ECM Eiwit nanovezels en nanostructuren Engineered behulp-Surface geïnitieerde Vergadering
17 april 2014
Werkwijze voor nanovezels en complexe nanostructuren verkrijgen uit een of meerdere extracellulaire matrixeiwitten beschreven. Deze methode maakt gebruik van proteïne-oppervlak interacties vrijstaande eiwit gebaseerde materialen maken met instelbare samenstelling en architectuur voor gebruik in een verscheidenheid van tissue engineering en biotechnologische toepassingen.
Het algemene doel van deze procedure is om vrijstaande nanovezels, nanostructuren en 2D-matrices te maken van enkele of meerdere extracellulaire matrixeiwitten met behulp van oppervlakte-geïnitieerde assemblage. Dit wordt bereikt door eerst poly dimethyl soane of PDMS-stempels te bereiden door de PDMS-prepolymeer op een topografisch gepaterde mastermal te gieten en het te laten uitharden. De tweede stap is om de uitgeharde PDMS-stempels uit te snijden en ze te coaten met een oplossing die de gewenste extracellulaire matrixeiwitten bevat.
Vervolgens worden de stempels gewassen, gedroogd en microcontact geprint op een met poly N isopropyl acrylamide of pipe PAM gecoate glazen deksel. De laatste stap is om de deksel te hydrateren met warm 40 graden Celsius gedeïoniseerd water en het geleidelijk te laten afkoelen, waardoor de oplossing wordt verminderd. Temperaturen onder ongeveer 32 graden Celsius veroorzaken het oplossen van de thermisch gevoelige pipe PAM-laag en de afgifte van geassembleerde eiwitnanovezels of nanostructuren.
Uiteindelijk zijn de geassembleerde nanovezels en nanostructuren vrijstaand in oplossing, zoals bevestigd door fasecontrast- en/of fluorescentiemicroscopie, en kunnen ze worden gebruikt in verdere toepassingen zoals weefsel engineering scaffols. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals gezichtsseparatie of elektrospinnen, is de mogelijkheid om ECM-eiwitnanovezels te maken met behulp van een techniek die echt nabootst hoe cellen normaal gesproken ECM-vezels in vivo bouwen. De oppervlakte-geïnitieerde assemblagetechniek heeft een aantal unieke voordelen, waaronder de mogelijkheid om de eiwitsamenstelling, vezelmorfologie en scaffoarchitecturen te controleren.
Verder kunnen we ECM-eiwitnanovezels maken van extracellulaire matrixeiwitten zoals fiber nin laminate en collageen type vier, wat met andere soorten methoden moeilijk is gebleken. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van weefsel engineering te beantwoorden door onderzoekers in staat te stellen constructen te ontwikkelen met specifieke en goed gedefinieerde fysische en chemische signalen om een verscheidenheid aan celgedragingen zoals adhesie en differentiatie te sturen. Als u nieuw bent in deze techniek, moet u onthouden om de kwaliteit van uw stempels en de getrouwheid van de microcontactgedrukte patronen voortdurend te inspecteren.
Dit is essentieel om de juiste assemblage van de ECM-nanovezels en nanostructuren te verkrijgen. Om deze procedure te beginnen, bereidt u het poly dimethyl soane of PDMS-prepolymeer voor door de elastomerenbasis en het uithardingsmiddel te combineren in een 10 tot 1 gewichtsverhouding, meestal worden 80 gram basis en acht gram uithardingsmiddel gebruikt om ervoor te zorgen dat er voldoende PDMS is om de mastermal in een laag van een centimeter dik te bedekken. Meng en centrifugeer de PDMS met behulp van een centrifugale mixer ingesteld op de volgende mix bij 2000 RPM gedurende twee minuten, centrifugeer bij 2000 RPM gedurende twee minuten. Genoeg.
