Name: In vivo optische beeldvorming van hersentumoren en artritis met fluorescerende SAPC-DOPS nanovesicles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer de MAROI-techniek voor in vivo fluorescentiebeeldvorming van hersentumoren en artritis bij muismodellen. Deze methode bepaalt optimale hoeken voor nauwkeurige signaalmeting.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mede ondersteund door NIH / NCI Grants nummer 1R01CA158372-01 (Qi) en New Drug State Key Project Grant Number 009ZX09102-205 (Qi). Het schrijven van hulp werd geboden door Dr Judy Racadio, en werd gefinancierd door de Universiteit van Cincinnati Afdeling Hematologie en Oncologie. Vontz Core Imaging Lab (VCIL) in het College of Medicine van de Universiteit van Cincinnati.

Ethiek verklaring van het gebruik van dieren. Alle dierlijke studies werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Cincinnati (IACUC Protocol Number: 11-05-05-02) en de Cincinnati Children&#39;s Hospital Research Foundation (Dierenwelzijn Assurance nummer A3108-01). Alle experimenten met muizen volgden het dier zorg richtlijnen van de Universiteit van Cincinnati en de Cincinnati Children&#39;s Hospital Research Foundation. 1. Bereid Animal Models Opmerking: Drie verschillende diermodellen hieronder beschreven werden gebruikt in onze eerdere studies: <ol><li> Orthotopische hersentumor muis: Gebruik nu / nu athymische vrouwelijke muizen die intracranially zijn ingespoten met menselijke U87-AEGFR-Luc cellen. Deze muizen ontwikkelen een agressieve tumor met typische kenmerken van de menselijke glioblastoma. </li><li> Genetisch gemanipuleerde hersentumor muismodellen 13: Kweek Mut3 (GFAP-cre; Nf1loxP / +; Trp53-/ +) mannelijke muizen met Trp53loxP/loxP; PtenloxP / loxP vrouwtjes Mut6 muizen genereren (GFAP-cre; Nf1loxP / +; Trp53-/loxP; PtenloxP / +). Handhaaf Mut3 muizen in B6CBAF1 / J stam door het fokken mannelijke Mut3 muizen met vrouwelijke B6CBAF1 / J muizen. Genotype de muizen tussen P9 en P12 en bevestig de genotypes na het oogsten van hun weefsels. </li><li> K / BXN artritis Gebruik C57BL/6J muizen die intraperitoneaal zijn toegediend met 150 pi sera van KRN x NOD F1 muizen. Deze muizen ontwikkelen artritis 24-48 uur na sera injectie. Beeldvorming van de artritis muizen wordt uitgevoerd op dag 7 na sera administratie, een tijdstip waarop muizen vertonen openlijke macroscopische artritis. Muizen worden geëvalueerd met behulp van de in de volgende stap criteria. <ol><li> Evaluatie van muismodellen voor macroscopische artritis volgens een artritis index macroscopisch scoringssysteem als volgt: 0 = geen detecteerbare artritis, 1 = zwelling en / of roodheid van poot of een cijfer, 2 = twee betrokken gewrichten, 3 = drie gewrichten opschorved, en 4 = ernstige artritis van de gehele poot en cijfers. De artritis scoresysteem wordt gebruikt om het aantal gewrichten aangetast en de ernst van artritis in de muis poten bepalen. Zelfs muizen met de hoogst mogelijke score artritis vertonen zelden tekenen van immobiliteit. Echter, artritis is bewaakte 3x/week en muizen in overmatige pijn (zoals ernstige immobiliteit van gezwollen poten die voedsel en water remt) worden opgeofferd. </li><li> Opmerking: Vloeistoffen IV geïnjecteerd in de muis staart ader hebben steriliteit gehandhaafd gedurende het experiment. Schone, steriele, disposable spuiten en flacons worden gebruikt voor studie oplossing bereiding en toediening. </li></ol></li></ol> 2. Bereiding van fluorescent-gelabelde SAPC-DOPS nanovesicles <ol><li> SAPC eiwitproductie: Recombinant SAPC eiwit met exacte menselijke SAPC sequentie werd in E. geproduceerd coli cellen zoals eerder beschreven modificaties 4.SAPC werd geprecipiteerd met ethanol gevolgd door