Name: Methoden voor de kwantitatieve detectie van antilichaam-geïnduceerde complement activatie op de rode bloedcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Leer twee kwantitatieve assays voor complementactivatie door antilichamen op rode bloedcellen met flowcytometrie en spectrometrie. Deze methoden bieden verbeterde gevoeligheid voor diagnostische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SZ en DW krijgen een onbeperkte subsidie ​​van Viropharma.

1. Voorbereiding van Bromelaïne-behandelde rode bloedcellen <ol><li> Wassen 0-getypte rode bloedcellen 3x met 1x PBS (centrifugeren bij 664 g gedurende 2-5 min). </li><li> Incubeer 1 volume verpakte erytrocyten met twee volumes 0,5% bromelaïne oplossing 10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Was de cellen 3x met 1x PBS. </li><li> De cellen kunnen worden opgeslagen als een 3% oplossing bij 4 ° C in 1 x PBS gedurende ten minste een week. </li></ol> 2. C3 en C4 Deposition analyse over RBC door FACS <ol><li> Warmte-inactivatie van het vereiste hoeveelheid patiënt serum (of andere anti-RBC antilichaam bron) door verwarmen van het monster gedurende 30 minuten bij 56 ° C. </li><li> Was-bromelaïne behandelde RBC driemaal VBG - (5 mM Veronal, 150 mM NaCl, 0,05% gelatine pH 7,4) en resuspendeer ze in VBG + + (VBG - + 2 mM MgCl2 + 10 mM CaCl2) een geven 0,5% oplossing. </li><li> Pipetteer de volgende componenten in een ronde bodem plaat met een glas parel (fof goede menging): 25 pi 0,5% RBCs, 37,5 pi vers AB serum (complement bron) en 37,5 pi 200 pg / ml anti-C5. Anti-C5 is duur en moeilijk te verkrijgen zou zijn. Men zou kunnen overwegen om C5-/C6-/C7- of C8-deficiënte serum in plaats van AB-serum en anti-C5. </li><li> Voeg patiëntenserum per putje tot een uiteindelijke concentratie van 0,1-33%. Corrigeren voor verschillen in serum concentratie per goed gevolg gebruik warmte-geïnactiveerd AB-serum. Voeg VBG + + tot een eindvolume van 150 ul / putje krijgen. Sluiten plaat met ELISA folie. </li><li> Incubeer 1,5-2 uur bij 37 ° C onder schudden. </li><li> Was de RBC driemaal met PBS + 0,5% BSA (centrifugatie bij 664 g gedurende 2 min). </li><li> Voeg fluorescent gelabelde anti-C3 en C4 anti-monoklonale antilichamen of hun Fab-fragmenten (agglutinatie verlagen) in PBS + 0,5% BSA tot een eindconcentratie van 1 ug / ml. Hier maat ontwikkelde anti-C3-Alexa Fluor 488 en anti-C4-Alexa Fluor 647 monoklonale antilichamen worden gebruikt, de keuze van these fluorescente labels maakt gelijktijdige detectie van C3 en C4 door FACS. </li><li> Incubeer 30-45 minuten bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Was RBCs 3x met PBS + 0,5% BSA. </li><li> Hersuspenderen RBC 150 pl in PBS 0,5% BSA en pipet ze in een nieuwe plaat (om zich te ontdoen van de glazen parels voor de FACS-analyse). </li><li> Voer FACS-analyse. Aparte enkele cellen van wambuizen in een scatter plotten FSC-A, zet de poort op de single RBC; selecteer de juiste detectie kanaal voor de fluorescentie-signalen (bijv. FITC en APC). </li><li> Kwantificeren met behulp van de mediaan fluorescentie-intensiteit. </li></ol> Opmerking: Het is mogelijk om een isotype controle (bijv. fluorescent gemerkt anti-IL6 muis IgG1) gebruikt. Echter, is het raadzaam om een echte negatieve controle bijvoorbeeld door incubatie RBC zonder patiënt serum (alleen AB-serum) of zonder complement bron (warmte-geïnactiveerd AB-serum en hitte-geïnactiveerd serum patiënt) omvatten, eend vlek vervolgens deze met dezelfde anti-C3-Alexa Fluor 488 en anti-C4-Alexa Fluor 647-antilichamen. Dit geeft een geldige controle dan een isotype controle bij rode bloedcellen 12, hoewel deze verschillende controles geven grotendeels hetzelfde, negatieve uitkomst. 3. Kwantitatieve Hemolytic Assay <ol><li> Warmte-inactivatie van het vereiste hoeveelheid patiëntensera (of andere anti-RBC antilichaam bron) door verhitting van het monster 30 minuten bij 56 ° C. </li><li> Wassen RBC 3x VBG - en een keer met VBG + +. </li><li> Pipetteer de volgende componenten in een ronde bodem plaat met een glas parel (voor een goede menging): 35 pl 3% RBC, 25 ul vers AB-serum (complement bron) en 1-50% serum patiënt. Corrigeren voor verschillen in serum concentratie met behulp van warmte-geïnactiveerd AB-serum. Voeg VBG + + tot een eindvolume van 150 ul / putje krijgen. Sluiten plaat met ELISA folie. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 1,5-2 uur onder schudden. </li><li> Centrifuge plaat bij 664 xg gedurende 5 minuten met verminderde vertraging (bijv. vertraging tot stilstand in 2-3 min.). </li><li> Pipet 90 ul supernatant voorzichtig in een nieuwe microtiterplaat. Het is belangrijk in deze stap om luchtbellen te voorkomen en te verhinderen mee te nemen intacte cellen. </li><li> Meten A414/690 in een geschikte spectrofotometer. </li><li> Druk het lysis als percentage van de lysis van een monster RBCs met zuiver water. </li></ol>

