistent exosome yields suitable for RNA extraction and protein analysis, supporting reproducible biomarker screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from biomarker discovery in urine to preclinical validation by providing disease-relevant exosome cargo.
- Mechanistic De-risking: Enables detection of altered exosome content under renal dysfunction, clarifying pathophysiological pathways.
- Predictive Confidence: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking exosome biomarkers to early signs of diabetic nephropathy.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling non-invasive biomarker isolation that informs target selection and preclinical continuity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating exosomes that reflect cell-origin-specific cargo from urinary tract cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative exosome outputs suitable for biomarker assay development and compound screening.
- Analytics: Enables measurement of exosome-associated RNA and protein levels via qPCR and Western blot for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects urinary exosome biomarkers to preclinical models of kidney disease through disease-relevant cargo detection.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized isolation platform applicable across multiple urine sample types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation by reducing mechanistic ambiguity through pure exosome isolation for biomarker profiling.
- Operational Value: Improves standardization and scalability by eliminating ultracentrifugation steps and simplifying workflow.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by increasing confidence in early biomarker detection for kidney disease.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of renal therapeutic candidates based on robust exosome biomarker data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in exosome biology and molecular techniques such as RNA extraction and qPCR.
- Needs access to centrifugation equipment, ExoQuick TC reagent, and spectrophotometric tools for RNA/DNA quantification.
- Demands standardization across teams to ensure consistent incubation times, temperatures, and reagent handling.
- Requires adaptation considerations when applying the method to different urine collection protocols or storage conditions.
- Practical limitations include the need for overnight incubation and careful handling to avoid exosome loss during transfers.
