Methoden voor de kwantitatieve detectie van antilichaam-geïnduceerde complement activatie op de rode bloedcellen
29 januari 2014
Hier beschrijven we twee assays voor het meten van complement activatie geïnduceerd door antilichamen tegen rode bloedcellen. Het grote voordeel boven de huidige assays is de kwantitatieve en eenvoudig te interpreteren natuur.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de complementactivatie door antilichamen tegen rode bloedcellen (RBC's) in patiëntenserum te beoordelen. Dit wordt bereikt door rode bloedcellen te incuberen met patiëntenserum in de aanwezigheid van een blokkerend anti-C5-antilichaam om de depositie van C4 en C3 op het oppervlak van de RBC's te induceren. Vervolgens worden de RBC's gekleurd met fluorescentielabelde anti-C4- en anti-C3-antilichamen, waarna de hoeveelheid complementdepositie op de RBC's in een alternatieve methode kan worden geanalyseerd via flowcytometrie.
De RBC's worden geïncubeerd met patiëntenserum in afwezigheid van anti-C5 om complement-gemedieerde lysis op te wekken. Het percentage gelyste RBC's kan vervolgens worden bepaald door middel van spectrometrie, waarbij de hoeveelheid hemoglobine die door de cellen is vrijgegeven, wordt gemeten. Het belangrijkste voordeel van deze nieuwe techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de hemolyse- of de antiglobulinetest die in de routinediagnostiek worden gebruikt, is dat deze kwantitatief van aard is en dat we suboptimale verschillen in complementactivatie kunnen detecteren.
Elizabeth Brook, postdoc in ons laboratorium, zal de procedures demonstreren. Begin met het drie maal wassen van o-type rode bloedcellen met PBS, en incubeer vervolgens het pellet in een 0,5% Roma-lane oplossing in een verhouding van 1:2 gedurende 10 minuten bij 37 °C. Na het drie keer opnieuw wassen van de cellen, worden deze bewaard als een 3% oplossing in verse PBS bij 4 °C om de complementdepositie op de RBCs via flowcytometrie te analyseren. Inactiveer eerst de gewenste hoeveelheid patiërenserum door hittebehandeling gedurende 30 minuten bij 56 °C. Terwijl het serum wordt hittebehandeld, worden de brola-behandelde rode bloedcellen drie maal gewassen in Roal-buffer na de laatste wasbeurt.
Resuspendeer het pellet in vbg plus plus bij een verdunning van 0,5%. Voeg vervolgens bij een glasparel 25 µL van de 0,5% RBC's, 37,5 µL vers AB-serum en 37,5 µL van 200 µg/mL anti-C5 toe aan elke put van een 96-put ronde bodemplaat. Voeg daarna het hitte-inactieve patiëntenserum toe aan elke put in de juiste concentratie, waarbij indien nodig wordt aangevuld met hitte-inactief AB-serum en waarbij tevens een negatieve controle wordt opgenomen.
Gebruik VBG plus plus om elk wel tot een eindvolume van 150 µL te brengen en incubeer de plaat vervolgens, afgedekt met EIA-folie, gedurende anderhalf tot twee uur bij 37 °C onder schudden. Was de cellen drie keer met PBS aangevuld met 0,5% BSA en label de cellen vervolgens met 1 µg/mL fluorescent gelabelde anti-C3 en anti-C4 monoklonale antilichamen. Incubeer de cellen 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur onder zacht schudden en resuspendeer de RBC's, na het drie keer wassen van de plaat, in 150 µL PBS plus 0,5% BSA per wel.
Breng de celsuspensies over naar een nieuwe 96-wells plaat met ronde bodem en plaats de plaat vervolgens in de flowcytometer. Scheid de enkelvoudige cellen van de dubletten met behulp van een forward scatter plot. Stel de gate in op de enkelvoudige RBC's en selecteer vervolgens het juiste detectiekanaal voor de fluorescentiesignalen. Kwantificeer de resultaten met behulp van de mediane fluorescentie-intensiteit voor kwantitatieve hemolytische analyse; verhit en activeer het serum van de patiënt en was de met romaine behandelde RBC's zoals zojuist gedemonstreerd.