<ol><li>Zeerleder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+haemolytic+anaemia+-+a+practical+guide+to+cope+with+a+diagnostic+and+therapeutic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Neth.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge.</a> Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).</li>
<li>Reardon, J. E., Marques, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+evaluation+and+transfusion+support+of+patients+with+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia.</a> Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).</li>
<li>Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hemolytic+anemia+with+gel-based+immunohematology+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests.</a> Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direct+antiglobulin+test%3A+A+critical+step+in+the+evaluation+of+hemolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis.</a> Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).</li>
<li>Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+alloimmunization+from+an+African+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Red blood cell alloimmunization from an African perspective.</a> Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).</li>
<li>Packman, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+anemia+due+to+warm+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Hemolytic anemia due to warm autoantibodies.</a> Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).</li>
<li>Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+cold+agglutinin+mediated+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).</li>
<li>Petz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+antibody+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Cold antibody autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).</li>
<li>Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warm+autoimmune+hemolytic+anemia%3A+recent+progress+in+understanding+the+immunobiology+and+the+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).</li>
<li>Endoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+prewarming+conditions+for+Rh+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing.</a> Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).</li>
<li>Wouters, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1-esterase+inhibitor+concentrate+rescues+erythrocytes+from+complement-mediated+destruction+in+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).</li>
<li>Arndt, P. A., Garratty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Published+Methods+for+Analysis+of+Red+Cell+Antigen-Antibody+Reactions+by+Flow+Cytometry%2C+and+Approaches+for+Resolving+Problems+with+Red+Cell+Agglutination%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Bovenstaande tests zijn reproduceerbaar en robuust. Ze zijn eenvoudig uit te voeren en het is mogelijk om ze uit te voeren met veel monsters tegelijk (een 96 putjes plaat). Daarom zou deze aanpak ook geschikt voor een volledig geautomatiseerd systeem, bijvoorbeeld een ELISA-robot systeem. In tegenstelling tot de momenteel gebruikte technieken, deze tests zijn kwantitatieve en dit zal helpen bijvoorbeeld in de studie van het effect van complement inhibitors. Bovendien is de interpretatie doel, namelijk ...

