Verminderde Itraconazol Concentratie en duur succesvol zijn in het behandelen van
14 maart 2014
Batrachochytrium dendrobatidis infectie bij amfibieën kan worden geëlimineerd met behulp van een verminderde concentratie (0.0025%) en de kortere duur (vijf minuten baden voor zes dagen) van itraconazol dan algemeen wordt gebruikt. Minder sterfte en minder negatieve bijwerkingen werden waargenomen met behulp van deze aangepaste behandeling protocol.
Het algemene doel van deze procedure is om amfibieën die besmet zijn met de amfibieën-chytridschimmel, Bera key tridium, dendro, he of BD, te behandelen met de antifungale chemotherapie triazole. Dit wordt bereikt door eerst BD-culturen te kweken en dieren te inoculeren met de schimmelpathogeen. De tweede stap is om de dieren te testen met behulp van DNA-extractie en QPCR op huidswabs om BD-infectie te bevestigen.
Vervolgens worden de geïnfecteerde dieren behandeld door ze vijf minuten per dag gedurende zes dagen te baden in een 0,0025% econazol-oplossing. De laatste stap is het monitoren van de infectiestatus van de behandelde dieren door middel van QPCR-analyse van huidswaps gedurende minimaal vier weken na voltooiing van de behandeling om een succesvolle behandeling van het dier te garanderen; deze procedure aantoont dat een lagere concentratie en een kortere behandelingstijd van het antischimmelmiddel itraconazol effectief zijn voor de behandeling van dieren die geïnfecteerd zijn met bd. Het belangrijkste voordeel van dit behandelingsschema ten opzichte van de aanbevolen behandelingsdosis, namelijk een 0,01% itraconazol-oplossing gedurende 11 dagen, is dat een gereduceerde concentratie van een kwart van die aanbevolen dosis en een verkorte behandelingstijd van zes dagen nog steeds effectief zijn bij het genezen van BD-infectie, terwijl tegelijkertijd de negatieve bijwerkingen van de aanbevolen behandelingsdosis worden geminimaliseerd.
Nadat de BD is geïncubeerd in tritone-bouillon zoals beschreven in het tekstprotocol en de beweging van de Zo-sporen is gecontroleerd, wordt elke plaat gevuld met vijf milliliters gekeld kraanwater. Wacht 10 minuten om de Zo-sporen de kans te geven het medium binnen te dringen. Giet vervolgens de Zo-sporensuspensie in een draagbare container. Schat de Zo-sporenconcentratie met een hemocytometer en verdun het mengsel met gekeld kraanwater tot een concentratie van 1 x 10⁶ per drie milliliters om een dier te inoculeren, zoals de hier getoonde Latoria vei Alpina.
Houd het dier boven een reservoir van 50 milliliter en giet drie milliliter van het inoculummengsel over de venter. Plaats het dier vervolgens samen met het overgebleven inoculum in het reservoir. Plaats een deksel op het reservoir en laat het dier gedurende 24 uur in de inoculatiecontainer om infectie te waarborgen.
Om contaminatie met het BD-pathogeen te voorkomen, worden de oude handschoenen verwijderd en klaargezet voor autoclaveren voorafgaand aan de afvoer. Trek na het aantrekken van een nieuw paar handschoenen verder door met de inoculatie van het volgende dier.
Plaats de dieren na 24 uur na inoculatie gedurende twee weken terug in hun individuele gedesinfecteerde terraria. Vergeet niet al het vloeibare afval vóór verwijdering te desinfecteren door de oplossing na twee weken aan te vullen tot 10% bleekmiddel. Test op een succesvolle BD-infectie door de dieren af te nemen met een steriele wattenstaaf.
Draai het wattenstokje voorzichtig tijdens en tussen de streken. Veeg vijf keer over de ventrale zijde aan elke kant, elk dijbeen en elk van de vier ledematen, voor een totaal van 45 streken. Bewaar de wattenstokjes in 1,5 milliliter microbuisjes bij -20 °C.
