Isolatie en bereiding van bacteriële celwanden voor compositorische analyse door Ultra Performance Liquid Chromatography
January 15th, 2014
De bacteriële celwand bestaat uit peptidoglycan, een macromoleculair netwerk van suikerstrengen gekruist door peptiden. Ultra Performance Liquid Chromatography biedt een hoge resolutie en doorvoer voor nieuwe ontdekkingen van peptidoglycan samenstelling. We presenteren een procedure voor de isolatie van celwanden (sacculi) en hun daaropvolgende voorbereiding voor analyse via UPLC.
Het algemene doel van deze procedure is om bacteriële celwanden te isoleren en te verteren om de identiteiten en relatieve fracties van verschillende neuropeptiden te bepalen. Met behulp van UPLC-analyse wordt dit bereikt door eerst bacteriemonsters te lysen door te koken in natrium ecol sulfaat. Na het uitwassen van SDS is de tweede stap het verteren van monsters met pronase E om de buitenste membraan van gramnegatieve bacteriën te zuiveren.
Vervolgens worden de monsters verdund met mease om het peptidoglycaan op te lossen in individuele neuropeptiden. De laatste stap is om de neuropeptiden te reduceren en de pH aan te passen tot het iso-elektrische punt van de neuropeptiden. Uiteindelijk wordt UPLC gebruikt om neuropeptiden te scheiden op basis van grootte en hydrofobiteit, waardoor de kwantificering van belangrijke celwandkenmerken, zoals de mate van cross-linking en gemiddelde glycaanstrenglengte, wordt vergemakkelijkt.
Deze methode kan helpen om de antwoorden op belangrijke vragen op het gebied van microbiologie te onthullen, zoals de relaties tussen morfogenese, celwandarchitectuur, activering van het immuunsysteem en pathogenese. Hoewel deze methode is ontwikkeld om gramnegatief Peptidyl glycaan te zuiveren, kan deze ook worden toegepast op grampositieve bacteriën met de toevoeging van enkele enzymen en chemische behandelingen. Om de bacterieculturen terug te laten groeien, verdunt u overnachtsculturen een op honderd in 250 milliliters vers medium en laat u deze groeien tot de gewenste optische dichtheid bij 600 nanometer terwijl de verdunde culturen groeien. Stel een kokend waterbad in op een hot plate in een liter beker.
Zodra het water kookt, verdeelt u zes milliliter van 6% natrium dyl sulfaat of SDS in 50 milliliter polypropyleen buizen. Voeg een kleine roerder toe aan elke buis en draai de buisdeksels stevig vast. Plaats de buizen in het kokende waterbad en roer met 500 RPM op de hot plate.
Oogst de 250 milliliters culturen door 5.000 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te draaien. Suspensieer de pellets opnieuw in drie milliliters medium of een keer fosfaatgebufferd zoutwater. Pipetteer de celsuspensies langzaam in de 50 milliliters buizen met 6% kokend SDS om de cellen te lyzeren terwijl de buizen ondergedompeld zijn in het kokende waterbad en sluit de deksels opnieuw stevig vast.
Dek het kokende waterbad af en laat de cellen drie uur koken, waarbij u periodiek de waterstand controleert en het waterbad bijvult wanneer dat nodig is. Na drie uur zet u de warmte op de hot plate uit en blijft u overnacht roeren met 500 RPM. Als SDS zich in de 50 milliliters buizen heeft geprecipiteerd gedurende de nacht, zet u het waterbad aan om nog eens één tot twee uur te koken.
Hier wordt getoond hoe een normale cultuur eruit zou moeten zien na overnachts lyse. Let in SDS op de transparantie in tegenstelling tot de ondoorzichtigheid die correleert met precipitatie. Bereid de prone e buffer voor en activeer prone E bij 60 graden Celsius in een heat block gedurende ten minste 30 minuten.
Gebruik een ultracentrifuge ingesteld op 400.000 keer G om monsters 20 minuten bij kamertemperatuur te draaien om de grote peptol glycaan of PG macromoleculen te pelleten en ze daardoor te zuiveren van andere cellulaire componenten. Verwijder voorzichtig het supernatant en suspendeer vervolgens elk pellet opnieuw in kamertemperatuur. Het volume van de ultrazuivere water resuspensie hangt af van het volume van de ultracentrifugebuizen die worden gebruikt.
Gebruik een volume dat de buizen ten minste halverwege vult, maar het maximale volume van de buizen niet overschrijdt. Herhaal het centrifugeren en wassen tot het water geen bubbels vormt tijdens de Resuspensie, wat aangeeft dat het SDS op dit punt volledig is verwijderd. Suspendeer de monsters opnieuw in 900 microliters tris HCL buffer en breng ze over naar twee milliliters buizen met gaten in de bovenkant.
Voeg met een kleine naald 100 microliters geactiveerde pronase E toe aan elk monster voordat u incubeert bij 60 graden Celsius gedurende twee uur. Stop de spijsvertering door 200 microliters 6% SDS toe te voegen aan elk monster en kook de monsters in de 100 graden Celsius heat block gedurende 30 minuten. Gebruik zoals eerder een ultracentrifuge ingesteld op 400.000 keer G om de monsters 20 minuten bij kamertemperatuur te draaien en was met kamertemperatuur ultrazuiver water tot het SDS volledig is verwijderd in de laatste centrifugatiestappen. Suspendeer de monsters opnieuw in 200 microliters 50 millimolair natriumfosfaatbuffer.