Antilichamen tegen rode bloedcellen (RBC&#39;s) kan worden geïnduceerd door transfusie van rode bloedcellen een antigeen tot expressie die niet aanwezig ontvanger RBC. Deze allo-antilichamen kunnen ernstige acute hemolytische transfusiereacties als gevolg van activering op de volgende transfusie 5 aanvullen veroorzaken. In auto-immune hemolytische anemie (AIHA), patiënten autoantilichamen tegen hun eigen RBCs. Dit leidt tot versnelde goedkeuring van de cellen via de interactie van IgG gebonden aan RBC met Fcy-receptoren op fagocyten in de milt en / of bij auto-antilichamen kunnen complement via complement receptoren in de lever 6,7 activeren. Fulminante complement activatie resulteert in intravasculaire hemolyse is zeldzaam maar vaak fataal. Versnelde, aanvulling bemiddelde RBC vernietiging veroorzaakt door ofwel allo-of auto-antilichamen resulteert in acute bloedarmoede en dus potentieel fatale weefsel hypoxie. De auto-antilichamen in AIHA worden ingedeeld in warme en koude antilichamen, dependinG op de optimale temperatuur die binden aan RBC (respectievelijk 37 ° C of lager). De warme antilichamen zijn gewoonlijk IgG isotype en de koude antilichamen van het IgM isotype 8,9. AIHA kan secundair aan bijvoorbeeld lymphoprolyferative aandoeningen, bindweefselziekten, vaste tumoren, infecties of drugs, maar in 50% van de gevallen AIHA idiopathisch 9. Detectie van gammaglobulinen (bijv.. IgG of IgM) en complement gebonden aan RBC patiënt wordt uitgevoerd door middel van een semikwantitatieve directe antiglobulinetest (Coombs test) (DAT). In de DAT patiënt RBC geïncubeerd met anti-IgG of anti-C3d. Het optreden van RBC agglutinatie toont de aanwezigheid van bijgevoegde complement componenten of IgG binding. Detectie van allo-of auto-antilichamen in het serum van de patiënt wordt uitgevoerd door middel van de indirecte antiglobulinetest (IAT). In de IAT, worden-bromelaïne behandeld testen RBC geïncubeerd met patiënt serum, gewassen en vervolgens geïncubeerd met anti-hUman IgG. Indien rode bloedcellen gesensibiliseerd met anti-RBC IgG aanwezig in de patiënt serumagglutinatie optreden. IgM antilichamen tegen RBC zal direct leiden tot agglutinatie na incubatie van bromelaïne behandeld testen RBC met de patiënt serum. RBC agglutinatie in de directe Coombs-test of in de IAT wordt visueel beoordeeld hetzij door oog in een reageerbuis of door het laden van het monster op een kleine Sephadex kolom scheiden geagglutineerde en single RBC op grootte 1. Een andere vaak gebruikte techniek om complement activatie op RBC meten is de hemolytische test 1, waarbij de capaciteit van patiënt serum (complement gemedieerde) hemolyse van bromelaïne behandelde RBC 10 induceren beoordeeld. De test wordt genoteerd als positief wanneer de bovenstaande vloeistof na centrifugeren rood is gekleurd vanwege vrijgegeven hemoglobine en als negatief beschouwd als het kleurloos blijft. Zowel de antiglobulinetest en de hemolytische assay zijn semi-kwantitatief, omdat de hoogste serum verdunning wordt aangeduid waarin de test is nog steeds positief. De antiglobulinetest en de hemolytische assay zijn robuust testen die routinematig worden gebruikt in de diagnostiek. Aangezien deze tests zijn semikwantitatieve en afhankelijk van de ervaring van de technicus uitvoeren van de test zij niet geschikt om subtiele verschillen van complement activatie op RBC bestuderen, zoals nodig bij de beoordeling van de effectiviteit van complement inhibitors. Daarom ontwikkelden we twee kwantitatieve bepalingen om het complement activatie te bepalen door het (auto-) antilichamen tegen RBC, die we in dit artikel zal beschrijven. Eerst, ontwikkelden we een test om de afzetting van activatie van complement fragmenten C3 en C4 op RBC (figuur 1A) te meten. In deze assay worden