Het beoordelen van de ontwikkeling van de Muriene plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer's Patches Met behulp adoptieve overdracht van hematopoëtische voorlopers

Het algemene doel van de volgende procedure is om de capaciteit van gezuiverde hematopoëtische progenitoren te onderzoeken om bij adoptieve overdracht plasmacytoïde dendritische cellen in intestinale pire patches te vormen. Dit wordt bereikt door eerst hydrodynamische genoverdracht van het plasmide uit te voeren, dat codeert voor het dendritische celgroeifactor. FLIT drie ligand in PI's patch plasmacytoïde dendritische cel geïmpairde muizen.

In de tweede stap worden gemeenschappelijke dendritische progenitorcellen geïsoleerd uit wild type beenmerg door magnetische kraalscheiding en flow sorting. In de laatste stap worden de progenitorcellen adoptief overgedragen door intraveneuze injectie in pyres patch plasmacytoïde dendritische cel geïmpairde muizen die werden behandeld door hydrodynamische genoverdracht. Uiteindelijk kan de door donor hematopoëtische progenitorcellen afgeleide PI's patch plasmacytoïde dendritische celpopulatie worden geëvalueerd door flowcytometrie.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie, zoals wat de ontwikkelingsoorsprong is van de plasma Cy Dendri-cellen die zich binnen de pirate patches lokaliseren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de oorsprong van pyres patch plasmacytoïde dendritische cellen. Het kan ook worden toegepast om te begrijpen hoe plasmacytoïde dendritische cellen de lymfocytenpopulaties binnen deze weefsels beïnvloeden.

Twee dagen voor adoptieve overdracht worden de bloedvaten van vijf CD 45 2 positieve interferon alfa receptor knockout ontvangermuizen gedilateerd onder een verwarmingslamp gedurende vijf tot 10 minuten. Plaats vervolgens voor elke muis het dier in een begrenzer en desinfecteer de staart met 70% ethanol. Gebruik vervolgens een naald van 27 gauge om vijf microgram plasma en coating flit drie liganden en twee milliliter steriele PBS in de staarvene van elk dier te injecteren.

Voor de controle cohort injecteert u vijf microgram van een lege vector. Monitor de muizen gedurende 15 tot 30 minuten en breng ze daarna terug naar hun huisvestingsfaciliteit. Op de dag van het experiment plaatst u het gedissecteerde dijbeen en scheenbeen van 10 congene CD 45 1 positieve C 57 zwarte zes muizen in een kweekschaal met compleet medium.

Breng vervolgens een naald van 27 gauge in één uiteinde van elk bot en gebruik compleet medium om het beenmerg drie keer per bot in de schaal te spoelen. Zorg ervoor dat het beenmerg wordt verwijderd door te bevestigen dat het uitgedreven medium troebel lijkt. Maak een enkele celsuspensie door het medium drie tot vijf keer voorzichtig op en neer te pipetten in de kweekschaal.

Verwijder vervolgens het puin door de beenmergcellen door een celzeven van 40 micrometer te halen en breek eventuele celklompjes door voorzichtig het uiteinde van een steriele spuitkolf toe te passen. Spuit de cellen op de zeven naar beneden, verwijder de supernatanten en lyseer de rode bloedcellen in twee milliliter lysisbuffer per vier tot zes keer 10 tot de zevende cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 10 milliliter fax buffer toe aan de beenmergcellen en centrifugeer gedurende vier minuten bij 500 keer G bij kamertemperatuur.

Na voorzichtig aspireren van de sup natin, was de pellet in 10 milliliter fax buffer. Kleur vervolgens de cellen met hematopoëtische lijnage marker herkenningsantilichamen volgend antilichaamkleuring en wassen. Incubeer de cellen met goat anti rat magnetische microkralen.

Tijdens de microkraal incubatie, laadt u een max LD kolom op een MIDI max celscheider en spoelt u de kolom vooraf met twee milliliter fax buffer. Plaats vervolgens een 15 milliliter conische buis onder de kolom en laad tot vijf keer 10 tot de achtste cellen in 2,5 milliliter fax buffer op de kolom. Was de kolom drie keer met twee milliliter fax buffer per wassing en verzamel de lijnage negatieve cellen die door de kolom gaan in de 15 milliliter buis.

Tel de geëludeerde cellen. Breng vervolgens na het kleuren van de cellen met de juiste fluorescent geconjugeerde antilichamen het monster over naar een faxbuis voor het sorteren van gemeenschappelijke dendritische progenitoren op basis van het gewenste markerprofiel. Verzamel de gezuiverde faxcellen in een 15 milliliter buis met vijf milliliter compleet medium en noteer aan het einde van de faxrun het absolute aantal gesorteerd cellen.

Na het centrifugeren, verdunt u de gezuiverde gemeenschappelijke dendritische progenitoren één keer 10 tot de vijfde per 100 microliter totaal volume steriele PBS per muis en aspireert u de celsuspensies in één spuit uitgerust met naalden van 27 gauge. Injecteer vervolgens de CD 45 1 positieve progenitorcellen in de staarvene van elke ontvanger CD 45 2 positieve interferon alfa receptor knockout muis zoals net gedemonstreerd zeven tot 10 dagen na de adoptieve overdracht. Verwijder de darmen van de gemeenschappelijke dendritische cel progenitor geïnjecteerde muizen en plaats de weefsels op PBS gedrenkte papieren handdoeken.

Gebruik vervolgens een paar fijne forceps en schaar om alle zichtbare pyres patches langs de wand van de dunne darm te verzamelen. Merk op dat de pyres patches vaak structureel verschillend zijn, zelfs binnen een enkele muis, dus zorg ervoor dat alle P'S patches worden geïdentificeerd en gedisseceerd. Was de geïsoleerde P'S patches drie keer in een petrischaal met PBS en gebruik forceps om het feces te verwijderen.

Digest vervolgens de P'S patches met één milligram per milliliter collagenase vier in 10 milliliter HBSS in een 50 milliliter kolf met krachtig roeren bij 37 graden Celsius. Giet na een uur de gedigesteerde PIs patches in een 40 micrometer celzeven en gebruik een steriele spuitkolf om de cellen in een 15 milliliter conische buis te forceren. Na het centrifugeren van de gefilterde celsuspensie, suspendeer de pellet in zes milliliter 37%per call oplossing en breng het over naar een 15 milliliter buis.

Plaats vervolgens voorzichtig zes milliliter 70%per call oplossing eronder om een per call stapgradient te vormen. Scheid nu de cellen gedurende 20 minuten bij 800 keer G bij kamertemperatuur met de break off. Verzamel vervolgens de mononucleaire celpopulatie op het grensvlak.

Na het pelleten van de verzamelde cellen,