Analyse van de translatie-initiatie tijdens stress Voorwaarden door polysome Profiling

Het algemene doel van deze procedure is om de effecten van stressomstandigheden op translatie, initiatie van zoogdiercellen en -weefsels te meten door middel van polysoomprofilering. Dit wordt bereikt door eerst zoogdierkankercellen te behandelen met een middel tegen kanker en vervolgens celextracten te bereiden. De tweede stap is het maken van sucrose-gradiënten.

Vervolgens worden de celextracten geladen op de sucrose-gradiënten en ultracentrifugeerd om ribosoomfracties te scheiden. Uiteindelijk wordt western blot-analyse uitgevoerd met behulp van specifieke antilichamen om de associatie van geteste eiwitten met polysoom te beoordelen. Het grote voordeel van deze techniek van een bestaande methode zoals metabolisch labelen, is dat het ons in staat stelt om het effect van stressomstandigheden op de initiatiefase van translatie te beoordelen.

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van stresstherapie, zoals of en hoe middelen tegen kanker de translatie-initiatie beïnvloeden. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot kankertherapie omdat het helpt om nieuwe regulatoire paden van translatie-initiatie te onthullen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de regeling van translatie-initiatie in celculturen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals geïsoleerde weefsels, inclusief hersenen en tumoren.

Om het geautomatiseerde dichtheidsgradiënt-fractioneringssysteem voor te bereiden, spoelt u eerst het buissysteem van het apparaat vijf minuten lang met 0,1%SDS. Was vervolgens het buissysteem vijf minuten lang met 70%ethanol, gevolgd door RNA Zap-oplossing gedurende vijf minuten. En tenslotte droogt u het buissysteem door lucht in het systeem te pompen met DEPC, water.

Bereidt vervolgens 15% en 55% Sucrose-oplossingen voor om de lineaire 15 tot 55% sucrosegradiënt te genereren met behulp van een ISCO model one 60 gradiëntvormer. Volg de instructies van de fabrikant, het is belangrijk om de snelheid van de tris-peristaltische pomp zorgvuldig te regelen om het creëren van luchtbellen of turbulentie in de gradiënten te voorkomen tijdens de tijd dat het gradiëntmakerprogramma actief is. Koel de ultracentrifuge af tot vier graden Celsius. Bewaar de gradiënten op vier graden Celsius tot gebruik. Dit experiment maakt gebruik van lage passage helo-cervicale kankercellen die eerder zijn geplaatst om 80% confluentie te bereiken.

Op de dag van het experiment. Het is belangrijk om extracties te maken van verse cellen en om RNA-besmetting tijdens deze procedure te voorkomen, vervang 90 minuten voor het toevoegen van het middel tegen kanker het medium van de cellen met vers, compleet medium. Om translatie te stimuleren, brengt u de cellen terug naar de incubator.

Voeg het middel tegen kanker rechtstreeks toe aan de celcultuur als controle. Voeg DMSO toe en incubeer gedurende vier uur bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide. Na vier uur plaatst u de platen op ijs en wast u de cellen drie keer met koud PBS. Oogst cellen in één milliliter lyseerbuffer voor de beste resultaten. Gebruik ongeveer 12 miljoen cellen voor elke experimentele conditie.

Breng cellen over van geschraapte platen naar een einorbuis en meng goed door ze 15 keer door een spuit te laten passeren. Laat de cellysaat op ijs rusten gedurende 15 minuten. Plaats vervolgens een paar druppels cellysaat op een glazen plaatje en beoordeel cellulaire lysis door fasecontrastmicroscopie met behulp van een 10 x objectief.

Zodra cellysis is bevestigd, verduidelijkt u de cellysaat door centrifugatie bij 11.000 Gs gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Breng het oplosbare lysaat dat de polyribosomen bevat over naar een nieuwe buis en bewaar deze op ijs voordat u de cytoplasmatische extracten op sucrosegradiënten laadt. Meet de concentratie van aanwezig RNA met behulp van een spectrofotometer en laad zorgvuldig en langzaam ongeveer 20 OD twee 60 eenheden van het extract op de 15 tot 55% sucrosegradiënt.

Zorg ervoor dat er twee tot drie millimeter beschikbare ruimte is aan het oppervlak van de buis om te voorkomen dat de buis tijdens centrifugatie overloopt. Laad de buizen op de rotor. Plaats de rotor op de ultracentrifuge en centrifugeert de gradiënten bij 230.000 Gs bij vier graden Celsius gedurende twee uur en 30 minuten.

Wanneer de centrifugatie voltooid is, verwijdert u de buizen en plaatst u ze voorzichtig op ijs zonder de gradiënten te verstoren. Om de fractieverdeling van de cytoplasmatische extracten te beginnen, plaatst u de sucrosegradiënten op een geautomatiseerd dichtheidsgradiëntsysteem en gaat u verder met geautomatiseerde fractieverdeling en verzameling van fracties zoals beschreven door de fabrikant. Verzamel elke fractie van 0,5 milliliter in individuele einorbuizen met continue bewaking van absorptie bij 250 nanometer parallel aan de gradiëntfractieverdelingsbewerking, de polyribosoomprofiel zal aan het einde van elke run worden bewerkt op het diagrampapier.

Breng eindbuizen met verzamelde fracties over op ijs. Om deze procedure te beginnen, voegt u twee volumes 100% koud ethanol toe aan elke verzamelde fractie en laat de RNA-eiwitcomplexen overnacht bij min 20 graden Celsius neerslaan. Voor extractie van eiwitten, centrifugeert u elk RNA-eiwitprecipitaat bij 11.000 Gs gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius na het wassen met 70% ethanol. Laat het luchtdrogen en resuspendeer het precipitaat.

Een SDS-pagina-monsterbuffer Voordat u doorgaat met western blot-analyse voor extractie van RNA Resus, suspendeert u elk RNA-eiwitprecipitaat in lyseerbuffer die 0,1%SDS bevat. Digest een eiwitcomponent van het precipitaat met twee milligram per milliliter proteinase K gedurende 30 minuten. In een 55% Celsius waterbad, voegt u één volume fenolchloroform toe, twee volumes chloroform en 0,1 volume van twee molaarse natriumacetaat pH vier. Laat het 15 minuten op ijs rusten.

Centrifugeer bij 10.000 GS bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Verzamel de resulterende water