hogedrukvloeistofchromatografie zuiveringen. Na vriesdrogen werd droog SAPC gebruikt en de concentratie werd bepaald door het gewicht. </li><li> Meng SAPC eiwit zoals eerder beschreven 7,10,11. Mix DOPS (0,18 mg) en CVM (0,03 mg) in een glazen buis en gebruiken stikstofgas om vetoplossers verdampen. </li><li> Voeg SAPC eiwitpoeder (0,32 mg) aan het mengsel, opschorten het droge mengsel in 1 ml PBS buffer en bad ultrasone trillingen gedurende ongeveer 15 minuten zoals eerder beschreven 7,10,11. Laat vervolgens de suspensie door een Sephadex G25 kolom (PD-10) om gratis CVM kleurstof te verwijderen. Excitatie en emissie maxima van het eindproduct, namelijk SAPC-DOPS CVM nanovesicles, zijn 653 nm en 677 nm respectievelijk. </li></ol> 3. Imaging <ol><li> Gebruik hersentumor en artritis muismodellen (beschreven in stap 1) tot het Maroi systeem te testen. Verdoven muizen te bewerkstelligen met 2% isofluraan. 1-2% isofluraan is maintained voor de duur van de beeldvormende procedure. Warme lucht wordt continu en voorzichtig afgeleverd in de beeldvorming kamer gedurende de duur van beeldvorming. Een bolletje steriele kunsttranen zalf op elk oog van de muis om dekking en smeer het oog. Plaats muizen in het MARS systeem plaatsen van de muizen in een liggende positie met de rug eerst gericht op de camera (figuur 1). Kalibreer de MARS 380 ° steun film en de positie van de muis met behulp van de rotatie-software in het tabblad Bruker MI protocol. Verkrijgen basislijn beelden van muizen voor SAPC-DOPS CVM toediening op de hieronder beschreven wijze. </li><li> Injecteer 200 ui van SAPC-DOPS CVM intraveneus in de staartader van de muis. Dienen aan muizen en artritis of de hersenen tumor-dragende muizen beheersen. </li><li> Afbeelding muizen 24 uur na injectie en weer op 7-9 dagen na de injectie door middel van fluorescentie (25 sec belichtingstijd) en X-ray (10 sec belichtingstijd) images in stappen van 10 ° over een cursus van 380 °, het creëren van een kleine overlapping om ervoor te zorgen dat er geen gaten in de rotatie-dataset. Met behulp van Bruker MI software, superimpose fluorescerende op X-ray beelden voor anatomische lokalisatie. </li></ol> 4. Beeldanalyse <ol><li> Teken een rechthoekige ROI omvat de breedte van het gezichtsveld (FOV) van de ziekteplaats (tumor en artritis). De ROI moet groot genoeg zijn om de functie ziekte binnen het ZV houden wanneer het dier beweegt tijdens de 380 ° rotatie. Voor hersentumor muizen (orthotopic en transgene modellen), maken gebruik van dezelfde rechthoekige ROI op elke tumor model en zijn drie (3) respectieve controle muizen voor alle tijdstippen (baseline, 24 uur, en 9 dagen). De positionering van de rechthoekige ROI voor elke muis wordt behouden over alle tijdstippen door het gebruik van anatomische oriëntatiepunten op overeenkomstige X-ray beelden van elk dier. De anatomische landmark (s) die op de tumor model moet worden gebruikt place identieke rechthoekige ROI op respectieve controles elk model. Anatomische oriëntatiepunten vastgesteld op de X-ray beelden waardoor consistente ROI plaatsing onder de basis van de schedel en het achterste deel van het jukbeen. Zij worden gevisualiseerd aan de rechter en linker laterale schedel in het beeld posterior-anterior (PA). </li><li> Na de automatische achtergrond aftrekken, bepalen de gemiddelde fluorescentie-intensiteit voor elk beeld. De fluorescentie afbeeldingen omzetten in fotonen / s / mm 2 met behulp van Bruker MI beeldbewerkingssoftware. Teken de fluorescentie waarden als functie van de beeldvormende hoeken, en gelden als error bars de standaarddeviatie van de gemiddelde fluorescentie waarden verkregen uit controle muizen met Excel of andere grafische software. </li></ol>