Extraheer het genomische DNA uit de swabs met behulp van een commercieel verkrijgbare DNA-isolatiekit en voer QPCR uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid drie behandelbaden voor, één voor elk van de drie doseringen itraconazol, zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats vervolgens individuele amfibieën in gedesinfecteerde
Containers van 50 milliliter met 35 milliliter van de behandelingsoplossing. Vergeet niet de handschoenen tussen de dieren door te wisselen en schud de container af en toe voorzichtig om ervoor te zorgen dat de dieren vijf minuten lang volledig bedekt zijn. Keer de dieren na vijf minuten terug naar hun gedesinfecteerde gebied.
Herhaal de behandeling van vijf minuten dagelijks gedurende nog eens vijf dagen. Test de dieren een week na voltooiing van de behandeling opnieuw op BD-infectie en daarna eenmaal per week gedurende vier weken om te bevestigen dat de infectie is verdwenen. Let erop dat de dieren, zelfs na voltooiing van de behandeling, behandeld moeten worden alsof ze nog steeds een contaminatierisico vormen.
De dieren moeten gedurende ten minste één maand na infectie in een apart gebied worden gehouden. Als de behandeling geen succes heeft, moet deze worden herhaald. Verschillende soorten en verschillende levensstadia reageren verschillend op infectie en op behandelingsregimes; daarom moet de behandeling eerst worden getest voordat deze op grote schaal wordt geïmplementeerd.
Aangezien BD een biologisch gevaar vormt, dient men de individuele terraria wekelijks te desinfecteren door de terraria en behandelcontainers te baden in een 10% bleekoplossing. Laat ze gedurende ten minste 30 seconden weken, spoel de bleek weg met twee spoelbeurten met water en laat de containers 24 uur drogen voordat ze opnieuw worden gebruikt voor de overleving van kikkers. Hier worden 11 dagen van BD-behandeling of zes dagen van BD-behandeling getoond.
De zwarte pijlen geven de laatste dag van de behandeling aan. De doorgetrokken lijnen geven de overleving van de controlegroepen aan. De doorgetrokken zwarte lijnen zijn voor dieren die BD-positief waren maar geen BD-behandeling hebben ontvangen.
En de doorlopende grijze lijnen zijn voor dieren die BD-negatief waren en geen BD-behandeling ontvingen. De stippellijnen tonen de overleving van behandelingsgroepen die de aangegeven concentratie econazol ontvingen. Alle dieren die zes dagen lang via een nebulisator met 0,0025% werden behandeld, waren vier weken na afloop van de behandeling BD-negatief, waardoor deze behandeling als succesvol werd beschouwd.
Daarnaast vertoonde deze dosering van econazole-behandeling geen significante verschillen in mortaliteit in vergelijking met de BD-positieve controles. Let op dat de behandelingen met 0,01% en 0,005% econazole gedurende 11 dagen resulteerden in een significante toename van de mortaliteit vergeleken met de BD-positieve controles. Houd er rekening mee dat de schimmelpathogeen BD een biologisch risico vormt; neem daarom voorzorgsmaatregelen zoals het dragen en vervangen van handschoenen, het autoclaveren van alle vaste afvalstoffen en het desinfecteren.
Alle vloeibare afvalverwerking moet worden uitgevoerd bij het volgen van deze procedure.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt een gewijzigd behandelprotocol voor Batrachochytrium dendrobatidis (Bd)-infecties bij amfibieën met gebruik van itraconazol. De resultaten suggereren dat een lagere concentratie en een kortere behandelduur de infectie effectief kunnen elimineren terwijl bijwerkingen tot een minimum worden beperkt.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Mycologie
- Gezondheid van amfibieën
- Behandeling van infectieziekten
Achtergrond
- Batrachochytrium dendrobatidis is een pathogene schimmel die amfibieën treft.
- Traditionele behandeling maakt gebruik van hogere concentraties en langere duur van antimycotica.
- Het verminderen van de behandelconcentratie en de duur kan het dierenwelzijn verbeteren.
- Het monitoren van de infectiestatus na de behandeling is cruciaal voor het beoordelen van de effectiviteit.
Doel van de studie
- Om de effectiviteit van een lagere concentratie itraconazol bij de behandeling van Bd-infecties te evalueren.
- Om negatieve bijwerkingen die geassocieerd worden met traditionele behandelprotocollen te minimaliseren.
- Om een menswaardiger behandelregime voor geïnfecteerde amfibieën vast te stellen.