menselijke bromelaïne behandelde type 0 RBC geïncubeerd met warmte geïnactiveerd serum patiënt (anti-RBC antilichaam bron), vers AB serum (complement bron) en anti-C5 monoklonaal antilichaam (Eculizumab). Tijdens deze incubation, C3 en C4 depositie zal optreden als de patiënt serum bevat een aanvulling op het activeren van anti-RBC antistoffen. Om RBC lysis te voorkomen door downstream complement activatie een blokkerende anti-C5 monoklonaal antilichaam wordt toegevoegd. Vervolgens wordt C3 en C4 depositie op RBC gedetecteerd door FACS met fluorescent gemerkte monoklonale antilichamen of Fab-fragmenten reageren met C3 en C4, respectievelijk. Gating in enige RBC is belangrijk om de betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen. Voordelen van deze techniek zijn dat een kleine hoeveelheid patiënt materiaal nodig complementactivering in een vroeg stadium van de cascade wordt beoordeeld en de methode reproduceerbaar en kwantitatief. Een bijkomend voordeel van naar zowel C3 en C4 is dat onderscheid kan worden gemaakt tussen de klassieke en lectine-route activering (zowel C3 en C4 depositie) en de alternatieve route activering (alleen C3 depositie). Het gebruik van bromelaïne behandelde RBC plaats van onbehandelde erytrocyten verhoogt de gevoeligheid van de alszeggen. De tweede test is gebaseerd op de momenteel gebruikte hemolytische test (Figuur 1B). Human-bromelaïne behandelde type 0 RBC worden geïncubeerd met hitte-geïnactiveerd serum patiënt (anti-RBC antilichaam bron) en verse AB-serum (complement bron). Als complement geactiveerd door de patiënt anti-RBC antilichamen, zal dosisafhankelijk RBC lysis optreden, waardoor vrij hemoglobine. De hoeveelheid vrijgekomen hemoglobine wordt gekwantificeerd door het meten van de absorptie bij 414 nm in het supernatant na stoppen met draaien de intacte en gefragmenteerde RBC. De absorptie correleert met de hoeveelheid hemolyse plaatsgevonden. In tegenstelling tot de momenteel gebruikte assay Dit protocol maakt een objectieve kwantitatieve waarde van hemolyse dat zeer reproduceerbaar en onafhankelijk van de persoon die de interpretatie van de test. Een toepassing van deze werkwijzen is beschreven in 11, waarbij het ​​mogelijke gebruik van C1-inhibitor complement inhibitor in AIHA was studied.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B-4287</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Barbital</td><td>Fagron</td><td>0261</td><td>Deze chemische stof is onderhevig aan geneesmiddelenregelgeving.</td></tr><tr><td>Sodium Barbital</td><td>Fagron</td><td>0263</td><td>Deze chemische stof is onderhevig aan geneesmiddelenregelgeving.</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Merck</td><td>1.0470.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Merck</td><td>1.0238.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 488 amine reactieve kleurstof</td><td>Pierce</td><td>46402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 650 amine reactieve kleurstof</td><td>Pierce</td><td>62265</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&alpha;C5 (Eculizumab)</td><td>Alexion Pharmaceuticals</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FACS (Canto)</td><td>BD</td><td></td><td>Elke FACS kan worden gebruikt die de juiste lasers heeft.</td></tr><tr><td>Spectrofotometer (bijv. Multiskan spectrum)&nbsp;</td><td>Thermo Labsystems</td><td>1500-193</td><td>Elke spectrofotometer met het juiste golflengtebereik kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>BD FACSDiva-software v 6.1.2</td><td>BD</td><td>643629</td><td>Elke compatibele FACS-analysesoftware kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Bromelaïne&nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>K1121</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