<ol><li>Pizzonia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+animal+rotation+imaging+system+%28Mars%29+for+in+vivo+detection+of+intraperitoneal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors.</a> Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).</li>
<li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+depth+of+cellular+imaging+in+the+intact+lung+using+far-red+and+near-infrared+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biomed+Imaging%22%5BJournal%5D)">Increased depth of cellular imaging in the intact lung using far-red and near-infrared fluorescent probes.</a> Int J Biomed Imaging. , (2006).</li>
<li>Gertner-Dardenne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+fluorochrome+trackers+of+membrane+transfers+between+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells.</a> Immunol Invest. 36, 665-685 (2007).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+human+saposins+expressed+in+Escherichia+coli.+Evidence+for+binding+and+activation+properties+of+saposins+C+with+acid+beta-glucosidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional human saposins expressed in Escherichia coli. Evidence for binding and activation properties of saposins C with acid beta-glucosidase.</a> J Biol Chem. 269, 16746-16753 (1994).</li>
<li>Wang, Y., Grabowski, G. A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+vesicle+fusion+induced+by+saposin%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Phospholipid vesicle fusion induced by saposin.</a> C. Arch Biochem Biophys. 415, 43-53 (2003).</li>
<li>Qi, X., Chu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusogenic+domain+and+lysines+in+saposin%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fusogenic domain and lysines in saposin.</a> C. Arch Biochem Biophys. 424, 210-218 (2004).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-selective+targeting+and+cytotoxicity+by+liposomal-coupled+lysosomal+saposin+C+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer-selective targeting and cytotoxicity by liposomal-coupled lysosomal saposin C protein.</a> Clin Cancer Res. 15, 5840-5851 (2009).</li>
<li>Kaimal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saposin+C+coupled+lipid+nanovesicles+enable+cancer-selective+optical+and+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Saposin C coupled lipid nanovesicles enable cancer-selective optical and magnetic resonance imaging.</a> Mol Imaging Biol. 13, 886-897 (2011).</li>
<li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+can+recognize+SapC-DOPS+to+stimulate+macrophages+to+express+several+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 can recognize SapC-DOPS to stimulate macrophages to express several cytokines.</a> Inflamm Res. 60, 153-161 (2011).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saposin+C+coupled+lipid+nanovesicles+specifically+target+arthritic+mouse+joints+for+optical+imaging+of+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Saposin C coupled lipid nanovesicles specifically target arthritic mouse joints for optical imaging of disease severity.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Abu-Baker, S., Chu, Z., Stevens, A. M., Li, J., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+and+selectivity+in+skin+cancer+by+SapC-DOPS+nanovesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity and selectivity in skin cancer by SapC-DOPS nanovesicles.</a> Journal of Cancer Therapy. 3, 321-326 (2012).</li>
<li>Wojton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+SapC-DOPS+has+antiangiogenic+and+antitumor+effects+against+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of SapC-DOPS has antiangiogenic and antitumor effects against glioblastoma.</a> Mol Ther. 21, 1517-1525 (2013).</li>
<li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+haploinsufficiency+accelerates+formation+of+high-grade+astrocytomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Pten haploinsufficiency accelerates formation of high-grade astrocytomas.</a> Cancer Res. 68, 3286-3294 (2008).</li>
</ol>

