Sorteren van Streptomyces Cel Pellets behulp van een complex object Parametric Analyzer en Sorter
February 13th, 2014
-Vloeibare gegroeid Streptomyces culturen worden gekenmerkt door mycelium pellets die heterogeen zijn in omvang. We beschrijven hier een werkwijze voor het analyseren en sorteren dergelijke pellets in een high-throughput manier. Deze pellets kunnen worden gebruikt voor verdere analyse, die leidt zal begrijpen en te beheersen groei heterogeniteit.
Het algemene doel van deze procedure is om myceliumpellets die gevormd worden door filamenteuze streptomyces te sorteren op grootte, met behulp van een COPA stroomcytometer voor grote deeltjes. Dit wordt eerst bereikt door het laten groeien en vervolgens bemonsteren van de gewenste bacteriestam. In de tweede stap wordt de monsterstam gemeten door coppa.
De gegevens worden vervolgens in silico geanalyseerd en de myceliumpellets worden gesorteerd volgens door de gebruiker gedefinieerde parameters. Uiteindelijk kunnen deze analyses worden gebruikt om de heterogeniteit van de pelletgrootte verder te karakteriseren. Hoewel deze methode kan worden gebruikt voor streptomyces, kan deze ook worden toegepast op andere organismen zoals filamenteuze schimmels, wat dit procedure zal demonstreren, is MaRous Petrus, een promovendus uit ons lab.
Eerst worden de culturen gekweekt door 100 milliliter gistextract, moutextract medium en 0,2 milliliter 2,5 molaire magnesiumchloride toe te voegen aan een steriele 250 milliliter erlenmeyer kolf, uitgerust met metalen spiraalveren voor elke bacteriesteekproef. Bemesten vervolgens elke kolf met één maal 10 tot de acht sporen van streptomyces om een spoorconcentratie van één maal 10 tot de zes sporen per milliliter te verkrijgen en laat de bacteriën groeien bij 30 graden Celsius met schommelen bij 180 RPM. Na twee dagen gebruikt u een steriele vijf milliliter pipet om een vijf milliliter steekproef van elke cultuur te verzamelen terwijl u de kolf voorzichtig schudt om de cellen gelijkmatig te verdelen.
Stort vervolgens elke steekproef in individuele 15 milliliter kegelbuizen. Om de steekproeven te evalueren door copus-analyse, bevestig dat de copus plus pompcomputer en 488 nanometer argonlaser zijn ingeschakeld, en open vervolgens de bio-bronsoftware. Bevestig dat de hulpvloeistof fles vol is en dat de afvalfles leeg is, en klik vervolgens op start en loop.
Om de 488 nanometer argonlaser van stand-by naar aan te schakelen na ongeveer 60 seconden, is de laser klaar. Klik, klaar, en controleer vervolgens de drukmeters. Klik op het selectievakje naast druk.
Oké, en nadat het systeem de flow cell heeft voorbereid, bevestig dat de vertragingsinstelling op 11 staat en dat de breedte op zeven staat. Stel de drempels in op 50 voor signaal en 40 voor tijd van vlucht minimum. Verwijder vervolgens het overgebleven water uit de steekproefcup.
Voeg ongeveer 50 milliliter PBS toe en voeg vervolgens 0,1 milliliter van een van de strep demesteekproeven toe aan de cup. Zorg ervoor dat de cup goed gesloten is en klik vervolgens op verzamelen om te beginnen met het verzamelen van gegevens. Beheer de stroomsnelheid om tussen de 30 en 50 gebeurtenissen per seconde te verkrijgen wanneer er minimaal 2.500 gebeurtenissen zijn verzameld.
Klik, stop, en sla vervolgens de gegevens op om de gegevens op te slaan voor statistische analyse om bacteriële pellets voor elke steekproef te sorteren. Stel eerst sorteerlimieten in en voer details in over de minimale en maximale tijd van vlucht waarden. Selecteer alternatief regio's en definieer vervolgens de gate regio om een gebied te creëren voor het selecteren van de pellets met de gewenste afmetingen en eigenschappen.
Plaats een 50 milliliter buis om de pellets die voldoen aan de sorteerparameters te verzamelen. Stel vervolgens het aantal pellets in om te sorteren en klik handmatig op sorteren om te sorteren voor de geselecteerde parameters. Verwijder na het sorteren het overgebleven steekproef en spoel de steekproefcup twee keer met water.
Voordat u de copus afsluit, reinigt u de steekproefcup met 70%ethanol. Voer nu het systeem twee keer uit. Een keer met gechloreerd water en een keer met gewoon water, leeg vervolgens de overloopcontainer Na het schoonmaken, klik op stop om de druk van het systeem te ontlasten.
Wanneer de motor stopt, sluit het programma en klik op afsluiten zonder te legen. Schakel vervolgens de computer, de copa, de laser en de pomp streptomyces af. Myceliumpellets en vloeibare culturen die een breed scala aan groottes hebben.
Om de pelletgrootteverdeling te analyseren, werd een twee dagen oude vloeistof gekweekte streptomyces cila kleurencultuur onderworpen aan grote deeltjes stromingscytometrie met behulp van een copus plus profiler uitgerust met een ene millimeter mondstuk. Hier is een typische copus-uitvoer spreidingsdiagram getoond. De x-as vertegenwoordigt de tijd van vlucht.
Hoe groter het beroep, hoe langer het duurt om de laserstraal te passeren. De Y-as geeft de extinctie aan, die de optische dichtheid van het object vertegenwoordigt, elk punt in de komt overeen met een enkele pellet die door de laserstraal gaat. Het plotten van de datapunten in een histogram gaf aan dat de groottes uit deze representatieve steekproef niet normaal verdeeld waren.
