Name: Analyse van de translatie-initiatie tijdens stress Voorwaarden door polysome Profiling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Leer polysome profiling om stresseffecten op translatie-initiatie in zoogdiercellen te analyseren met sucrosegradiëntcentrifugatie en western blot. Deze methode biedt inzicht in ribosoomactiviteit onder stress.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PA is een ontvanger van een beurs &quot;Pierre Durand&quot; van de faculteit geneeskunde van de Universite Laval. Dit werk werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (MOP-CG095386) naar RM De polysome fractionator werd verworven door een Canadese Stichting voor Innovatie subsidie ​​(MOP-GF091050) naar RMR M heeft een nieuw CIHR onderzoeker salaris award. We zijn dankbaar voor Drs. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di-Marco en A. Cammas voor nuttig advies.

Het protocol volgt de richtlijnen goedgekeurd door Laval Ethical Review Board. 1. Voorbereiding van de celculturen en Brain Manipulatie <ol><li> Zoogdier-en Drosophila Cellen <ol><li> Grow HeLa cervicale kankercellen en Schneider Drosophila embryonale cellen, zoals aanbevolen door de American Type Culture Collection. Werken met cellen bij een lage doorgang. </li><li> Cellaag om 80% confluentie op de dag van het experiment bereiken. Voor het beste resultaat, gebruik ~ 12 x 10 6 cellen voor elke experimentele conditie. Alvorens extracten polysome analyse stimuleren vertaling door toevoegen van verse compleet medium gedurende ten minste 90 minuten. </li></ol></li><li> Isolatie Brain: Isoleer hersenen van muizen tussen 9 en 16 dagen na de geboorte jaar. Euthanasie gaat CO 2 inhalatie na de anesthesie en cervicale dislocatie. Na opoffering, isoleren van de hele hersenen en beide plaatsen it bij -80 ° C of direct overdragen in koud PBS 1X voor onmiddellijk gebruik. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Density Gradient Fractionation System <ol><li> Was het buissysteem met 0,1% SDS gedurende 5 minuten. </li><li> Was het buissysteem met 70% ethanol gedurende 5 minuten, daarna met RNaseZAP oplossing gedurende 5 minuten voor wassen met DEPC water. </li><li> Pomp lucht om het buissysteem van de inrichting te drogen. </li></ol> 3. Voorbereiding van de sucrosegradiënten <ol><li> Voeg 15% en 55% sucrose oplossing in 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,25 mM MgCl2, 150 mM NaCl en 1 mM DTT. </li><li> Genereer de lineaire 15-55% sucrose gradiënt met een Isco Model 160 gradiënt eerstgenoemde, zoals beschreven in de instructies van de fabrikant. Het is echter belangrijk om goed beheersen de TRIS peristaltische pompsnelheid om vorming van luchtbellen of turbulenties in de gradiënten voorkomen. Houd de gradiënten bij 4 ° C tot gebruik. </li><li> Gedurende de tijd dat het verloop maker programma draait Koel de ultracentrifuge bij 4 ° C. </li></ol> 4. Voorbereiding van de Cel en Mouse Brain Extracten <ol><li> Bereiding van celextracten <ol><li> Plaats plaat (s) op ijs en wassen cellen 3x met koude PBS 1X. </li><li> Oogst cellen (~ 12 x 10 6) in 1 ml lysisbuffer (20 mM Tris-HCl bij pH 7,4, 1,25 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% Nonidet P40, 5 U / ml RNase inhibitor, aangevuld met een complete mini-EDTA-vrije proteaseremmer cocktail tabletten), overzetten naar een Eppendorf buis, en meng goed door ze 15x via een 1cc U100 insulinespuit 28 G 1/2. Laat het cellysaat rusten op ijs gedurende 15 minuten. </li><li> Doe enkele druppels cellysaat op een dia te celafbraak beoordelen door het observeren bij een fase-contrast microscoop met een 10x doelstelling. Alleen kernen moet zichtbaar zijn en geen celmembranen moet zichtbaar officieel te bevestigen voor cellysis zijn. Als een controle, observerengelyseerde cellen. </li><li> Verduidelijken cellysaat door centrifugatie bij 11.