Er is niets te onthullen.

Nauwkeurige bepaling van de locatie en de omvang van solide tumoren en inflammatoire foci bij reumatische aandoeningen is van cruciaal belang om een ​​adequate behandeling te implementeren en opvolgen ziekteprogressie of kwijtschelding. Terwijl waardevolle, de huidige grafische strategieën (X-stralen, MRI, echografie, X-ray tomografie) onvolledige beoordeling van de status van de ziekte. Zo wordt artritis gewrichtsschade gewoonlijk bepaald door X-stralen, die gegevens over botstructuur maar niet op zacht weefsel ontsteking en vernietiging, kenmerkend vroege stadia van de ziekte bepaalt. De Maroi hier gepresenteerde methode combineert de voordelen van zowel röntgenstraling en verfijnde zachte weefsel beeldvormende modaliteiten (bijv. MRI of echografie) een geïntegreerde, niet-invasieve en eenvoudigere platform dat ook zorgt voor een volledige 3D mapping en reconstructie van het zieke weefsel of orgaan in kleine dieren zoals muizen. Deze methode maakt gebruik van de selectieve affiniteit of SAPC-DOPS nanovesicles voor blootgestelde fosfatidylserine residuen, die overvloedig in de membranen van kanker en inflammatoire cellen. De determinant van deze binding is SAPC, een fusogene lysosomale eiwit met een sterke affiniteit voor anionische fosfolipiden zoals fosfatidylserine 7,10,11. Wanneer geconjugeerd aan een fluorescente probe (CVM), kunnen systemisch geïnjecteerd SAPC-DOPS naar tumor en artritis locaties worden opgespoord door fluorescentie beeldvorming. Beperkingen van onze methode zijn gerelateerd aan de gevoeligheid, die op dit moment beperkt het gebruik ervan tot beeldvorming van kleine dieren zoals muizen. Zoals met andere beeldvormende werkwijzen wordt optimaal fluorescent signaal ruisverhouding beperkt door de grootte van de tumor of de omvang van artritis en kunnen gecompromitteerd bij beeldvorming weefsels of organen met een hoge achtergrond (autofluorescentie) zoals oren (brain imaging), darmen / feces (abdominale beeldvorming) en poten (achterste ledematen imaging). Daarbij vonden we dat een ver-rode kleurstof zoals CVM probepaalt betere spectrale scheiding en oplossing in de in vivo omgeving dan andere fluorescerende probes in het zichtbare gebied. Andere valkuilen zijn onder potentiële beweging van het dier tijdens de beeldvorming, zowel tijdens narcose en post mortem (rigor mortis). Achterste ledematen positionering, bijzonder vaak moeilijk te stabiliseren beweging tijdens rotatie te voorkomen. In de huidige staat van de techniek is ook tijdrovend, met scan keer zo lang als 60 minuten nodig om een ​​volledige omwenteling te voltooien en het verwerven van beelden van hoge kwaliteit. De Maroi methode biedt een aantal voordelen ten opzichte van andere beeldvormende modaliteiten. De mogelijkheid om het zieke weefsel van 38 (of meer) verschillende hoeken maakt visualisatie van de fluorescentie die wordt belemmerd bij de beoordeling uit een enkel vlak; Dit is waardevol in dierstudies omdat het kan helpen verminderen het aantal valse negatieven als gevolg van beeldvorming op ongepaste hoeken. Door overdrukying röntgen en fluorescentiebeelden, kan een nauwkeurige anatomische lokalisatie van de zieke plaats worden bepaald. Tenslotte, de mogelijkheid van levende (in vivo) beeldvorming maakt longitudinale onderzoek wordt uitgevoerd.