Incubeer vervolgens de RBC's met complement en patiëntenserum zoals zojuist gedemonstreerd, maar zonder anti-C5, en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 664 ×g met een verminderde vertraging. Draag daarna voorzichtig 90 µL supernatant over naar een nieuwe microtiterplaat, waarbij u erop let geen intacte cellen over te dragen en luchtbellen vermijdt, en meet vervolgens de absorptie bij 414 tot 690 nm in een spectrofotometer. Druk de hemolyse uit als een percentage van de lysis van een monster RBC's dat in puur water is geïncubeerd.
In deze eerste figuur worden representatieve scatterplots getoond voor met brola behandelde RBC's; de geschikte gating voor enkele RBC's is hier te zien. Normaal gesproken valt ongeveer 95% van de RBC's binnen deze single cell gate. In deze histogrammen zijn representatieve resultaten te zien voor het effect van auto-immuun hemolytische anemia of aha.
Patiëntserum op C4- en C3-depositie zijn weergegeven zoals verwacht; meer patiëntserum leidt tot meer complementdepositie. Opvallend is dat de complementdepositie in twee afzonderlijke positieve pieken voorkomt. Dit wordt waarschijnlijk niet veroorzaakt door heterogeniteit in de RBC-populatie, aangezien de RBC's afkomstig zijn van een enkele donor, hoewel de oorzaak van dit fenomeen nog steeds wordt onderzocht. De mediane fluorescentie-intensiteiten van de monsters zijn uitgezet in deze lijngrafieken om de reproduceerbaarheid van de C4- en C3-depositie-assays aan te tonen.
Let op de grote variatie in de depositie van de verschillende AH H patiëntenmonsters. Ten slotte kunnen in deze grafieken gegevens worden waargenomen van een hemolytische assay van een ahha patiërensermonster dat auto-antilichamen tegen RBC's bevat. Titratie met het serummonster levert een duidelijke, reproduceerbare curve op met een geschikte complementremmer zoals anti C five.
Het hemolytische signaal kan worden getitreerd, zoals gedemonstreerd in deze grafiek. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe complementactivatie door antilichamen die specifiek zijn voor rode bloedcellen kan worden gemeten, entweder door flowcytometrische analyse van C3- of C4-depositie of door een kwantitatieve hemolytische assay.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft twee assays voor het meten van complementactivatie geïnduceerd door antilichamen tegen rode bloedcellen (RBC's). De assays zijn kwantitatief en eenvoudig te interpreteren, wat voordelen biedt ten opzichte van bestaande methoden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Hematologie
- Flowcytometrie
Achtergrond
- Complementactivatie is cruciaal in immuunresponsen.
- Antilichamen tegen RBC's kunnen leiden tot diverse klinische aandoeningen.
- Huidige assays kunnen tekortschieten in kwantitatieve precisie.
- Nieuwe methoden zijn erop gericht de detectie van complementactivatie te verbeteren.
Doel van de studie
- Om complementactivatie door antilichamen tegen RBC's te beoordelen.
- Om een kwantitatieve assay te ontwikkelen voor een betere interpretatie van de resultaten.
- Om nieuwe technieken te vergelijken met bestaande diagnostische methoden.
Gebruikte methoden
- Incubatie van RBC's met patiëntenserum en blokkerende antilichamen.
- Kleuring van RBC's met fluorescentie-gelabelde antilichamen.
- Analyse van complementdepositie via flowcytometrie.
- Meting van hemoglobinevrijgave om RBC-lyse te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- De nieuwe assays leveren kwantitatieve gegevens over complementactivatie.
- Suboptimale verschillen in activatie kunnen worden gedetecteerd.
- De resultaten tonen een verbeterde gevoeligheid in vergelijking met traditionele methoden.
- Flowcytometrie-analyse maakt een gedetailleerde interpretatie mogelijk.
Conclusies
- De nieuwe assays verbeteren het begrip van complementactivatie.
- Ze bieden een betrouwbaar alternatief voor bestaande diagnostische tests.
- Toekomstige toepassingen kunnen de diagnose en behandeling van patiënten verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
De kwantitatieve beoordeling van antilichaam-geïnduceerde complementactivatie op rode bloedcellen is essentieel voor het evalueren van de effectiviteit van complementremmers en het begrijpen van hemolytische mechanismen bij auto-immuun- en allo-immuunziekten. De beschreven flowcytometrie- en spectrofotometrische assays bieden reproduceerbare, kwantitatieve resultaten die de detectie van suboptimale verschillen in complementactivatie mogelijk maken, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie bij de therapeutische ontwikkeling. Deze methoden verhogen het voorspellende vertrouwen bij doelwitvalidatie door kwalitatieve waarnemingen te vertalen naar meetbare, translateerbare biomarkers voor preklinische en klinische besluitvorming.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de complementdepositie (C3/C4) op RBC's te kwantificeren die wordt geïnduceerd door autoantilichamen of alloantilichamen.
