ECM Eiwit nanovezels en nanostructuren Engineered behulp-Surface geïnitieerde Vergadering

Het algemene doel van deze procedure is het vervaardigen van vrijstaande nanovezels, nanostructuren en 2D-matrices uit enkele of meerdere extracellulaire matrixeiwitten met behulp van oppervlakte-geïnitieerde assemblage. Dit wordt bereikt door eerst polydimethylsiloxaan- of PDMS-stempels voor te bereiden door de PDMS-prepolymeer op een topografisch gepatrooneerde mastermold te gieten en deze te laten uitharden. De tweede stap bestaat uit het uitsnijden van de uitgeharde PDMS-stempels en het coaten hiervan met een oplossing die de gewenste extracellulaire matrixeiwitten bevat.

Vervolgens worden de stempels gewassen, gedroogd en via microcontactprinten aangebracht op een glazen dekglas gecoat met poly N-isopropylacrylamide, of pNIPAM. De laatste stap is het hydrateren van het dekglas met warm gedeïoniseerd water van 40 °C en het geleidelijk laten afkoelen van de oplossing. Een temperatuur onder ongeveer 32 °C triggert de oplossing van de thermisch gevoelige pNIPAM-laag en de vrijgave van de geassembleerde eiwit-nanovezels of nanostructuren.

Uiteindelijk zijn de geassembleerde nanovezels en nanostructuren vrijstaand in oplossing, zoals bevestigd door fasecontrast- en/of fluorescentiemicroscopie, en kunnen ze worden gebruikt in verdere toepassingen, zoals scaffolds voor tissue engineering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals fasescheiding of electrospinning, is de mogelijkheid om ECM-proteine-nanovezels te ontwerpen met een techniek die nauwkeurig nabootst hoe cellen normaal gesproken ECM-vezels in vivo opbouwen. De oppervlakte-geïnitieerde assemblage-techniek biedt een aantal unieke voordelen, waaronder de mogelijkheid om de eiwitsamenstelling, de vezelmorfologie en de architectuur van de scaffold te controleren.

Verder kunnen we ECM-proteïnenanovezels vervaardigen uit extracellulaire matrixeiwitten zoals fibronectine, laminine en collageen type IV, wat met andere methoden moeilijk bleek. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van tissue engineering door onderzoekers in staat te stellen constructen te ontwikkelen met specifieke en goed gedefinieerde fysieke en chemische signalen om diverse celgedragingen, zoals adhesie en differentiatie, te sturen. Als u nieuw bent met deze techniek, dient u er rekening mee te houden dat u continu de kwaliteit van uw stempels en de getrouwheid van de microcontact-geprinte patronen moet controleren.

Dit is essentieel om een correcte assemblage van de ECM-nanovezels en nanostructuren te verkrijgen. Om deze procedure te starten, bereid je het poly dimethylsiloxaan of PDMS-prepolymeer voor door de elastomeerbasis en het uithardingsmiddel te combineren in een gewichtsverhouding van 10 op 1; doorgaans worden 80 gram basis en 8 gram uithardingsmiddel gebruikt om ervoor te zorgen dat er voldoende PDMS is om de mastermal te bedekken met een laag van 1 centimeter dik. Meng en ontgas het PDMS met een centrifugaalmixer ingesteld op de volgende instellingen: mengen op 2000 RPM gedurende twee minuten, ontgassen op 2000 RPM gedurende twee minuten. Giet het mengsel.

Breng PDMS-prepolymeer aan over de mastermold om hier een laag van één centimeter dikte te vormen; laat de PDMS uitharden door deze vier uur lang te bakken bij 65 °C. Gebruik na uitharding een scalpel om het gebied met het patroon uit te snijden om de PDMS-stempel te vormen. Doe dit om de zijde met de kenmerken te onderscheiden van de achterzijde van de PDMS-stempel.

Snijd een inkeping uit een van de hoeken aan de achterzijde van de stempel. Begin deze procedure door de dekglasplaatjes met een diameter van 25 millimeter te reinigen; soniceren de dekglasplaatjes gedurende één uur in 95% ethanol en droog ze vervolgens in een oven op 65 °C. Bereid vervolgens de poly- en isopropylacrylamide- of piam-oplossing voor door piam op te lossen in 1-butanol met een concentratie van 10%. Plaats een schoon dekglasplaatje centraal op de vacuümhouder van de spin-coater en pipetteer 200 µL van de piam-oplossing op het glasoppervlak om het oppervlak volledig te bedekken.