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en houd de oplosbare lysaat bevattende het polyribosomen. </li></ol></li><li> Voorbereiding van de hersenen van muizen Extracten <ol><li> Homogeniseer de gehele hersenen geïsoleerd (-500 mg) met 10 slagen in een ijskoud Dounce homogenisator met 2 ml lysis buffer en het homogenaat verduidelijkt door centrifugatie bij 11.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Laad het resulterende supernatant op een kussen van 50% sucrose en vul sedimentatie gedurende 2 uur bij 200.000 xg met een ultracentrifuge rotor TH-641 bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de pellet met de doorschijnende polyribosomen in 1 ml lysis buffer en meng goed door en neer te pipetteren. Laat de schorsing rust op het ijs gedurende 30 minuten vóór het laden op hellingen. </li></ol></li></ol> 5. Het laden van de Extracten op sucrosegradiënten en Ultracentrifugatie <ol><li> Meet de concentratieRNA aanwezig in de cytoplasmatische extract met een spectrofotometer. Voorzichtig en langzaam laden ~ 20 OD 260 eenheden van het extract op de 15% tot 55% sucrose gradiënt. Zorg ervoor dat er 2-3 mm van de beschikbare ruimte op het oppervlak van de buis te voorkomen overlopen de buizen tijdens het centrifugeren. </li><li> Centrifugeer de hellingen met een ultra-centrifuge gedurende 2 uur 30 min bij 230.000 xg met een ultracentrifuge rotor TH-641 bij 4 ° C. Bij centrifugeren eindigt, verwijder de buizen en leg ze op ijs voorzichtig de hellingen niet te verstoren. </li></ol> 6. Fractionering van Cytoplasmatische Extracten voor polysomen Profiling <ol><li> Plaats sucrose gradiënten van dichtheid fractionering Automated System en de procedure geautomatiseerde fractionering en verzameling van fracties (elk 0,5 ml), zoals beschreven door de fabrikant. </li><li> Verzamel elke fractie (~ 500 ul) in afzonderlijke Eppendorf buizen met continue monitoring van de absorptie bij 254 nm. In parallel van de gradiënt fractionering operatie, zal de polyribosomal profiel worden bewerkt op de grafiek papier. U kunt ook een data-acquisitie-unit aangesloten op de chart recorder om een ​​elektronische overname van de polysome profiel hebben. </li><li> Aan het einde van elke run, overdragen verzameld eppendorfs op droog ijs. Op dit moment, hetzij opslag verzamelde fracties bij -80 ° C of direct neerslaan eiwit-RNA-complexen als volgt. </li></ol> 7. Proteïne extractie en analyse <ol><li> Aan elke verzamelde fractie sucrose gradiënt, voeg 2 volumes 100% koude ethanol en laat RNA-eiwitcomplexen precipiteren bij -20 ° C overnacht. </li><li> Centrifuge elk RNA-eiwit neerslag bij 11.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C daarna wassen met 70% ethanol. Droog en resuspendeer de neerslag in SDS-PAGE monsterbuffer alvorens Western blot met specifieke antilichamen (zie figuur 2). </li></ol> 8. RNA-extractie en Analyse <ol><li> Neerslaan RNA-eiwit complexen als in hoofdstuk 7.1. Resuspendeer elk RNA-eiwit neerslag in de lysis buffer die 0,1% SDS. Digest de eiwitcomponent van het neerslag met 2 mg / ml proteïnase K gedurende 30 min in een 55 ° C waterbad. </li><li> Extract RNA onderdelen van het neerslag door toevoeging van 1 volume &quot;fenol: chloroform&quot;, 2 volumina chloroform en 0,1 volume 2 M NaOAc pH 4 en centrifugeren bij 10.000 xg bij 4 ° C gedurende 20 minuten. Precipitaat RNA uit de resulterende waterige fase van elk monster gedurende de nacht bij -20 ° C door toevoeging van 1 volume isopropanol en 0,2 ug / ul glycogeen. Draai de neerslag gedurende 1 uur bij 10.000 xg bij 4 ° C. Was de RNA pellet met 70% koude ethanol. </li><li> Resuspendeer de RNA pellet in een klein volume van RNAse vrij water. Beoordeel de hoeveelheid en kwaliteit RNA met de spectrofotometer. </li></ol>

