Visualiseren neuroblast Cytokinese Tijdens C. elegans Embryogenese

Het algemene doel van het volgende experiment is om delende cellen binnen een zich ontwikkelend weefsel tijdens de embryogenese van C elegans te observeren. Om genen die de celdeling controleren te bestuderen, wordt dit bereikt door een C elgan-stam te creëren of te verkrijgen die stabiel transgene markeringen tot expressie brengt die de cellen van belang labelen. Als tweede stap wordt selectief een gen van belang uitgeschakeld door D-S-R-N-A gedurende 24 tot 48 uur aan L vier larven te voeren.

De RNAI-embryo's worden verzameld van grafische hermafrodiets en overgebracht naar een aros-pad voor live beeldvorming. Vervolgens worden embryo's geïmagerd met behulp van brede veld- of confocale microscopie om deelfenomen van celdeling te visualiseren. De resultaten zullen laten zien hoe neuroblasten zich verdelen tijdens de embryogenese van sea elgin, en de rol van genen die nodig zijn voor hun deling.

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van ontwikkelings- en celbiologie te onthullen. Deze methode zou bijvoorbeeld genen en mechanismen kunnen onthullen die betrokken zijn bij het reguleren van mitose tijdens weefselontwikkeling, cel-celcommunicatie, celmigratie of celpolariteit. Gebruik transgene wormen die de juiste markeringen tot expressie brengen en 24 tot 48 uur op controle- of RNAI-platen worden bewaard.

Pak vier tot zes volwassen graven en breng ze over naar 20 tot 30 microliter M negen-buffer in een depressieschuif. Gebruik een steriele scalpel om de wormen aan beide kanten van de spermatheca of vulva te snijden om de embryo's te laten loskomen. Verzamel vervolgens de embryo's met behulp van een getrokken capillair, die aan een pipetbalg is bevestigd en breed genoeg is om de embryo's door te laten. Breng de embryo's over naar een vers bereide aros-pad met behulp van een wimper die op een tandenstoker is gelijmd.

Maak groepen van vijf tot 10 embryo's door de embryo's naast elkaar te duwen. Bedek de plaat met een dekglas en voeg indien nodig meer M negen-buffer toe, sluit vervolgens het dekglas af met voorverwarmde vloeibare valla. Gebruik een epi-fluorescente breedveldmicroscoop met geautomatiseerde filters.

Objectieven, een hoge resolutie CCD-camera en een sterk gemotoriseerde stage. Alles wordt bestuurd met software. Hoewel dit systeem geen LED's gebruikt en een EMCCD zal de fototoxiciteit voor het embryo bij lage vergroting beperken.

Focus handmatig op de embryo's om neuroblast te beeldvormen. Vergroot de vergroting en kies embryo's die een dorsale inter collatie of een vroege ventrale sluiting ondergaan op de breedveldmicroscoop. Kies de GFP- en Texas red-filters en bepaal de optimale Z-vlakken op het breedveldsysteem.

Door minder Zacks en minder tijdstippen te gebruiken, wordt fototoxiciteit verminderd, ook door de diafragma te sluiten tot 30% en indien mogelijk de lichtintensiteit te verlagen, wat de fototoxiciteit verder vermindert. Gebruik alternatief een live scan swept field of spinning disc confocale microscoop met software die de scanlaserobjectieven bestuurt, EMCCD-camera en een sterk gemotoriseerde stage. Nu de aankoopinstellingen zijn geoptimaliseerd, beeld de embryo's af op de breedveldmicroscoop.

Het wordt aanbevolen om eerst controle-embryo's te filmen voordat RNAI-Embryo's worden gemaakt. Met het swept field-systeem. Stel de 4 88 en 5 61 100 milliwatt-lasers in op 40% vermogen met een spleet van 50 en een belichtingstijd van 300 milliseconden.

Het is belangrijk op te merken dat deze instellingen voor andere microscopen anders zullen zijn. Plaats de plaat op de microscoopstandaard en gebruik vervolgens een objectief met lage vergroting om de embryo's te vinden. Schakel vervolgens over naar het 60 of 100 x olië-immersieobjectief.

Eenmaal scherpgesteld, verzamel 20 Z-stacks met een stap van 0,2 micron om de twee minuten gedurende een totaal van 10 minuten. De belichtingstijd zal waarschijnlijk moeten worden aangepast. Fototoxiciteit moet worden overwogen bij het live beeldvormen van embryo's via fluorescentiemicroscopie door het diafragma te sluiten, minder Zacks of tijdstippen te kiezen.

Door de belichtingstijd te verminderen, kan fototoxiciteit worden beperkt, indien mogelijk. Het gebruik van een SW-veld of een spinning disc confocale microscoop kan dit probleem helpen verbeteren. Bepaal uw tijd, punten en Z-vlakken van belang met behulp van de aankoopsoftware.

Exporteer gewenste beelden als meerdere tiffs. Open de gewenste Z-vlakken voor elk tijdstip en kanaal van belang in verwerkingssoftware zoals Image J en maak een stack. Stapel de Z-vlakken voor elk tijdstip en maak Z-stack projecties.

Herhaal dit voor aanvullende kanalen. Zodra alle Zack-projecties voor de gewenste tijdstippen zijn voltooid, opent u de projecties om een tijdsequentie te maken. Doe dit voor elk kanaal afzonderlijk.

Pas voor elk kanaal de helderheid en het contrast aan zoals nodig is. Draai de afbeeldingen indien nodig. Selecteer vervolgens een gebied van belang en knip de afbeeldingen bij.

Maak nu een samengevoegde afbeelding met behulp van de samengevoegde kanalenfunctie. Selecteer een andere kleur voor elk kanaal. Sla de samengevoegde afbeelding op als een RGB-bestand om de afbeeldingen duidelijker te visualiseren.

Gebruik de 16-bits TIFF-afbeeldingen en selecteer de inversiefunctie onder bewerken om grijstintenafbeeldingen voor elk kanaal te maken. Om de grootte van een object van belang in microns te bepalen, tekent u een lijn en vermenigvuldigt u de lengte ervan met de grootte van de pixels, die wordt bepaald door de beeldvormingsparameters. Maak nu een schaalbalk die een fractie van de berekende lengte in microns vertegenwoordigt.

Bewaar uiteindelijk de uiteindelijke afbeeldingen als acht bits tiffs. Indien gewenst, converteer de tiffs naar films met behulp van image J epidermale. Morfogeneze van C elegans vindt plaats door een combinatie van veranderingen in de vorm van epidermale cellen, migratie en hechting met hulp van onderliggende proliferatieve neuroblasten.

Epidermale cellen mi