Breng de cover slip via spincoating aan bij 6,000 RPM gedurende één minuut. Reinig de PDMS-stempels door sonicatie in 50% ethanol gedurende 30 minuten en droog deze vervolgens onder een stroom stikstof; al deze en alle volgende stappen moeten in een biologische veiligheidskabinet worden uitgevoerd om de steriliteit te waarborgen voor toepassingen waarbij de extracellulaire matrix of ECM-nanostructuren met cellen worden gebruikt. De stap van microcontactprinten is het meest uitdagende aspect van deze procedure.

Het is belangrijk om de PDMS-stempels vóór gebruik te inspecteren op zichtbare defecten. Gebruik daarnaast geen eiwitoplossing die ouder is dan twee weken. Plaats de met PIAM gecoate dekglasjes in een gesloten Petrischaal en steriliseer deze door middel van UV-bestraling.

45 minuten onder het UV-licht in een veiligheidskast is voldoende. Bedek het patroonoppervlak van elke PDMS-stempel met 200 µL van de eiwitoplossing. Fibronectine of FN wordt hier gebruikt in een concentratie van 50 µg/mL in steriel gedestilleerd water.

Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur; was na één uur de PDMS-stempels met gedestilleerd water om overtollig eiwit te verwijderen en droog ze grondig onder een stroom stikstof. Het is belangrijk om het water volledig te verwijderen om voortijdige oplosbaarheid van de pijp te voorkomen. Pam-coating op het dekglas en onjuiste eiwitoverdracht.

Voer microcontactdruk uit door de zijde met de structuren van de PDMS-stempel in contact te brengen met het met pipe PAM gecoate dekglas indien vereist. Gebruik een pincet om lichtjes op de achterkant van de stempels te tikken om eventuele luchtbellen te verwijderen en een uniform contact na vijf minuten te waarborgen. Pel de PDMS-stempel van het dekglas af.

Op dit moment kunnen, afhankelijk van de studie, aanvullende ECM-proteïnen worden gepatroneerd om complexere en multi-component structuren te creëren. Zodra het ECM-patroon is geprint, plaatst u het bedekte dekglas met het gepatroneerde pipe PAM in een Petri-schaal van 35 millimeter en inspecteert u de getrouwheid van het patroon met behulp van fasecontrastmicroscopie.

Afhankelijk van het patroon kan een CCD-camera nodig zijn om de kenmerken van het patroon te onderscheiden. Fluorescentiemicroscopie kan ook worden gebruikt om het patroon te inspecteren, mits de ECM-eiwitten fluorescent gelabeld zijn. Voeg na het verifiëren van de getrouwheid van het patroon drie milliliter gedestilleerd water van 40 °C toe aan de petrischaal en laat het water geleidelijk de oplossing van de pijp afkoelen.

De PAM-laag en de afgifte van de ECM-proteïnepatronen kunnen worden gemonitord met fasecontrastmicroscopie. Om doorgaans te waarborgen dat de ECM-proteïnenanostructuren zijn vrijgekomen, wordt het water afgekoeld tot kamertemperatuur, ruim onder de onderste kritische oplosstemperatuur van pNIPAM, welke 32 °C bedraagt. Indien de toepassing het gebruik van optische technieken niet toestaat, kan de afgifte worden gemonitord door de temperatuur van de oplossing te meten.

Nanovezels en andere nanostructuren zullen in het water drijven na het loslaten van de PAM-laag van de pijp. Voor verdere toepassingen moeten de nanostoffen en andere nanostructuren worden gemanipuleerd, waarbij de exacte aanpak afhankelijk zal zijn van het experimentele doel. Hier worden representatieve resultaten gepresenteerd om aan te tonen dat oppervlakte-geïnitieerde assemblage of SIA in staat is om ECM-proteïnenanovezels te engineeren met preciese controle over de afmetingen van de vezels.

Een array van fibronectine-rechthoeken, 50 micrometers lang en 20 micrometers breed, werd gepatroneerd op een met piam gecoat dekglas; toevoeging van DI-water van 40 °C en daaropvolgende afkoeling tot onder de kritische oplosstemperatuur van piam veroorzaakte de oplossing van piam en het vrijkomen van de fibroïnenanovezels. De vezels trokken samen omdat ze onder een inherente voorspanning stonden.