<ol><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Fournier, M. -J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell International. 10 (12), (2010).</li>
<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+Mental+Retardation+protein+determinants+required+for+its+association+with+polyribosomal+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs.</a> Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).</li>
<li>Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Metazoan+stress+granule+assembly+is+mediated+by+P-eIF2alpha-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms.</a> RNA. 15 (10), New York, N.Y. 1814-1821 (2009).</li>
<li>Gareau, C., Houssin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fragile+x+mental+retardation+protein+recruitment+and+dynamics+in+Drosophila+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules.</a> PLoS ONE. 8 (2), (2013).</li>
<li>Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMR1+transcript+isoforms%3A+association+with+polyribosomes%3B+regional+and+developmental+expression+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain.</a> PLoS ONE. 8 (3), (2013).</li>
<li>Khandjian, E. W., Huot, M. -E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+the+association+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+brain+polyribosomal+ribonucleoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).</li>
<li>Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+gene+expression+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neuropsychopharmacol+Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Translational control of gene expression in the human brain.</a> Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).</li>
<li>Stephens, S. B., Nicchitta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+In+vitro+and+tissue+culture+methods+for+analysis+of+translation+initiation+on+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum.</a> Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).</li>
<li>Koritzinsky, M., Wouters, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+regulation+of+messenger+RNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and regulation of messenger RNA translation.</a> Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).</li>
<li>Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes.</a> Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).</li>
<li>Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+slowdown+mediates+translational+arrest+during+cellular+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).</li>
<li>Thomas, J. D., Johannes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mRNAs+that+continue+to+associate+with+polysomes+during+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia.</a> RNA. 13, 1116-1131 (2007).</li>
<li>Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+gene+translation+profiles+reveal+tumor+type+and+cancer-specific+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components.</a> Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).</li>
<li>Fournier, M. -J., Coudert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+mTORC1-eIF4E+Pathway+alters+Stress+Granules+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).</li>
<li>Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+survival+motoneuron+protein+as+a+translational+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator.</a> Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).</li>
<li>Béchade, C., Rostaing, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+distribution+of+survival+motor+neuron+%28SMN%29+protein%3A+possible+involvement+in+nucleocytoplasmic+and+dendritic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport.</a> The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).</li>
<li>Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDRD3%2C+a+novel+Tudor+domain-containing+protein%2C+localizes+to+cytoplasmic+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules.</a> Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).</li>
<li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+let-7a+miRNA+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).</li>
<li>Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+analyse+the+specific+impact+of+rapamycin+on+mRNA-ribosome+association%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association.</a> BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).</li>
<li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).</li>
<li>Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+footprints+on+a+transcriptome+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal footprints on a transcriptome landscape.</a> Genome Biology. 10 (4), (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De polysome profielanalyse op sucrosegradiënten maakt meting van translatie-initiatie door het analyseren van de dichtheid van polysomen geïsoleerd uit cellen of weefsels 9,11-14. Deze techniek is de beste (zo niet de unieke) benadering van de translatie-initiatie in vivo te meten. Het wordt gebruikt om de translationele positie van groeiende cellen tijdens de celcyclus 15 volgen en de effecten van verschillende soorten stress zoals virale infecties, hypoxie 13,16, 17 straling e...

