Bottom-up en Shotgun Proteomics een uitgebreide Cochlear Proteome Identificeer

Het algemene doel van het volgende experiment is om het grootste aantal eiwitidentificaties te bereiken vanuit het zintuigelijke epithelium van de cochlea met behulp van verschillende proteomische technieken. Dit wordt bereikt door de cochlea, het zintuigelijke epitheel van volwassen muizen te isoleren en te sonificeren in lysisbuffer om eiwit als tweede stap te verkrijgen. Verschillende verteringsstrategieën worden toegepast op volledige lysate of op gefractioneerd eiwitlysaat om de peptide- en eiwitsequentiedekking te verbeteren.

Vervolgens worden verschillende scheidingstechnieken gebruikt, waaronder sterke kationenuitwisseling en omgekeerde fasechromatografie om de monstercomplexiteit te verminderen vóór massaspectrometrieanalyse. De resultaten tonen identificatie van een groot aantal membraan- en oplosbare eiwitten voor het zintuigelijke epithelium van muizencochlea door het gebruik van meerdere proteomische benaderingen en een hoogwaardige massaspectrometer. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals antigeenmicroarray en tweedimensionale gelelektroforese is dat een groot aantal zowel oplosbare als membraaneiwitten worden geïdentificeerd, waardoor de cochleaire proteoomgegevens worden vergroot.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in biomarkers die gerelateerd zijn aan gehoor- en traanoogletsels, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals de identificatie van biomarkers die gerelateerd zijn aan leeftijd en borst- of longkanker. Deze methode kan ook worden toegepast op het onderzoek van andere biologische monsters zoals bloed. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we het beperkte proteomische dataset zagen die beschikbaar was van het binnenoor van zoogdieren, en in het bijzonder het beperkte aantal membraaneiwitten dat is geïdentificeerd voordat met deze procedure werd begonnen.

Isoleer het zintuigelijke epithelium van de cochlea van muizen op postnatale dag 30. Na het wassen van het weefsel met één x fosfaatbuffer, voeg 100 microliter lysisbuffer toe aan het weefsel en sonificeer het mengsel gedurende 30 seconden op ijs met behulp van een sonische desintegrator. Koel het lysate één minuut op ijs tussen elke sonificatie en sonificeer het monster vervolgens in totaal drie keer.

Centra fuseerde de suspensie bij 16.000 keer G bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Wanneer klaar, bewaar de supernatant voor vertering. Voeg vervolgens een 30 microliter aliquot van cochleair eiwitextract rechtstreeks toe aan een 30 K spinfilter en meng met 200 microliter acht molaire ureum in Riss HCL centrifuge.

De mengsel bij 14.000 keer G gedurende 15 minuten. Wanneer klaar, verdun de concentraat met 200 microliter acht molaire ureumoplossing en herhaal de centrifugatie onder dezelfde voorwaarden als voorheen. Voeg vervolgens 10 microliter van 10 XI oto acetamide en 90 microliter van acht molaire ureumoplossing toe aan de concentraat in de filter en vortex gedurende één minuut.

Na het plaatsen van het spinfilter in een microcentrifugerek, incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker na centrifugatie bij 14.000 keer G gedurende 10 minuten bij 0,1 microgram per microliter endo protease ly C in een verhouding van enzym tot eiwit van één tot 50, en incubeer het mengsel gedurende de nacht bij 30 graden Celsius. Wanneer klaar, voeg 40 microliter van 100 millimolar ammoniumbicarbonaatoplossing toe aan de filtereenheid en centrifugeer het mengsel bij 14.000 keer G gedurende 10 minuten Na herhaling van de vorige stap, was de filtereenheid met 40 microliter van acht molaire ureum. Was vervolgens de filtereenheid twee keer met 40 microliter milli Q-water.

Zodra de filtereenheid drie keer is gewassen met 100 microliter van 50 millimolar ammoniumbicarbonaatoplossing, voeg 0,4 microgram per microliter trypsine toe in een verhouding van enzym tot eiwit van één tot 100, en incubeer het mengsel gedurende de nacht bij 37 graden Celsius. Na incubatie, elueer de triptische peptiden door 40 microliter van 50 millimolar ammoniumbicarbonaatoplossing toe te voegen aan de filtereenheid en centrifugeer het mengsel bij 14.000 keer G gedurende 10 minuten. Herhaal vervolgens deze stap nog een keer.

Injecteer op dit punt 50 tot 100 microgram van verteerd eiwitmonster op een 200 bij 2,1 millimeter vijf micrometer sterke kationenuitwisselingskolom Om de peptiden te scheiden, controleert u de peptidefracties bij 280 nanometer en verzamelt u de fracties in twee minutenintervallen. Gebruik een fractiecollector en droog vervolgens de fracties in een vacuümconcentrator. Wanneer klaar, bewaar de gedroogde fracties bij min 80 graden Celsius totdat ze klaar zijn om te worden gebruikt voor vloeistofchromatografie.

Tandem massaspectrometrieanalyse. In een andere aanpak werd gelvrije fractionering gebruikt om het eiwitmengsel te scheiden. Zodra het cochleaire eiwitsupernatant is ontzout door acetonprecipitatie, voeg 30 microliter van vijf x monsterbuffer toe aan het ontzoutte eiwit dat eerder was opgeschort in 112 microliter Milli Q-water.

Voeg vervolgens acht microliter van één molair DTT toe en verhit het mengsel gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius om de eiwitdisulfidebindingen te verminderen. Laat het mengsel na verhitting afkoelen. Voeg acht milliliter lopende buffer toe aan het anodereservoir, 150 microliter lopende buffer aan de monsteropvangkamer en zes milliliter lopende buffer aan het kathodereservoir.

Volgend deze lading, 150 microliter van het cochleaire eiwitmengsel in de monsteropvangkamer, met behulp van een 8% trisacetaat cartridge met een massabereik van 3,5 tot 150 kilodalton. Na het starten van de run, verzamel het monster van de monsteropvangkamer bij elke onderbreking van het instrument met behulp van een pipet en voeg toe aan een vers gelabelde microbuis. Was vervolgens de opvangkamer twee keer met 150 microliter lopende buffer en gooi weg.

Na 1D gelelektroforese van de gelvrije fracties. Voeg elke individuele fractie direct toe aan een 30 K filtereenheid. Meng vervolgens elke fractie met