Hele dier beeldvorming is uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel in de studie van dierlijke fysiopathologie. Onder de huidige beeldvormende systemen, de MS FX PRO stelt onderzoekers in staat om nauwkeurig te visualiseren fluorescent gelabelde (of lichtgevende) verbindingen en / of weefsels in levende muizen, en tegelijkertijd krijgen röntgenbeelden. Met de onlangs geïntroduceerde multimodale rotatie dierlijke (MARS) volledig geautomatiseerde rotatie van de muis wordt bereikt om zowel fluorescerend / luminescente en röntgenbeelden op specifieke hoeken vastleggen 1. Beeldacquisitie kan zodanig zijn dat opeenvolgende reeks beelden kunnen worden vastgelegd op specifieke, incrementele hoeken zo klein als 1 ° worden geprogrammeerd. Hierdoor kan men de optimale oriëntatie van het dier, dat wil zeggen identificeren. waarin de afstand tussen de intern gegenereerde fluorescent / luminescent signaal en detectie-inrichting van het systeem is de kortste. Dit op zijn beurt maakt nauwkeurige herpositionering van het dier voor verdere beeldvorming sessions tijdens longitudinale studies. In dit rapport beschrijven we de implementatie van een multi-angle rotatie optische beeldvorming (Maroi) systeem voor in vivo kwantificatie van fluorescente marker intensiteit. Maroi signaalverloop analyse kan worden gebruikt in longitudinale studies directe correlatie van fluorescentiesignaal verdeling nauwkeurig in kaart zieke sites of biologische processen plaats. Dit systeem werd gebruikt voor het bewaken van de absorptie van fluorescent gelabelde SAPC-DOPS nanovesicles door orthotope en spontane tumoren, alsmede door artritis foci in levende muizen; verstrekte multispectrale en multimodale datasets afkomstig van volledige rotatie dekking van de dieren. Onder de talrijke fluorescente probes beschikbaar voor in vivo beeldvorming, die emitteren in het nabije infrarood en ver-rode spectrale gebieden verlenen de laagste interferentie met de huid en weefsels, en bieden de hoogste penetratie en het resolution. We gebruikten CellVue Maroon (CVM) 2,3, een ver-rood fluorescerende cel linker (Ex 647/Em 667), om SAPC-DOPS (SAPC-DOPS-CVM) 4-12 labelen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>11965</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetaal Runderserum</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>16000077</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycine</td><td>Hyclone (Logan, Utah)</td><td>SV30010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dioleoylphosphatidylserine</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)</td><td>840035C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellVue Maroon</td><td>Molecular Targeting Technologies, Inc. (Exton, PA)</td><td>C-1001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sephadex G25 kolom PD-10</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, (Piscataway, NJ)</td><td>17-0851-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nieuwe standaard Stereotaxic voor ratten en muizen</td><td>Harvard Apparatus (Holliston, MA)</td><td>726335</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bransonic Ultrasoonreinigers Model 1510</td><td>Branson Ultrasonics (Danbury, CT)</td><td>CPN-952-118</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Multi-spectral FX systeem</td><td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Multi-hoek Rotatie Optisch Beeldvormingsapparaat</td><td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vivo optische beeldvorming van hersentumoren en artritis met fluorescerende sapc-dops nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We beschrijven een multi-angle rotatie optische beeldvorming (Maroi) systeem voor in vivo opvolging van pathofysiologische processen gelabeld met een fluorescente marker. Muismodellen (hersentumor en artritis) werden gebruikt om de bruikbaarheid van deze methode te evalueren. Saposine C (SAPC)-dioleoylfosfatidylserine (DOPS) nanovesicles getagd met CellVue Maroon (CVM) fluorofoor werden intraveneus toegediend. Dieren werden vervolgens in de roterende houder (MARS) van de in vivo imaging systeem. Beelden werden in 10 ° stappen verworven meer dan 380 °. Een rechthoekige regio van belang (ROI) werd over de volle breedte afbeelding geplaatst op de modelziekte website. Binnen de ROI, en voor elk beeld, werd de gemiddelde fluorescentie-intensiteit berekend mits achtergrond aftrek. In de muismodellen onderzocht werden de gemerkte nanovesicles opgenomen in zowel de orthotope en transgene hersentumoren, en de artritische plekken (tenen en enkels). Curve analyse van de multi angle image ROI bepaald de hoek met het sterkste signaal. Zo is de optimale hoek voor beeldvorming elke ziekte plaats werd gekarakteriseerd. De Maroi toegepast op beeldvorming van fluorescente verbindingen is een niet-invasieve, economische en nauwkeurig hulpmiddel in vivo kwantitatieve analyse van de ziektetoestanden beschreven muismodellen.