Gebruikte methoden
- Inoculatie van amfibieën met Bd-culturen.
- DNA-extractie en qPCR voor bevestiging van de infectie.
- Dagelijks baden van geïnfecteerde dieren in een 0,0025% itraconazoloplossing gedurende vijf minuten over een periode van zes dagen.
- Monitoring na de behandeling met behulp van qPCR-analyse van huidswabs gedurende vier weken.
Belangrijkste resultaten
- Het gewijzigde behandelingsprotocol elimineerde de Bd-infectie effectief.
- Een lagere concentratie en kortere duur leidden tot minder mortaliteit.
- Er werden minder negatieve bijwerkingen waargenomen in vergelijking met traditionele methoden.
- Succesvolle behandeling werd bevestigd via QPCR-analyse.
Conclusies
- Een lagere concentratie en een kortere behandelduur van itraconazol zijn effectief tegen Bd.
- Deze aanpak kan het welzijn van de behandelde amfibieën verbeteren.
- Verder onderzoek kan de behandelprotocollen voor andere pathogenen optimaliseren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Deze studie demonstreert dat het verlagen van de antischimmelconcentratie en de behandelduur de werkzaamheid kan behouden, terwijl de veiligheidsprofielen in amfibiemodellen worden verbeterd. Voor biofarmaceutische R&D ondersteunt dit strategieën voor dosisoptimalisatie die de therapeutische index en tolerantie in balans brengen bij de preklinische ontwikkeling van antifungaliciden. De aanpak benadrukt hoe iteratieve verfijning van regimenparameters leid-kandidaten kan ontrisken voorafgaand aan studies ter ondersteuning van een IND-aanvraag.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar dosis-responsprogramma's voor antifungale mechanismen mogelijk in een infectiemodel voor het gehele organisme.
- Operationele waarde: Biedt een schaalbaar systeem om doelwitinteractie en pathogenenklaring te beoordelen onder omstandigheden van verminderde blootstelling.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Vestigt een gestandaardiseerde QPCR-gebaseerde readout voor het kwantificeren van de schimmellast na behandeling.
- Operationele waarde: Ondersteunt de reproduceerbaarheid van de assay via gedefinieerde badprotocollen en omgevingscontroles.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterellevant systeem om de veiligheidsmarges van antifungale verbindingen over verschillende levensstadia te evalueren.
- Operationele waarde: Faciliteert de vergelijkbaarheid tussen soorten door parameters voor behandelingsfalen en succescriteria te definiëren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de lead-optimalisatie van antifungale middelen, waarbij afwegingen tussen werkzaamheid en veiligheid worden geëvalueerd voorafgaand aan de selectie van kandidaten.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door een verminderde blootstelling aan het geneesmiddel te koppelen aan het behoud van pathogenenklaring.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde beoordeling van de effectiviteit van verbindingen mogelijk via gedefinieerde badduur- en concentratiematrices.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele via QPCR om de schimmellast tussen behandelingsgroepen te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan op de preklinische continuïteit door monitoringsvensters na de behandeling vast te stellen om blijvende klaring te bevestigen.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar platform voor het evalueren van antifungale kandidaten met een verminderde belasting van middelen per testconditie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door correlatie van een lagere blootstelling met aanhoudende werkzaamheid.
- Operationele waarde: Standaardisatie van infectie-inductie, toediening van de behandeling en omgevingsdecontaminatie.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het identificeren van effectieve schema's met verminderde toxiciteitssignalen.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen die werkzaamheid vertonen bij lagere concentraties.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste expertise in de husbanderie van amfibieën, het omgaan met schimmelpathogenen en moleculaire diagnostiek.
- Benodigde instrumentatie omvat QPCR-systemen, hemocytometers voor sporenkwantificering en gecontroleerde klimaatkamers.
- Standaardisatie tussen teams vereist afstemming over drempelwaarden voor infectiebevestiging en monitoring van de therapietrouw.
- Overwegingen bij adaptatie omvatten soortspecifieke tolerantie voor badprocedures en levensstadium-afhankelijk geneesmiddelenmetabolisme.
- Praktische beperkingen omvatten eisen voor biologische inperking van Bd en soortspecifieke variabiliteit in de respons op de behandeling.