Dit volume kan worden aangepast aan de hoeveelheid Pepto glycaan in het monster en kan soortsafhankelijk zijn. Als het monster meer pep glycaan bevat, verhoogt u het suspensievolume. Als het monster weinig peptide glycaan bevat.
Verklein het suspensievolume tot een minimum van 50 microliters. Breng de monsters over naar 1,5 milliliters buizen en voeg een milligram per milliliter mease toe om een eindconcentratie van 40 microgram per milliliter te verkrijgen. Incubeer gedurende zes tot acht uur of een nacht in een 37 graden Celsius heat block.
Om monsters voor UPLC voor te bereiden, zet een heat block aan op 100 graden Celsius. Kook de monsters zonder SDS gedurende vijf minuten om de mease-vertering te stoppen, centrifugeer monsters gedurende 10 minuten bij 16.000 keer G bij kamertemperatuur.
De neuropeptiden bevinden zich nu in het supernatant. Breng het supernatant over naar 13 bij 100 millimeter glazen buizen. Probeer zoveel mogelijk supernatant te recupereren, kom heel dicht bij de palaat zonder het te verstoren.
Pas de pH aan door 500 millimolair boraatbuffer toe te voegen aan het monster voor een eindconcentratie van 100 millimolair boraatbuffer. Boor acht buffer is compatibel met het reducerende middel. Natriumborohydride voegt u verschillende korrels natriumborohydride toe om elk monster te reduceren en laat de reactie gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur verlopen. Pas vervolgens de monsters aan op pH zes zoals gemeten met pH-indicatorpapier met orthofosforzuur met behulp van 20 microliters incrementen, het monster zou moeten borrelen als react
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een procedure voor het isoleren en verteren van bacteriële celwanden om de neuropeptidesamenstelling te analyseren met behulp van Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC). De methode omvat het lysen van bacteriële monsters, het verteren om membranen te zuiveren, en het oplossen van peptidoglycaan in neuropeptiden voor analyse.
Belangrijkste Studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Microbiologie
- Analytische Scheikunde
Achtergrond
- De bacteriële celwand is voornamelijk samengesteld uit peptidoglycaan.
- Peptidoglycaan bestaat uit suikerstrengen die door peptiden worden verbonden.
- UPLC biedt hoge resolutie voor het analyseren van complexe mengsels.
- Het begrijpen van de neuropeptidesamenstelling is cruciaal voor verschillende biologische studies.
Doel van Studie
- Om bacteriële celwanden te isoleren voor neuropeptide-analyse.
- Om de identiteiten en relatieve fracties van neuropeptiden te bepalen.
- Om celwandkarakteristieken zoals kruisverbindingen en glycaanstrenglengte te kwantificeren.
Gebruikte Methoden
- Lyse van bacteriële monsters met behulp van natriumdodecylsulfaat (SDS).
- Uitspoelen van SDS om monsters voor te bereiden op vertering.
- Verteren van monsters met pronase E om buitenmembranen te verwijderen.
- Het oplossen van peptidoglycaan in neuropeptiden voor UPLC-analyse.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle isolatie van neuropeptiden uit bacteriële celwanden.
- Kwantificering van neuropeptidefracties bereikt door middel van UPLC.
- Inzichten in de structurele kenmerken van peptidoglycaan.
- Een beter begrip van de samenstelling van bacteriële celwanden.
Conclusies
- De procedure isoleert en analyseert effectief neuropeptiden.
- UPLC levert waardevolle gegevens over de eigenschappen van bacteriële celwanden.
- Deze methode kan worden toegepast op verdere studies in microbiologie en neurowetenschap.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This method enables high-resolution analysis of peptidoglycan composition, supporting target validation in antibacterial drug discovery by quantifying structural features such as cross-linking and glycan strand length. It provides mechanistic de-risking for lead identification by linking cell wall architecture to phenotypic outcomes in microbiology. The workflow enhances predictive confidence in preclinical models through reproducible, quantitative neuropeptide profiling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking peptidoglycan structure to bacterial morphology and pathogenesis.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative measurement of cell wall components.
- Scientific Value: Supports predictive confidence by de-risking mechanistic ambiguity in antibiotic mechanism of action studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by isolating pure peptidoglycan fractions.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via consistent cell wall preparation and UPLC quantification.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by providing quantitative readouts of cell wall integrity and biosynthesis inhibition.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by connecting cell wall composition to immune activation and virulence.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment through detectable neuropeptide shifts under genetic or environmental perturbation.
- Scientific Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking structural changes to functional outcomes in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, enabling iterative design-make-test cycles in antibacterial programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying peptidoglycan biosynthesis outputs.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs for evaluating inhibitors of cell wall assembly.
- Analytics: Provides high-resolution measurements of neuropeptide identity and abundance to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking structural data to phenotypic virulence and immune modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cell wall analysis across multiple targets, species, and strain backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cell wall-active compounds.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through defined isolation and UPLC-compatible preparation steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on cell wall integrity metrics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative data for mechanistic de-risking of antibacterial leads.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, protein digestion, and chromatographic analysis.
- Depends on access to ultracentrifuge and UPLC systems with compatible columns and detectors.
- Necessitates cross-team standardization for consistent SDS removal and pH adjustment across laboratories.
- Involves adaptation considerations for gram-positive bacteria requiring additional enzymatic steps.
- Limited by sample loss risks during multiple centrifugation and resuspension steps if not optimized.