methoden voor de kwantitatieve detectie van antilichaam-geïnduceerde complement activatie op de rode bloedcellen

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Antilichamen tegen rode bloedcellen (RBC&#39;s) kan leiden tot activatie resulteert in een versnelde klaring via complement receptoren in de lever (extravasculaire hemolyse) of tot intravasculaire lysis van erytrocyten vullen. Antistoffen (bijv. ABO) of auto-antilichamen tegen RBC antigenen (zoals in auto-immune hemolytische anemie, AIHA) leidt tot activatie vullen potentieel schadelijk en kan - vooral wanneer die tot intravasculaire lysis - fataal 1. Momenteel vullen wordt geactiveerd door een (auto)-antilichamen op rode bloedcellen wordt beoordeeld in vitro met behulp van de Coombs-test weerspiegelt complement afzetting op RBC of door een nonquantitative hemolytische assay reflecterende RBC lysis 1-4. Echter, om de werkzaamheid van complement-remmers te beoordelen, is het verplicht om kwantitatieve technieken. Hier beschrijven we twee dergelijke technieken. Eerst een test om C3 en C4 depositie detecteren op rode bloedcellen die wordt geïnduceerd door antilichamen in patiëntenserum voorafwoordigd. Hiervoor wordt FACS-analyse gebruikt fluorescent gemerkt anti-C3 of C4 anti-antilichamen. Vervolgens wordt een kwantitatieve hemolytische test beschreven. In deze test, complement-gemedieerde hemolyse geïnduceerd door patiënt serum gemeten te maken van spectrofotometrische detectie van de vrijgekomen hemoglobine. Beide testen zijn zeer reproduceerbaar en kwantitatief, vergemakkelijken studies van antilichamen geïnduceerde complement activatie.