PDMS-prepolymeer over de mastermal om een laag van een centimeter dik te vormen hier, de PDMS wordt gebakken bij 65 graden Celsius gedurende vier uur. Eenmaal uitgehard, gebruikt u een scalpel om het gebied met het patroon eruit te snijden om de PDMS-stempel te vormen. Om de functiezijde te onderscheiden van de achterkant van de PDMS-stempel.
Snij een inkeping uit een van de hoeken aan de achterkant van de stempel. Begin deze procedure door de glazen deksels met een diameter van 25 millimeter schoon te maken, soniqueer de deksels in 95% ethanol gedurende een uur en droog ze vervolgens in een oven van 65 graden Celsius. Bereid vervolgens de poly en isopropyl acrylamide of piam-oplossing voor, los piam op in een butanol met een concentratie van 10%. Centreer een schone glazen deksel op de vacuümklem van de spincoer en pipet 200 microliters van de pipe Pam-oplossing op het glazen oppervlak om het oppervlak volledig te bedekken.
Spincoat de deksel bij 6.000 RPM gedurende één minuut. Reinig de PDMS-stempels door sonicatie in 50% ethanol gedurende 30 minuten en droog ze vervolgens onder een stroom stikstof. Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast om de steriliteit te behouden voor toepassingen waarbij de extracellulaire matrix of ECM-nanostructuren met cellen worden gebruikt. De microcontactdrukstap is het moeilijkste aspect van deze procedure.
Het is belangrijk om de PDMS-stempels te inspecteren op zichtbare defecten voor gebruik. Gebruik ook geen eiwitoplossing die ouder is dan twee weken Plaats. De PIAM-gecoate deksels in een gesloten petrischaal en steriliseer ze met UV-blootstelling.
45 minuten onder de UV-lamp in een bioveiligheidskast is voldoende. Bedek het patroonoppervlak van elke PDMS-stempel met 200 microliters van de eiwitoplossing. Fibronectine of FN wordt hier gebruikt met een concentratie van 50 microgram per milliliter in steriel gedistilleerd water.
Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Na één uur worden de PDMS-stempels en gedistilleerd water gewassen om overtollig eiwit te verwijderen en grondig gedroogd onder een stroom stikstof. Het is belangrijk om het water volledig te verwijderen om voortijdige oplossing van de pipe te voorkomen. Pam-coating op de deksel en onjuiste eiwitoverdracht.
Voer microcontactdruk uit door de functiezijde van de PDMS-stempel in contact te brengen met de met pipe PAM gecoate deksel, indien nodig. Gebruik een pincet om lichtjes op de achterkant van de stempels te tikken om eventuele luchtbellen te verwijderen en een gelijkmatige contact te garanderen na vijf minuten. Trek de PDMS-stempel van de deksel af.
In dit stadium. Afhankelijk van de studie kunnen aanvullende ECM-eiwitten worden gepatroon om complexere en meercomponentenstructuren te creëren. Zodra het ECM-patroon is afgedrukt, plaatst u de gepatroneerde met pipe PAM gecoate deksel in een 35 millimeter petrischaal en inspecteert u de patroongetrouwheid met behulp van fasecontrastmicroscopie.
Afhankelijk van het patroon kan een CCD-camera nodig zijn om de kenmerken van het patroon op te lossen. Fluorescentiemicroscopie kan ook worden gebruikt om het pat
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het ontwikkelen van vrijstaande nanovezels en complexe nanostructuren van extracellulaire matrix-eiwitten. De techniek maakt gebruik van oppervlakte-initieerde assemblage om materialen te creëren die geschikt zijn voor weefselengineering en biotechnologietoepassingen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Biotechnologie
- Weefselengineering
- Nanotechnologie
Achtergrond
- Extracellulaire matrix-eiwitten spelen een cruciale rol in weefselstructuur en functie.
- Nanovezels en nanostructuren kunnen natuurlijke weefselomgevingen nabootsen.
- Oppervlakte-initieerde assemblage is een techniek die nauwkeurige controle over materiaaleigenschappen mogelijk maakt.