Eukaryote cellen voortdurend geconfronteerd met een aantal schadelijke fysiologische en ecologische stress omstandigheden die een snelle adaptieve cel respons vereisen. Cell spanningsreactie impliceert een nauwkeurige balans tussen anti-overleving en pro-survival werkende factoren. Het verstoren van dit evenwicht kan onomkeerbare gevolgen leiden van de ontwikkeling van de menselijke ziekten zoals kanker en neurodegeneratieve ziekten. Tijdens de eerste stap van de reactie op stress, cellen activeert pro-overleving routes die de gecoördineerde beheersing van veranderingen in genexpressie op het niveau van mRNA translatie omvatten. mRNA translatie bij eukaryoten is een complexe cellulaire proces dat gecoördineerde interactie tussen translatie initiatie factoren (EIFS), specifieke RNA-bindende eiwitten (SGD&#39;s), en RNA-moleculen 1 gaat. mRNA translatie is verdeeld in drie afzonderlijke fasen: initiatie, elongatie, en beëindiging. Hoewel alle drie de fasen zijn onderworpen aan Verordeninggevende mechanismen, translationeel controlemechanismen richten meestal de initiatieffase van de vertaling, die dus vormt de snelheidsbeperkende stap van eiwitsynthese 2. Translatie initiatie is een sterk geordende proces dat begint met de vorming van de eIF2a.GTP.Met-tRNA i Met ternaire complex en de daaropvolgende binding aan de 40S ribosoom subeenheid, leidt tot de vorming van het pre-initiatie complex. De volgende stap is de rekrutering van de preinitiation complex mRNA, die de activiteit van translatie initiatie factoren zoals eIF4F en eIF3 omvat. De aldus gevormde 48S preinitiation complex ondergaat specifieke conformationele verandering die dit mechanisme mogelijk te beginnen met het scannen van de 5&#39;-niet getranslateerde gebied van het mRNA totdat het startcodon AUG herkent. Het merendeel van de translatie initiatie factoren worden losgelaten en 60S subeenheden worden gerekruteerd voor een 80S vormen ribosoom complex bevoegd voor vertaling, eent welk punt eiwitsynthese gestart (figuur 1). Meer dan een 80S monosome kan vertalen hetzelfde mRNA tegelijk produceren van zogenaamde polysomen (of polyribosomen). De dichtheid van polysomen op mRNA weerspiegelt de initiatie, verlenging en beëindiging prijzen en is dus een maat voor de vertaalbaarheid van een bepaald transcript. Echter, polysoom profiel hoofdzakelijk gebruikt om veranderingen in mRNA translatie beoordeeld op de initiatie stap. Hier hebben wij een proteasoom inhibitor translatie initiatie remmer gebruikt. De behandeling van kankercellen met het medicijn veroorzaakt een stressreactie gekenmerkt door activering van de stress kinase genaamd HRI die de translatie initiatie factor eIF2a 3 fosforyleert. Fosforylering van eIF2a is een van de belangrijke gebeurtenissen die leiden tot de remming van translatie initiatie in zoogdiercellen 4.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cellen</td></tr><tr><td>HeLa-cellen van baarmoederhalskanker</td><td>American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Schneider Drosophila embryonale cellen</td><td>American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CRL-1963</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kweekmedium en supplementen</td></tr><tr><td>Schneider&rsquo;s Drosophila Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SO146-500ml</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>11995-073</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientist Scientist</td><td>SH30396-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Life technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sucrose-oplossingen</td></tr><tr><td>D-sucrose</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP220-212</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Broomfenolblauw</td><td>Fisher Scientist</td><td>B3925</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Lysebuffer</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tekniscience</td><td>3624-05</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 9779</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (Igepal CA-630 )</td><td>MJS Biolynx</td><td>19628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Tekniscience</td><td>4095-02</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNase-remmer (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor)</td><td>Life technologies</td><td>10777-019</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Antiproteasen (compleet, mini, EDTA-vrij)</td><td>Roche</td><td>11,836,170,001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA-extractie</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Life technologies</td><td>AM2542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fenoel:chloroform</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP1754I-400</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientist</td><td>C298-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Life technologies</td><td>10814-010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros organics</td><td>327270010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Antilichamen</td></tr><tr><td>anti-FMRP-antilichaam</td><td>Fournier et al., Cancer Cell International, 2010</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

analyse van de translatie-initiatie tijdens stress voorwaarden door polysome profiling