We tonen hier dat SAPC-DOPS nanovesicles gelabeld met een ver-rode kleurstof (CVM) specifiek accumuleren in orthotope en spontane muis hersentumoren, alsook in artritische gewrichten van K / BXN muizen. Seriële fluorescentie / röntgenbeelden verkregen van een ROI geplaatst over elk ziekteplaats in volledige rotaties van de muizen werden onderworpen aan Maroi curve analyse, die de optimale imaging hoek met de hoogste fluorescentie-intensiteit geopenbaard. Het primaire doel volgens de MARS systeem is de optimale hoek van fluorescentie bepalen zodat de meest nauwkeurige metingen kunnen worden verricht. Representatieve resultaten van drie experimenten met muizen met hersentumoren of artritis getoond. Met SAPC-DOPS CVM en MARS (figuur 1), het best mogelijke beeld hoek voor het observeren van de tumor of ontsteking als gevolg van artritis werd bepaald. Fluorescentiebeelden, gevolgd door een X-ray overname werden verworven om de 10 °tijdens een 380 ° rotatie van de muis. Fluorescentie beelden werden bedekt op de bijbehorende X-ray beelden voor het display en rotatie film generatie. Resultaten van de orthotope hersentumor model worden gedemonstreerd in Figuur 2. De fluorescentie beeld van een representatief orthotope tumordragende muizen (Ortho1) wordt getoond in Figuur 2A. De optimale beeldhoek voor dit dier is 10 °, de positie waar het foton fluorescentie-intensiteit het grootst (figuur 2B). Metingen werden genomen vóór de injectie met SAPC-DOPS-CVM (baseline) en 24 uur na de injectie. Controlemuizen (tumorvrij) een soortgelijke behandeling. Figuur 3 toont vergelijkbare gegevens van de genetisch gemanipuleerde hersentumor muismodel. De fluorescentie beelden en foton metingen werden genomen vóór de injectie met SAPC-DOPS-CVM (baseline) en 24 uur (Figuren 3A en &lt;strong&gt; 3B) en 9 dagen (figuur 3C) na injectie. Deze grafieken laten zien dat de optimale beeldvorming hoek in het tumor-dragende dieren (Tumor Mut49) is 20 ° 24 uur na de injectie, maar verandert in 10 ° 9 dagen na de injectie. Dit suggereert dat fluorescentiesignaal verandering gecorreleerd met morfologische veranderingen, waarschijnlijk als gevolg van tumorgroei. Zoals getoond in Tabel 1, de Maroi methode duidelijk dat het fluorescentiesignaal af voor projecties bij toenemende draaiing van het optimale imaging hoek. Bij hersentumoren, een 7% gemiddelde afname in fluorescerend signaal werd verkregen als fysieke oriëntatie van het dier was ± 10 ° ten opzichte van de optimale beeldvorming hoek. Een gemiddeld 21% afname in fluorescentiesignaal werd gemeten bij ± 20 °. Dus relatief kleine offsets de optimale hoek kan leiden tot aanzienlijke signaalverzwakking. Gebruik makend van de Maroi techniek voor het positioneren zullen inve toestaanstigators meer consistente en betrouwbare gegevens. De Maroi methode werd uiteindelijk gebruikt om de gerichtheid van artritis gewrichten door SAPC-DOPS CVM 24 uur na SAPC-DOPS CVM-injectie te evalueren. Dit dier scoorde 3 met drie artritis gewrichten. Fluorescentie afbeeldingen van teen en enkel van de artritische muis zijn getoond in Figuren 4A en 4B. Overeenkomstige foton metingen bij 10 ° rotatie intervallen in een grafiek weergegeven in figuur 4C en 4D. De optimale imaging hoeken gevonden teen en enkel zijn 140 ° en 120 °, resp. Samengevat, de combinatie van het Maroi systeem met fluorescerende SAPC-DOPS nanovesicles vertegenwoordigt een niet-invasieve, nauwkeurige en gevoelige strategie voor levende beeldvorming, die zorgt voor kwantitatieve studies van tumor progressie en artritis bij gezelschapsdieren. De mogelijkheid van het verwerven van een 360 ° multimodale beeldvorming dataset aanzienlijk improves data analyse en interpretatie, in vergelijking met wat haalbaar is met behulp van een enkele hoek beeldvormende technieken. <img alt="Tabel 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187table1.jpg" width="600px" /> Tabel 1. Optimale beeldvorming hoeken voor elke muis model. De verschillen tussen de hoek van de maximum foton fluorescentie (FLR optimale hoek) en de standaard anatomische hoek (X-ray) kan worden gezien. Wanneer deze twee invalshoeken steeds anders, het gemeten signaal aanzienlijk verandert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1.jpg" width="600px"/&gt; Figuur 1. Multi-angle rotatie optische beeldvorming (Maroi) apparaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2.jpg" width="600px" /> Figuur 2. Fluorescentie signaal versus beeldhoek in een orthotope hersentumor muismodel. (A). Afbeelding van de piek fluorescentiesignaal op het optimale beeld hoek van 10 °. De blauwe doos toont de ROI gebruikt om de uitgezonden fotonen kwantificeren. (B). Grafiek van de beeldhoek versus fotonemissie. De vertegenwoordiger orthotopic tumor-dragende muizen (Ortho1) wordt getekend tegen de gemiddelde fluorescentie waarden uit identieke ROI in drie nontumor muizen. Metingen werden genomen bij aanvang (voor injectie) en 24 uur na injection. Fout balken geven standaarddeviatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3.jpg" width="600px" /> Figuur 3. Fluorescentie signaal versus beeldhoek in een spontane hersentumor van een genetisch gemanipuleerde muis model. (A). Afbeelding van de piek fluorescente signaal van ROI 1 (bovenste blauwe doos) op de optimale beeldhoek van 20 °. (B) en (C). Grafieken van de beeldhoek versus fotonemissie van ROI 1. Waarden uit een vertegenwoordiger spontane hersentumor-dragende muizen, Tumor-Mut 49, in een grafiek weergegeven tegen gemiddelde waarden van drie niet tumor muizen. Metingen werden genomen bij basislijn (voor injectie) en 24 uur (B) en 9 dagen (C) na injectie. Fout b<html> ars vertegenwoordigen standaarddeviatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4.jpg" width="600px" /> Figuur 4. Fluorescentiesignaal versus beeldhoek in een muis met artritis van de teen en enkelgewrichten. (A) en (B). Beelden die de piek fluorescerende signaal voor de tenen (A) en enkelgewrichten (B), binnen de in de rode doos ROI. (C). Grafiek van de hoek versus betekenen foton emissie voor de teen. Peak fotonemissie kan gezien worden onder een hoek van 140 ° (D) Grafiek van hoek versus betekenen foton emissie voor de enkel..; maximale intensiteit plaatsvindt onder een hoek van 120 °.target = &quot;_blank&quot;&gt; Klik hier voor grotere afbeelding.