De verdeling leek naar rechts te schuinen log. Het transformeren van de dataset leidde ook niet tot een normale verdeling om te beoordelen of de grootteverdeling kon worden verklaard door aan te nemen dat het een mengsel was van twee normale verdelingen, werd de gegevens wiskundig gemodelleerd. Modellering wees inderdaad op een populatie van kleine pellets bestaande uit 92% van alle pellets met een gemiddelde grootte van 248 micrometer, en een populatie van grote pellets bestaande uit 8% van alle pellets met een gemiddelde grootte van 319 micrometer.
Hier is een representatieve analyse van micro kolonies gesorteerd uit de grote en kleine pelletpopulaties getoond. De gemiddelde pelletgroottes van de twee populaties werden gebruikt om de grenzen voor sortering te definiëren om de sortering van de pellets uit het overlappende gedeelte van de twee grootteverdelingen te beperken. Pellets kleiner dan 248 micrometer werden beschouwd als afkomstig uit de kleine pelletpopulatie, terwijl pellets groter dan 319 micrometer werden beschouwd als afkomstig uit de grote pelletpopulatie. Microscopisch onderzoek van de gesorteerd pellets bevestigde hun verschillende groottes. Volgens deze procedure.
Andere methoden zoals next generation sequencing of proteomics kunnen worden uitgevoerd om de onderliggende mechanismen van deze heterogeniteit te ontrafelen.
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het sorteren van myceliële pellets uit vloeistof gekweekte Streptomyces culturen op basis van grootte met behulp van een grote deeltjes COPA flow cytometer. De aanpak maakt een hoog-doorvoer analyse van pellet grootte heterogeniteit mogelijk, wat kan leiden tot inzichten in groeicontrole.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Biotechnologie
Achtergrond
- Streptomyces zijn filamenteuze bacteriën die bekend staan om hun complexe levenscycli.
- Myceliële pellets die gevormd worden tijdens de groei vertonen grootte heterogeniteit.
- Het begrijpen van deze heterogeniteit is cruciaal voor toepassingen in de biotechnologie.
- Flow cytometrie biedt een methode voor het analyseren van deeltjesgrootte op een hoog-doorvoer manier.
Doel van Studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het sorteren van myceliële pellets op grootte.
- Om de grootteverdeling van Streptomyces pellets te analyseren.
- Om een raamwerk te bieden voor verdere studies over groei heterogeniteit.
Gebruikte Methoden
- Groei van Streptomyces culturen in een gecontroleerde omgeving.
- Bemonstering en voorbereiding van culturen voor flow cytometrie analyse.
- Gebruik van COPA flow cytometer om pellets te meten en sorteren op grootte.
- Statistische analyse van grootteverdeling en modellering van pellet populaties.
Belangrijkste Resultaten
- Identificatie van twee verschillende populaties van pellets op basis van grootte.
- Kleine pellets hadden een gemiddelde grootte van 248 micrometer, terwijl grote pellets een gemiddelde grootte van 319 micrometer hadden.
- Grootteverdeling was niet normaal verdeeld, wat wijst op significante heterogeniteit.
- Microscopische analyse bevestigde de verschillende groottes van de gesorteerd pellets.
Conclusies
- De ontwikkelde methode sorteert effectief myceliële pellets op grootte.
- Verdere analyses kunnen de mechanismen achter grootte heterogeniteit verduidelijken.
- Deze aanpak kan worden aangepast voor andere filamenteuze organismen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Heterogeneity in mycelial pellet size directly impacts productivity in streptomycetes-based antibiotic and enzyme production, creating a bottleneck in cell factory optimization. Sorting pellets by size enables mechanistic de-risking of growth variability and supports predictive confidence in strain performance. This capability informs early discovery decisions by linking phenotypic output to bioprocess scalability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of growth heterogeneity hypotheses by isolating defined pellet subpopulations.
- Operational Value: Provides reproducible fractionation of mycelial pellets for downstream omics or phenotypic screening.
- Strategic Value: Supports target validation by linking pellet size to productivity traits in streptomycetes cell factories.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates size-sorted pellet fractions for standardized assay inputs in enzyme or metabolite screening.
- Operational Value: Delivers quantitative time-of-flight and extinction measurements for pellet classification.
- Strategic Value: Facilitates assay standardization by reducing biological noise from pellet size variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables continuity from discovery to preclinical scale by providing sorted pellets for RNA, protein, or omics analysis.
- Operational Value: Supports scalable sample preparation for mechanistic studies underlying pellet heterogeneity.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement by identifying size-correlated productivity markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling phenotypic screening of pellet subpopulations prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of growth mechanisms through size-based pellet fractionation.
- Screening: Delivers assay-ready, size-homogeneous pellet samples for compound or condition testing.
- Analytics: Provides time-of-flight and extinction readouts for quantitative pellet classification and sorting.
- Translational Research: Connects sorted pellets to downstream molecular analysis for biomarker or mechanism discovery.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for pellet analysis across streptomycetes strain development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in growth studies by enabling isolation of defined pellet populations.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization in pellet analysis across batches and strains.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking pellet size to productivity outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of streptomycetes strains based on size-sorted productivity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and streptomycetes culture handling.
- Dependent on large particle COPAS instrumentation with appropriate nozzle and laser configuration.
- Necessitates standardization of sample preparation and sheath fluid protocols across users.
- Involves adaptation of sorting gates for different pellet size ranges in various filamentous systems.
- Limited by the need for optimization of flow rates and threshold settings for accurate pellet detection.