Wanneer ze op het piam-oppervlak waren gepatroneerd, onthulde een analyse van de dimensies van de fibronectine-nanovezels vóór vrijgave dat deze monodispers waren, met een gemiddelde lengte van 50.19 ± 0.49 µm en een gemiddelde breedte van 19.98 ± 0.17 µm. Na vrijgave krompen de nanovezels aanzienlijk, maar bleven ze monodispers met een gemiddelde lengte van 14.15 ± 0.92 µm en een gemiddelde breedte van 2.65 ± 0.32 µm. Atoomkrachtmicroscopie bood een perspectief met een hogere resolutie van de dimensionale veranderingen van de vezels die geassocieerd zijn met het SIA-vrijgaveproces.

Opmerkelijk was dat de vezels vóór de release een uniforme dikte hadden van ongeveer vijf nanometer, terwijl de vezels na de release een dikte hadden in de orde van enkele honderden nanometer, terwijl de lengte en breedte afnamen. Met het SIA-proces is het mogelijk om diverse nanostructuren van ECM-eiwitten te engineeren met instelbare grootte, vorm en samenstelling. Bijvoorbeeld, fibronectine-nanovezels met een initiële breedte van 20 micrometer en een lengte van één centimeter werden op een buis gepatterned.

PAM-gecoat dekglas na afkoeling en spoelen. Na dissolutie van PAM werden de nanovezels vrijgegeven, waarbij lange draden ontstonden met een verminderde breedte van ongeveer drie micrometer. Bovendien is het, aangezien het patroon wordt bepaald door de oppervlaktetopografie van de PDMS-stempel die voor microcontactprinten is gebruikt, mogelijk om complexe ECM-eiwit-nanostructuren als proof of concept te ontwerpen.

Er werden meearmige fibroïnestervormen gecreëerd. Thermische release leidde tot contractie van de armen, maar niet van het centrale gebied van de ster waar de armen samenkwamen. SIA werkt ook met andere ECM-eiwitten zoals laminine of LN, en meerdere ECM-eiwitten kunnen in dezelfde structuur worden geïncorporeerd.

In dit voorbeeld werden orthogonaal onderling verbonden, 20 micrometer brede lijnen fibronectine (weergegeven in rood) en 50 micrometer brede lijnen laminine (weergegeven in groen), geïntegreerd in een 2D-nanoweefsel, gepatroneerd en vervolgens vrijgegeven; na de vrijgave krompen beide typen nanovezels, maar de algemene onderlinge verbondenheid en de vierkante roosterstructuur bleven behouden. Deze resultaten tonen aan dat SIA kan worden gebruikt om ECM-materialen met uiteenlopende composities en structuren te ontwikkelen. Ten slotte worden enkele voorbeelden getoond van mislukte SIA van ECM-nanovezels.

Eén oorzaak is het onjuist loslaten van een onvolledig patroon als gevolg van een gebrekkige overdracht van ECM-eiwit naar het piam-oppervlak. Tijdens microcontactdrukken zullen de aanwezigheid van gaatjes, onregelmatige randen en andere defecten leiden tot nanovezels en nanostructuren die onvolledig zijn en geneigd zijn tot breuk en fragmentatie bij het loslaten. Snelle oplossing van pipe PAM kan ook leiden tot een gebrekkige getrouwheid van het patroon na het loslaten.

Gebruik bijvoorbeeld water van 20 °C, een temperatuur die al onder de lagere kritische oplosningstemperatuur ligt. De temperatuur van piam zal ervoor zorgen dat de piam snel opzwelt en oplost. Dit kan ervoor zorgen dat de nanovezels terugveren en breken, zoals geïllustreerd in de 32ste afbeelding, en willekeurige, ongeorganiseerde configuraties vormen, zoals geïllustreerd in de 52ste afbeelding.

Controleer vóór het starten van deze procedure de PDMS-stelen op defecten en zorg ervoor dat alle oppervlakken stofvrij zijn. In het tegendeel zal dit een goede eiwitoverdracht belemmeren en leiden tot een gebrekkige assemblage van de ACM-structuren. Na het volgen van deze procedure kunnen de vrijgekomen nanovezels of nanostructuren voor diverse doeleinden worden gebruikt, zoals het analyseren van de mechanische eigenschappen van de eiwitvezels, of als scaffolds voor tissue engineering.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe ECM-proteïnenanovezels en nanostructuren met een instelbare compositie, geometrie en architectuur kunnen worden ontworpen. Specifiek zult u begrijpen hoe patronen van ECM-proteïnen via microcontactdruk op met pyroon gecoate glazen dekglasjes kunnen worden aangebracht, om vervolgens de oplossing van het oppervlak thermisch te triggeren voor de assemblage van de ECM-structuren.