- Operationele waarde: Biedt functionele targetvalidatie via directe meting van antilichaam-gemedieerde effectoractiviteit, waardoor mechanistische ambiguïteit bij de selectie van targets wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door kwantitatieve gegevens te genereren over de potentie van complementactivatie, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen voor complement-modulerende therapieën.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve outputs (mediaan fluorescentie-intensiteit, hemoglobinevrijgave) die geschikt zijn voor high-throughput screening van complementremmers of therapeutische antilichamen.
- Reproduceerbaarheid: Toont een lage variabiliteit tussen serummonsters van patiënten, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen en standaardisatie tussen laboratoria mogelijk maakt.
- Nut van het platform: Maakt gebruik van toegankelijke instrumentatie (flowcytometer, spectrophotometer) om herbruikbare assays te creëren voor het meten van complement-afhankelijke bioactiviteit in discovery-pipelines.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert pathofysiologische mechanismen bij auto-immuun hemolytische anemie (AIHA) en allo-immuun hemolyse, waarbij doelwitinteractie wordt gekoppeld aan functionele complementactivatie.
- Translationele continuïteit: Slaat de brug tussen ontdekking en preklinische validatie door kwantitatieve biomarkers te leveren (C3/C4-depositie, hemolyse) die correleren met het klinische hemolytische potentieel.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt mechanische risicoreductie mogelijk door complement-gemedieerde lysis te kwantificeren, wat bijdraagt aan veiligheidsbeoordelingen en dosis-responismodellering in preklinische studies.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De assays zijn geïntegreerd in het continuüm van ontdekking, van doelwitvalidatie via lead-identificatie tot preklinische veiligheidsbeoordeling, en bieden kwantitatieve read-outs van complementactivatie die bijdragen aan biologische risicoreductie en de evaluatie van de therapeutische index.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door antilichaam-geïnduceerde complementactivatiepaden te kwantificeren, waardoor het werkingsmechanisme voor immunomodulerende kandidaten wordt verduidelijkt.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve resultaten (fluorescentie-intensiteit, spectrophotometrische hemolyse) die een betrouwbare vergelijking van testverbindingen of serummonsters mogelijk maken.
- Analytica: Genereert meetbare read-outs (mediane fluorescentie-intensiteit, hemoglobinevrijgave) die statistische analyse en vergelijking tussen condities in dosis-responsstudies faciliteren.
- Translationeel onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit via ziekterelateerde resultaten die de complementactivatie weerspiegelen die wordt gezien bij AIHA en in transfusiesituaties.
- Enterprise-hergebruik: Creëert een schaalbaar, gestandaardiseerd platform voor het beoordelen van complement-afhankelijke activiteit voor antilichaamtherapeutica, biosimilars en complementremmers.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door kwalitatieve complementassays om te zetten in kwantitatieve, vertaalbare metingen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door gedefinieerde protocollen voor de preparatie van RBC's, serumincubatie en detectie via flowcytometrie of spectrometrie.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van complement-activerende risico's mogelijk te maken, waardoor het risico op falen in een laat stadium bij immunomodulerende programma's wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering door het complementactiveringspotentieel te kwantificeren, wat objectieve beslissingen over verdere ontwikkeling in therapeutische trajecten ondersteunt.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in immunologie, flowcytometrie en de uitvoering van spectrophotometrische assays voor nauwkeurige metingen van complementdepositie en hemolyse.
- Afhankelijk van toegang tot flowcytometers met geschikte fluorescentiekanalen en spectrophotometers voor hemoglobinekwantificering bij 414/690 nm.
- Maakt standaardisatie van de RBC-preparatie (bijv. nul-type, bromeline-behandeld) en hitte-inactivatie van serum noodzakelijk om consistentie van de assay tussen gebruikers en locaties te waarborgen.
- Vereist aanpassingen bij toepassing op verschillende RBC-soorten, antigeendichtheden of complementbronnen buiten menselijk AB-serum.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak voor zorgvuldige overdracht van het supernatant om celoverdracht en luchtbellen te voorkomen, wat de nauwkeurigheid van de hemolysekwantificering kan beïnvloeden.