Figuur 2a toont een representatief scatterplot voor RBC. Geschikt gating voor enkele rode bloedcellen kan worden gezien in de FSC-W - FSC-Een perceel (P1). Gewoonlijk ongeveer 95% van RBC vallen binnen deze poort P1 (enkelvoudige cellen), maar wanneer een hoog percentage patiënten serum wordt gebruikt, kan dit dalen tot 70-80%, vooral als anti-RBC IgM aanwezig in de patiënt serum. Representatieve resultaten voor de invloed van AIHA patiëntenserum op C4 depositie Figu...

Hier beschrijven we twee assays voor het meten van complement activatie geïnduceerd door antilichamen tegen rode bloedcellen. Het grote voordeel boven de huidige assays is de kwantitatieve en eenvoudig te interpreteren natuur.

Methoden voor de kwantitatieve detectie van antilichaam-geïnduceerde complement activatie op de rode bloedcellen

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de complementactivatie door antilichamen tegen rode bloedcellen (RBC's) in patiëntenserum te beoordelen. Dit wordt bereikt door rode bloedcellen te incuberen met patiëntenserum in de aanwezigheid van een blokkerend anti-C5-antilichaam om de depositie van C4 en C3 op het oppervlak van de RBC's te induceren. Vervolgens worden de RBC's gekleurd met fluorescentielabelde anti-C4- en anti-C3-antilichamen, waarna de hoeveelheid complementdepositie op de RBC's in een alternatieve methode kan worden geanalyseerd via flowcytometrie.De RBC's worden geïncubeerd met patiëntenserum in afwezigheid van anti-C5 om complement-gemedieerde lysis op te wekken. Het percentage gelyste RBC's kan vervolgens worden bepaald door middel van spectrometrie, waarbij de hoeveelheid hemoglobine die door de cellen is vrijgegeven, wordt gemeten. Het belangrijkste voordeel van deze nieuwe techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de hemolyse- of de antiglobulinetest die in de routinediagnostiek worden gebruikt, is dat deze kwantitatief van aard is en dat we suboptimale verschillen in complementactivatie kunnen detecteren.Elizabeth Brook, postdoc in ons laboratorium, zal de procedures demonstreren. Begin met het drie maal wassen van o-type rode bloedcellen met PBS, en incubeer vervolgens het pellet in een 0,5% Roma-lane oplossing in een verhouding van 1:2 gedurende 10 minuten bij 37 °C. Na het drie keer opnieuw wassen van de cellen, worden deze bewaard als een 3% oplossing in verse PBS bij 4 °C om de complementdepositie op de RBCs via flowcytometrie te analyseren. Inactiveer eerst de gewenste hoeveelheid patiërenserum door hittebehandeling gedurende 30 minuten bij 56 °C. Terwijl het serum wordt hittebehandeld, worden de brola-behandelde rode bloedcellen drie maal gewassen in Roal-buffer na de laatste wasbeurt.Resuspendeer het pellet in vbg plus plus bij een verdunning van 0,5%. Voeg vervolgens bij een glasparel 25 µL van de 0,5% RBC's, 37,5 µL vers AB-serum en 37,5 µL van 200 µg/mL anti-C5 toe aan elke put van een 96-put ronde bodemplaat. Voeg daarna het hitte-inactieve patiëntenserum toe aan elke put in de juiste concentratie, waarbij indien nodig wordt aangevuld met hitte-inactief AB-serum en waarbij tevens een negatieve controle wordt opgenomen.Gebruik VBG plus plus om elk wel tot een eindvolume van 150 µL te brengen en incubeer de plaat vervolgens, afgedekt met EIA-folie, gedurende anderhalf tot twee uur bij 37 °C onder schudden. Was de cellen drie keer met PBS aangevuld met 0,5% BSA en label de cellen vervolgens met 1 µg/mL fluorescent gelabelde anti-C3 en anti-C4 monoklonale antilichamen. Incubeer de cellen 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur onder zacht schudden en resuspendeer de RBC's, na het drie keer wassen van de plaat, in 150 µL PBS plus 0,5% BSA per wel.Breng de celsuspensies over naar een nieuwe 96-wells plaat met ronde bodem en plaats de plaat vervolgens in de flowcytometer. Scheid de enkelvoudige cellen van de dubletten met behulp van een forward scatter plot. Stel de gate in op de enkelvoudige RBC's en selecteer vervolgens het juiste detectiekanaal voor de fluorescentiesignalen. Kwantificeer de resultaten met behulp van de mediane fluorescentie-intensiteit voor kwantitatieve hemolytische analyse; verhit en activeer het serum van de patiënt en was de met romaine behandelde RBC's zoals zojuist gedemonstreerd.Incubeer vervolgens de RBC's met complement en patiëntenserum zoals zojuist gedemonstreerd, maar zonder anti-C5, en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 664 ×g met een verminderde vertraging. Draag daarna voorzichtig 90 µL supernatant over naar een nieuwe microtiterplaat, waarbij u erop let geen intacte cellen over te dragen en luchtbellen vermijdt, en meet vervolgens de absorptie bij 414 tot 690 nm in een spectrofotometer. Druk de hemolyse uit als een percentage van de lysis van een monster RBC's dat in puur water is geïncubeerd.In deze eerste figuur worden representatieve scatterplots getoond voor met brola behandelde RBC's; de geschikte gating voor enkele RBC's is hier te zien. Normaal gesproken valt ongeveer 95% van de RBC's binnen deze single cell gate. In deze histogrammen zijn representatieve resultaten te zien voor het effect van auto-immuun hemolytische anemia of aha.Patiëntserum op C4- en C3-depositie zijn weergegeven zoals verwacht; meer patiëntserum leidt tot meer complementdepositie. Opvallend is dat de complementdepositie in twee afzonderlijke positieve pieken voorkomt. Dit wordt waarschijnlijk niet veroorzaakt door heterogeniteit in de RBC-populatie, aangezien de RBC's afkomstig zijn van een enkele donor, hoewel de oorzaak van dit fenomeen nog steeds wordt onderzocht. De mediane fluorescentie-intensiteiten van de monsters zijn uitgezet in deze lijngrafieken om de reproduceerbaarheid van de C4- en C3-depositie-assays aan te tonen.Let op de grote variatie in de depositie van de verschillende AH H patiëntenmonsters. Ten slotte kunnen in deze grafieken gegevens worden waargenomen van een hemolytische assay van een ahha patiërensermonster dat auto-antilichamen tegen RBC's bevat. Titratie met het serummonster levert een duidelijke, reproduceerbare curve op met een geschikte complementremmer zoals anti C five.Het hemolytische signaal kan worden getitreerd, zoals gedemonstreerd in deze grafiek. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe complementactivatie door antilichamen die specifiek zijn voor rode bloedcellen kan worden gemeten, entweder door flowcytometrische analyse van C3- of C4-depositie of door een kwantitatieve hemolytische assay.

methods-for-quantitative-detection-antibody-induced-complement

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De klassieke route wordt geactiveerd door antilichaam en culmineert in target cel lysis. De...

Het meten van de 50% Hemolytische Complement (CH 50) Activiteit van Serum

Source: Nagre, N., et al. Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the assessment of complement receptor-mediated phagocytosis using sheep red blood cells opsonized with IgM and complement, followed by their uptake by mouse macrophages. The extent of phagocytosis is quantified by measuring a blue chromogenic product formed through hemoglobin-catalyzed oxidation of diaminofluorene.