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Nauwkeurige controle van mRNA translatie is fundamenteel voor eukaryote cel homeostase, met name in reactie op fysiologische en pathologische stress. Veranderingen van dit programma leiden tot de groei van beschadigde cellen, een kenmerk van kankerontwikkeling of voortijdige celdood zoals gezien in neurodegeneratieve aandoeningen. Veel van wat bekend is over de moleculaire basis voor translationele controlesignalen afkomstig is van polysome analyse met behulp van een dichtheidsgradiënt fractionering systeem. Deze techniek berust op ultracentrifugatie van cytoplasmatische extracten op een lineaire sucrose gradiënt. Wanneer de rotatie is voltooid, maakt het systeem fractionering en kwantificeren gecentrifugeerd zones die overeenkomen met verschillende vertalen ribosomen populaties, hetgeen resulteert in een polysome profiel. Veranderingen in de polysome profiel duiden op wijzigingen of defecten in translatie initiatie die optreden als gevolg van verschillende soorten stress. Deze techniek maakt het ook mogelijk om e te beoordelene rol van specifieke eiwitten op translatie-initiatie, en translationele activiteit van specifieke mRNA&#39;s te meten. Hier beschrijven we protocol polysome profielen voeren om translatie-initiatie van eukaryote cellen en weefsels te analyseren onder normale of spanning groeiomstandigheden.

Zoals vermeld polysoom profiel maakt de analyse van veranderingen van translatie initiatie onder stressomstandigheden. Figuur 1 is een vereenvoudigd aanzicht van translatie initiatie die als eerder een meerstaps proces waarbij een geordend samenstel van translatie initiatie complexen beschreven. Onder normale groeiomstandigheden, zijn translatie initiatie complexen omgezet in polyribosomen wiens opsporing door polysome profiel getuigen voor een actieve translatie initiatie (figuur 2; On...

Hier beschrijven we een werkwijze veranderingen in de initiatie van mRNA translatie van eukaryote cellen in reactie stresssituaties analyseren. Deze methode is gebaseerd op de snelheid scheiding op sucrosegradiënten vertalen ribosomen van niet-translating ribosomen.

Analyse van de translatie-initiatie tijdens stress Voorwaarden door polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Het algemene doel van deze procedure is om de effecten van stresscondities op de translatie en initiatie van zoogdiercellen en -weefsels te meten via polysoomprofilering. Dit wordt bereikt door eerst kankercellen van zoogdieren te behandelen met een antikanker-medicijn en vervolgens celextracten voor te bereiden. De tweede stap is het maken van sucrosegradiënten.Vervolgens worden de cel-extracten op de sucrosegradiënten geladen en ultracentrifuged om de ribosomale fracties te scheiden. Ten slotte wordt een western blot-analyse met specifieke antilichamen uitgevoerd om de associatie van de geteste eiwitten met polysomen te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals metabole labeling, is dat het ons in staat stelt het effect van stresscondities op de initiatiestap van de translatie te beoordelen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van stress-therapie, zoals de vraag of en hoe antikankergeneesmiddelen de translatie-initiatie beïnvloeden. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot cancertherapie, omdat het helpt bij het onthullen van nieuwe regulatoire routes van translatie-initiati

analysis-translation-initiation-during-stress-conditions-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een protocol voor de extractie van het vertalen van ribosomen van eukaryotische cellen. Eenmaal uitgepakt, worden ribosomen gescheiden in monosomes en polyribosomes door sucrose gradiënt fractionering om verschillende ribosomale populaties te analyseren. Als zodanig is deze methode is de gouden standaard voor de behandeling van de regulering van de vertaling.