We beschrijven een multi-angle rotatie optische beeldvorming (Maroi) systeem voor in vivo kwantificatie van een fluorescerende marker door saposine C (SAPC)-dioleoylfosfatidylserine (DOPS) nanovesicles geleverd. Gebruikmakend muismodellen van kanker en artritis, laten we zien hoe de Maroi signaalverloop analyse kan worden gebruikt voor een nauwkeurige kartering en biologische karakterisering van ziekteprocessen.

In vivo optische beeldvorming van hersentumoren en artritis met fluorescerende SAPC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Het algemene doel van deze procedure is om 360 graden in vivo beeldvorming van een muis uit te voeren om de optimale hoek voor fluorescentieanalyse te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de orthotope hersentumor-, de gemanipuleerde hersentumor- en de artritis-diermodellen voor te bereiden. Vervolgens wordt SAPs C-eiwit geproduceerd en worden SAP D-O-P-S-C-V-M nanovesikels bereid.Vervolgens worden de nanovesikels in de staartvin van de dieren geïnjecteerd. Ten slotte worden fluorescentie- en röntgenbeelden gemaakt en geanalyseerd. Uiteindelijk wordt de M-A-R-O-I-methode gebruikt om de optimale hoek voor fluorescentiebeeldanalyse aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals 2D planaire fluorescentie-beeldvorming, is dat de M-A-O-M-A-R-O-I-methode onderzoekers in staat stelt om de optimale hoek voor de analyse van fluorescentie-beeldvorming te bepalen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie en diagnose van kanker en artritis, aangezien CEP CS Vesical zich kan richten op tumoren en ontstoken weefsel. Alle dierstudies zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Cincinnati en de Cincinnati Children's Hospital Research Foundation om deze studies en het orthotope hersentumormodel bij muizen uit te voeren.Er wordt gebruikgemaakt van een genetisch gemodificeerd muismodel voor hersentumoren en een A-K-B-X-N artritis-muismodel. Volg het tekstprotocol en gebruik een macroscopisch scoringssysteem voor de artritisindex om de muizen als volgt te evalueren op artritis: nul staat voor geen detecteerbare artritis, één voor zwelling en/of roodheid van de poot of één teen, twee voor twee betrokken gewrichten, drie voor drie betrokken gewrichten en vier voor ernstige artritis van de gehele poot en teen. Produceer recombinant humaan SAPs C-eiwit in E. coli-cellen, precipiteer dit vervolgens met ethanol en zuiver het eiwit middels high performance liquid chromatography; bepaal na lyofilisatie de concentratie van droog SAP C op basis van het gewicht. Om het SAP C-eiwit te mengen, combineert u 0,18 mg DOPS en 0,03 mg CVM in een glazen buisje en gebruikt u stikstofgas om de lipidsolventen te verdampen.Voeg vervolgens 0,32 milligram SAPs zee-eiwitpoeder toe aan het mengsel. Suspendeer het droge mengsel in één milliliter PBS-buffer en soniciseer dit in een bad gedurende 15 minuten. Leid de suspensie door een Cidex G 25-kolom om vrije CVM-kleurstof te verwijderen.SAP C-D-O-P-S-C-V-M nanodeeltjes hebben excitatie- en emissiemaxima van respectievelijk 653 nanometers en 677 nanometers. Om de multi-angle rotational optical imaging- of M-A-R-O-I-methode met het Mars-systeem te testen, wordt een muis uit een van de beschreven muismodellen geanestheseerd met 2% ISO fluorine en in rugligging in het Mars-systeem geplaatst. Richt de ruggengraat naar de camera via het voorbeeldscherm van het brucker MI rotator-tabblad en kalibreer de Mars 380-graden steunfolie. Om de muis te positioneren voor het toedienen van SAPs C-D-O-P-S-C-V-M in de staart, injecteer dan 200 microliters intraveneus. Neem 24 uur later, en vervolgens zeven tot negen dagen na de injectie, fluorescentie- en röntgenbeelden in stappen van 10 graden over een traject van 380 graden, waarbij een lichte overlap wordt gecreëerd om te garanderen dat er geen hiaten in de rotationele dataset ontstaan.Gebruik de Bruker-rotatiesoftware om fluorescentiebeelden over röntgenbeelden te leggen voor anatomische lokalisatie. Trek ter analyse van de beelden een rechthoekig interessegebied, of ROI, dat de breedte van het gezichtsveld, of FOV, van de plek van de aandoening bij muizen met hersentumoren omvat. Gebruik dezelfde ROI voor elk tumormodel en de respectievelijke controlemuizen voor alle tijdspunten, waarbij anatomische herkenningspunten worden gebruikt om de positie van de ROI te markeren na automatische achtergrondsubtractie.Bepaal de gemiddelde fluorescentie-intensiteit voor elke afbeelding door de Brucker MI-software te gebruiken om de fluorescentiebeelden om te zetten in fotonen per seconde per vierkante millimeter; zet de fluorescentiewaarden uit als functie van de beeldvormingshoeken en pas foutenbalken toe. De standaarddeviatie van de gemiddelde fluorescentiewaarden verkregen van controlemuizen. De fluorescentieafbeelding van een representatieve muis met een orthotope tumor wordt in deze figuur getoond.We tonen hier aan dat SAPs seed, DOPS-nanovesikels gelabeld met een ver-rood fluorescentiemiddel, specifiek accumuleren in orthotope en spontane hersentumoren bij muizen, alsook in arthritische gewrichten van KBXN-muizen. Het primaire doel van het Mars-systeem is het bepalen van de optimale fluorescentiehoek, zodat de meest nauwkeurige metingen kunnen worden verricht, zoals hier te zien is. De optimale beeldhoek voor dit dier is 10 graden.De positie waar de fluorescentie-fotonintensiteit het grootst is. Baseline-metingen werden uitgevoerd vóór de injectie van SAP C-D-O-P-S-C-V-M, en 24 uur na de injectie kregen tumorvrije controlemuizen een soortgelijke behandeling. Deze figuren tonen vergelijkbare gegevens van het genetisch gemodificeerde hersentumormuismodel. De fluorescentiebeelden en fotonmetingen werden genomen bij de baseline, 24 uur en negen dagen na injectie van SAP C-D-O-P-S-C-V-M.De grafieken laten zien dat de optimale beeldvormingshoek in het tumor dragende dier tumor mute 49 20 graden is, 24 uur na injectie, maar verandert naar 10 graden negen dagen na injectie. Dit suggereert dat de wijziging in het fluorescentiesignaal correleert met morfologische veranderingen die waarschijnlijk wijzen op tumorgroei. Zoals in deze tabel wordt getoond, bewijst de M-A-R-O-I-methode duidelijk dat het fluorescentiesignaal afneemt bij projecties met een toenemende rotatie weg van de optimale beeldvormingshoek.Bij hersentumoren werd een gemiddelde afname van 7% in het fluorescentiesignaal verkregen wanneer de fysieke oriëntatie van het dier meer dan plus of minus 10 graden afweek van de optimale beeldvormingshoek. Bij plus of minus 20 graden werd een gemiddelde afname van 21% in het fluorescentiesignaal gemeten.Hierdoor kunnen relatief kleine afwijkingen van de optimale hoek leiden tot aanzienlijke procentuele afnames van het signaal. Het gebruik van de M-A-R-O-I-techniek voor de positionering van beelden stelt onderzoekers in staat om consistentere en betrouwbaardere gegevens te produceren. De M-A-R-O-I-methode werd uiteindelijk gebruikt om de targeting van arthritische gewrichten door SAPs C-D-O-P-S-C-V-M 24 uur na injectie te beoordelen.Dit dier scoorde drie met drie artritische gewrichten. Fluorescentiebeelden van de teen en enkel van de artritische muis worden hier getoond op basis van grafieken van de overeenkomstige fotonmetingen. Bij rotaties van 10 graden zijn de optimale beeldbewerkingshoeken gevonden voor de teen en enkel respectievelijk 140 graden en 120 graden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u M-A-R-O-I-gegevens moet voorbereiden en verzamelen, waardoor onderzoekers de optimale hoek voor fluorescentiebeeldanalyse kunnen bepalen.

