Methoden voor de kwantitatieve detectie van antilichaam-geïnduceerde complement activatie op de rode bloedcellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de activering van complement door antilichamen tegen rode bloedcellen of RBC's in patiëntenserum te beoordelen. Dit wordt bereikt door rode bloedcellen te incuberen met patiëntenserum in aanwezigheid van blokkerend anti C vijf-antilichaam om C vier en C3-afzetting op het oppervlak van de RBC's te induceren. Vervolgens worden de RBC's gekleurd met fluorescentie gelabelde anti C vier en anti C3-antilichamen, en de hoeveelheid complementafzetting op de RBC's kan vervolgens worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie in een alternatieve methode.

De RBC's worden geïncubeerd met patiëntenserum in afwezigheid van anti C vijf om complement-gemedieerde lysis te induceren. Het percentage gelyseerd RBC's kan vervolgens worden bepaald door de hoeveelheid hemoglobine die door de cellen wordt vrijgegeven te meten door spectrometrie. Het belangrijkste voordeel van deze nieuwe techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals de hemolyse of de antiglobulinetest die in routinediagnostiek wordt gebruikt, is dat deze kwalitatief van aard is en we kunnen suboptimale verschillen in complementactivering detecteren.

Elizabeth Brook postdoc in ons lab zal procedures demonstreren. Begin met het wassen van nul getypte rode bloedcellen drie keer met PBS, incubeer vervolgens de pellet in 0,5% Roma lane-oplossing met een verhouding van een tot twee gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Na het wassen van de cellen nog drie keer, bewaar ze als een 3% oplossing in vers PBS bij vier graden Celsius om complementafzetting op de RBC's te analyseren door middel van flowcytometrie. Verwarm eerst de gewenste hoeveelheid patiëntenserum gedurende 30 minuten bij 56 graden Celsius terwijl het serum wordt verwarmd. Was de brola-behandelde rode bloedcellen drie keer in Roal-buffer na de laatste wasbeurt.

Suspendeer het pellet in vbg plus plus met een 0,5% verdunning. Voeg vervolgens op een glazen parel 25 microliters van 0,5% RBC's toe, 37,5 microliters vers AB-serum en 37,5 microliters van 200 microgram per milliliter, anti C vijf toe aan elk putje van een 96-wells ronde bodemplaat. Voeg vervolgens het verwarmd ingeactiveerde patiëntenserum toe aan elk putje bij de juiste concentratie, aangevuld met verwarmd ingeactiveerd AB-serum indien nodig en inclusief een negatieve controle.

Gebruik VBG plus plus om elk putje tot een eindvolume van 150 microliters te brengen en incubeer vervolgens de plaat bedekt met E IA-folie gedurende anderhalf tot twee uur bij 37 graden Celsius met schudden na de incubatie. Was de cellen drie keer met PBS aangevuld met 0,5% BSA en label vervolgens de cellen met één microgram per milliliter. Een fluorescentie gelabelde anti C3 en anti C vier monoklonale antilichamen incuberen de cellen gedurende 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden, en na het wassen van de plaat drie keer, resuspendeer de RBC's in 150 microliters PBS plus 0,5% BSA per.

Breng de celsuspensies over naar een nieuwe 96-wells ronde bodemplaat en laad vervolgens de plaat in de flowcytometer, scheid de enkele cellen van de dubbels met behulp van een voorwaartse scatterplot. Stel de poort in op de enkele RBC's en selecteer vervolgens het juiste detectiekanaal voor de fluorescente signalen. Kwantificeer de resultaten met behulp van de mediaan van de fluorescentie-intensiteit voor kwantitatieve hemolytische analyse, verwarm en activeer het patiëntenserum en was de romaine-behandelde RBC's zoals net gedemonstreerd.

Vervolgens, na het incuberen van de RBC's met complement en patiëntenserum zoals net gedemonstreerd, maar zonder de anti C vijf, centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 664 GS met verminderde deceleratie. Breng vervolgens voorzichtig 90 microliters supernatant over naar een nieuwe microtiterplaat, zorg ervoor dat u de intacte cellen niet overbrengt en vermijd het creëren van luchtbellen, en meet vervolgens de absorptie bij een 4 14 tot zes 90 in een spectrofotometer express. De hemolyse als percentage van de lysis van een monster van RBC's geïncubeerd in zuiver water.

In deze eerste figuur worden representatieve scatterplots voor brola-behandelde RBC's getoond, geschikte gating voor enkele RBC's kan hier worden gezien. Typisch valt ongeveer 95% van de RBC's binnen deze enkele cel-gating. In deze histogrammen zijn representatieve resultaten voor het effect van auto-immuun hemolytische anemie of aha.

Patiëntenserum op C vier en C3-afzetting wordt getoond zoals verwacht, meer patiëntenserum leidt tot meer complementafzetting. Opmerkelijk is dat de complementafzetting plaatsvindt in twee verschillende positieve pieken. Dit wordt waarschijnlijk niet veroorzaakt door heterogeniteit in de RBC-populatie, aangezien de RBC's van één donor zijn afkomstig, hoewel de oorzaak van dit fenomeen nog wordt onderzocht, de mediaan van de fluorescentie-intensiteiten van de monsters worden weergegeven in deze lijngrafieken om de reproduceerbaarheid van de C vier en C3-afzettingsassays te tonen.

Let op de grote variatie in de afzetting van de verschillende AH H patiëntmonsters. Ten slotte kunnen gegevens van een hemolytische test van een ahha-patiëntserumpatroon dat auto-antilichamen tegen RBC's bevat, worden waargenomen in deze grafieken. Titratie met het serummonster levert een duidelijke reproduceerbare curve op met een geschikt complementremmer zoals anti C vijf.

Het hemolytische signaal kan worden getitreerd zoals gedemonstreerd in deze grafiek. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe complementactivering door rode bloedcelspecifieke antilichamen kan worden gemeten, hetzij door middel van flowcytometrische analyse van C3 of C vier-afzetting of door kwantitatieve hemolytische test.