Eukaryotische Polyribosome Profiel Analyse

Ribosomen spelen een centrale rol in de eiwitsynthese. Polyribosome (polysome) fractionering van sucrose dichtheidsgradiëntcentrifugatie maakt een directe bepaling van de vertaling efficiëntie van de individuele mRNA's op een genoom-brede schaal. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor biochemische analyse van de ribosoom-en-polysome geassocieerde factoren zoals chaperonnes en signaalmoleculen.

Polysome fractionering en analyse van zoogdieren Translatomes op een genoom-brede schaal

Het vermogen van cellen om zich aan stress aan te passen is cruciaal voor hun overleven. Regulatie van mRNA-translatie is een van deze aanpassingsstrategieën, die zorgt voor een snelle regulering van het proteoom. Hier bieden we een gestandaardiseerd polysoomprofileringsprotocol om specifieke mRNA's te identificeren die selectief worden getransleerd onder stressomstandigheden.

Beoordeling van Selectieve mRNA Vertaling in zoogdiercellen door polysoom Profiling

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om transcripten uit plantweefsels te extraheren en te fractoneren op basis van het aantal gebonden ribosomen. Het maakt een globale schatting van de translatieactiviteit mogelijk en de bepaling van de translationele status van specifieke mRNA's.

Een eenvoudige methode voor Plant polysoomdisplays Profiling

Translationeel verordening speelt een belangrijke rol in de controle van eiwitten overvloed. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor de kwantitatieve analyse van vertaling in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae.

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Toeprinting wil het vermogen meten van in vitro Getranscribeerd RNA naar formulier vertaling initiatie complexen met ribosomen onder een aantal voorwaarden. Dit protocol wordt een methode beschreven voor de toeprinting zoogdieren RNA en kan worden gebruikt voor het bestuderen van de GLB-afhankelijke zowel IRES gestuurde vertaling.

Toeprinting analyse van vertaling initiatie complexvorming op zoogdieren mRNAs

Het algemene doel van Polysoom profiling techniek is analyse van translationeel activiteiten van individuele mRNAs of transcriptome mRNAs tijdens de eiwitsynthese. De methode is belangrijk voor de studie van eiwit synthese verordening, vertaling activering en onderdrukking in gezondheid en meerdere ziekten bij de mens.

Polysoom profilering in Leishmania, menselijke cellen en muis Testis

De ontwikkeling van het zoogdierbrein vereist een goede controle van genexpressie op het niveau van vertaling. Hier beschrijven we een polysoomprofileringssysteem met een eenvoudig te assembleren sucrose gradiëntvormings- en fractioneringsplatform om de translationele status van mRNAs in de zich ontwikkelende hersenen te beoordelen.

Analyse van vertaling in de zich ontwikkelende muishersenen met behulp van polysoomprofilering

We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

Dit protocol beschrijft hoe u een polysoomprofiel kunt genereren zonder gebruik te maken van geautomatiseerde gradiëntmakers of gradiëntfractioneringssystemen.

Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen

Het hier gepresenteerde protocol omvat polysomale profilering om translatom, mRNA's geassocieerd met ribosomen, te isoleren in niet-polysomale en polysomale RNA's van Arabidopsis door middel van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze methode toont de translatie-efficiëntie van hitte-gestreste Arabidopsis.

Translatie-efficiëntietest met behulp van polysoomprofielen onder hittestress

Leer polysome profiling om stresseffecten op translatie-initiatie in zoogdiercellen te analyseren met sucrosegradiëntcentrifugatie en western blot. Deze methode biedt inzicht in ribosoomactiviteit onder stress.

Analyse van de translatie-initiatie tijdens stress Voorwaarden door polysome Profiling

Meer video's verkennen