in-vivo-optical-imaging-brain-tumors-arthritis-using-fluorescent-sapc

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Diffuse fluorescentie tomografie biedt een relatief goedkope en potentieel hoge hele benadering van de...

Computed Tomography-begeleide tijd-domein Diffuus fluorescentie tomografie in kleine dieren voor het lokaliseren van Cancer Biomarkers

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

A Novel Hoge-resolutie<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging techniek om de Dynamic Response van intracraniële structuren om tumorgroei en Therapeutics Studie

Dit manuscript beschrijft een procedure om de herinrichting van de cerebrovasculature volgen tijdens amyloïde plaque accumulatie in vivo met behulp van longitudinale twee-foton microscopie. Een uitgedunde schedel bereiden voor de visualisatie van fluorescente kleurstoffen om de progressie van cerebrovasculaire schade te beoordelen in een muizenmodel van de ziekte van Alzheimer.

lengte-<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging van de Cerebrovasculature: Relevantie voor CNS ziekten

Dit protocol beschrijft de intravital beeldvorming van transgene muizen uiting van cel-specifieke fluorescente markeringen. Intravital imaging biedt een niet-invasieve methode voor hoge resolutie waarnemingen in levende dieren met behulp van implanteerbare windows waardoor de microscopische visualisatie van de processen mogelijk is. Deze methode is vooral handig om longitudinale processen te bestuderen.

Intravital microscopie van Tumor-geassocieerde therapieën met behulp van geavanceerde dorsale huidplooien venster Chambers op transgene fluorescerende muizen

In dit artikel wordt de toepassing van fluorescerende beeldvorming beschreven met behulp van een activeerbare optische beeldsensor om de in vivo activiteit van belangrijke matrixmetalloproteinasen te visualiseren in twee verschillende experimentele modellen van ontsteking.

Niet-invasieve<em&gt; In Vivo</em&gt; Fluorescentie Optische Imaging van Inflammatorische MMP Activiteit Met behulp van een Activateerbare Fluorescerende Imaging Agent

We voeren een in vivo imaging methode met behulp van twee verschillende fluorescente kleurstoffen om dynamische spinale vasculaire wijzigingen na een contusive dwarslaesie bij volwassen Sprague-Dawley ratten te houden.

Een In Vivo Duo-kleur methode voor Imaging-vasculaire Dynamics na Contusive dwarslaesie

Hier beschrijven we een methode voor High-Resolution time-lapse multiphoton Imaging van hersentumor cellen voor en na invasieve chirurgische ingrepen (bijv. biopsie) binnen hetzelfde levende dier. Deze methode maakt het bestuderen van de impact van deze invasieve chirurgische ingrepen op tumorcellen ' migratie, invasief, en proliferatief gedrag op een enkel celniveau.

Longitudinale Intravital beeldvorming van hersen tumor Celgedrag in reactie op een invasieve chirurgische biopsie

Transcraniële optische beeldvorming maakt het mogelijk om het transport van cerebrospinale vloeistof in de cortex van levende muizen door middel van een intacte schedel te Imaging.

In vivo beeldvorming van cerebrospinale vloeistof transport door de intact Mouse schedel met behulp van fluorescentie Macroscopie

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie maakt labelvrije beeldvorming van biomoleculen mogelijk op basis van hun intrinsieke vibratie van specifieke chemische bindingen. In dit protocol wordt de instrumentele opstelling van een geïntegreerde SRS- en twee-fotonenfluorescentiemicroscoop beschreven om cellulaire structuren in het ruggenmerg van levende muizen te visualiseren.

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

We presenteren een nieuwe benadering voor twee-fotonmicroscopie van de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide-nanodeeltjes aan glioblastoom in een muismodel.

Intravitale microscopie met twee fotonen van glioblastoom in een muizenmodel

Leer de MAROI-techniek voor in vivo fluorescentiebeeldvorming van hersentumoren en artritis bij muismodellen. Deze methode bepaalt optimale hoeken voor nauwkeurige signaalmeting.

In vivo optische beeldvorming van hersentumoren en artritis met fluorescerende SAPC-DOPS nanovesicles

Meer video's verkennen