- Het creëren van vrijstaande, op eiwitten gebaseerde materialen kan hun toepassing in verschillende velden verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het produceren van nanovezels en nanostructuren van extracellulaire matrix-eiwitten.
- Om eiwit-oppervlakte-interacties te gebruiken voor materiaalontwerp.
- Om toepassingen in weefselengineering en biotechnologie te verkennen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van poly dimethyl siloxaan (PDMS) stempels van een gepatterreerde mastermal.
- Bekleden van PDMS-stempels met een oplossing van extracellulaire matrix-eiwitten.
- Micro contact printing op een met poly N-isopropyl acrylamide (PIPAAm) beklede glazen deksel.
- Hydratie en koeling van de deksel om de afgifte van geassembleerde nanostructuren te activeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle creatie van vrijstaande, op eiwitten gebaseerde nanovezels en nanostructuren.
- Aangetoonde afstembaarheid in samenstelling en architectuur van de materialen.
- Mogelijke toepassingen in verschillende gebieden van weefselengineering en biotechnologie.
- Validatie van de methode door middel van experimentele resultaten.
Conclusies
- De methode biedt een veelzijdige aanpak voor het ontwerpen van op eiwitten gebaseerde materialen.
- Oppervlakte-initieerde assemblage is effectief voor het creëren van complexe nanostructuren.
- Deze materialen hebben een significant potentieel voor het bevorderen van toepassingen in weefselengineering.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Engineering extracellular matrix (ECM) protein nanofibers and nanostructures with precise control over composition, geometry, and architecture enables biopharma R&D to recapitulate native tissue microenvironments for predictive modeling. This capability supports target validation and phenotypic screening by providing disease-relevant systems that modulate cellular adhesion, differentiation, and apoptosis. Surface-initiated assembly (SIA) offers a mechanistic de-risking approach to generate tunable ECM materials for preclinical model development and translational biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled presentation of ECM proteins to assess target engagement and pathway modulation.
- Operational Value: Provides reproducible, well-defined nanostructures to reduce biological variability in early-stage target validation assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized ECM nanofiber substrates for quantitative phenotypic screening of compound effects on cell behavior.
- Operational Value: Supports assay standardization and scalability via microcontact printing of defined protein patterns for high-throughput applications.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system engineering by incorporating multi-component ECM proteins (fibronectin, laminin, fibrinogen, collagens I/IV) to mimic tissue-specific microenvironments.
- Operational Value: Enables predictive confidence in preclinical model selection through tunable scaffold architecture that directs cellular responses.
Pipeline & Workflow Integration
Surface-initiated assembly integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical research by providing tunable ECM materials that inform lead identification and risk-adjusted advancement decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise control over ECM protein composition and nanostructure geometry to probe mechanotransduction signaling.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible nanofiber arrays with quantifiable dimensional outputs for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides measurable fiber dimensions (length, width, thickness) and release kinetics as quantitative readouts to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through engineered ECM nanostructures that maintain structural integrity and support longitudinal cellular studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for generating custom ECM nanostructures across multiple projects, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through biomimetic ECM presentation that reduces mechanistic ambiguity in cellular response interpretation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via surface-initiated assembly protocol and microcontact printing fidelity controls.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by enabling early assessment of compound effects on cell adhesion, differentiation, and apoptosis in physiologically relevant contexts.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of leads based on performance in disease-relevant ECM nanostructure models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein surface chemistry, microcontact printing, and thermally responsive polymer handling.
- Depends on instrumentation for PDMS stamp fabrication, spin coating, and environmental control during thermal release.
- Necessitates cross-team standardization of protein solution preparation, stamp cleaning, and pattern inspection to ensure fidelity.
- Involves adaptation considerations when extending to different ECM proteins or multi-component nanostructures.
- Practical limitations include sensitivity to protein solution age, stamp defects, and temperature control during PIPAAm dissolution affecting nanostructure integrity.