Modeling Complement-Mediated Phagocytosis Using Opsonized Red Blood Cells In Vitro

This video demonstrates a technique to evaluate the complement-mediated bactericidal activity of antibodies present in serum. This approach combines isolated serum with pathogenic bacteria and exogenous complement proteins. Upon incubation, the bacteria are grown on an agar plate, and the produced colonies are quantified to measure the serum bactericidal titer.

A Serum Bactericidal Assay for the Complement-Mediated Bactericidal Activity of Antibodies

The video demonstrates a hemagglutination inhibition assay for detecting serum antibodies against specific antigens. Confirmation of hemagglutination inhibition in the test well and hemagglutination in the control well is achieved through distinct visual patterns. This assay plays a crucial role in assessing immune response, vaccine effectiveness, and studying viral infections in virology and immunology.

The Hemagglutination Inhibition Assay to Detect Serum Antibodies Against a Target Antigen

This video demonstrates an assay measuring the antibody-mediated activation of T cell effector functions. Adding an influenza virus hemagglutinin (HA)-specific monoclonal antibody to transfected mammalian cells expressing HA results in the formation of immune complexes with HA. Upon introducing engineered T cells expressing Fc receptors and a luciferase reporter, the T cells are activated by the antibody-HA complexes, and this activation is detected by adding a luciferase substrate and...

Measuring the Activation of Fc-Mediated Effector Functions by HA Antibodies

This video demonstrates an assay to measure the antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) by breast milk phagocytes. Fluorescently labeled microspheres conjugated to an antigen-antibody complex, are combined with a cell suspension isolated from breast milk to induce antibody-dependent cellular phagocytosis by the phagocytic leukocytes. Upon labeling the cells with antibodies against common leukocyte antigen (CD45), flow cytometry is used to measure the fluorescence intensity of...

An In Vitro Assay to Measure Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis by Phagocytes

De monocyt monolaag assay (MMA) is een in vitro assay dat geïsoleerde primaire monocyten gebruikt, verkregen uit perifeer vol bloed van zoogdieren, om Fcγ receptor (FcγR)-gemedieerde fagocytose te evalueren.

Toepassing van een monocyt monolaag Gehalte aan Fcy receptor-gemedieerde fagocytose evalueren

Hier beschrijven we methoden draaiende schijf confocale microscopie afbeelding één fagocytische gebeurtenissen via muis resident peritoneale macrofagen. De protocollen kunnen worden uitgebreid tot andere fagocytische cellen.

Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

Het doel van deze methode is om de CR1-dichtheid in de erytrocyten van elk onderwerp te bepalen door te vergelijken met drie proefpersonen waarvan de erytrocyten CR1-dichtheid bekend is. De methode maakt gebruik van flow cytometrie na immunostaining van de erytrocyten van de proefpersonen door een anti-CR1 monoklonale antilichaam gekoppeld aan een versterkt systeem met behulp van fycoerythrin (PE).

Het meten van Erythroocyte Complement Receptor 1 met behulp van Flow Cytometrie

Het vastleggen van dynamische veranderingen in de eiwitactivering van geënucleeerde rode bloedcellen brengt methodologische uitdagingen met zich mee, zoals het behoud van dynamische veranderingen in acute stimuli voor latere beoordeling. Het gepresenteerde protocol beschrijft monstervoorbereidings- en kleuringstechnieken die het behoud en de analyse van relevante eiwitveranderingen en daaropvolgende detectie mogelijk maken.

Op immunostaining gebaseerde detectie van dynamische veranderingen in rode bloedceleiwitten

We hebben verbeteringen en bijgewerkte methoden ontwikkeld voor de bestaande monocyt-monolaagtest (MMA), waarin macrofagen worden gebruikt om de klinische relevantie van allo-antilichamen van rode bloedcellen in transfusiegeneeskunde en immunologie beter te voorspellen. Deze test wordt de monocyt-macrofaagtest (M-MA) genoemd.

Voorspelling van de significantie van antilichamen tegen rode bloedcellen met behulp van de monocyt-macrofaagtest

Leer twee kwantitatieve assays voor complementactivatie door antilichamen op rode bloedcellen met flowcytometrie en spectrometrie. Deze methoden bieden verbeterde gevoeligheid voor diagnostische toepassingen.

Methoden voor de kwantitatieve detectie van antilichaam-geïnduceerde complement activatie op de rode bloedcellen

Meer video's verkennen