Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie
30 januari 2014
Time-lapse confocale beeldvorming is een techniek nuttig voor het karakteriseren van embryonale ontwikkeling. Hier beschrijven we de methode karakteriseren craniofaciale morfogenese in wildtype en PDGFRA, Smad5 en SMO mutant embryo's.
Het algemene doel van deze procedure is om faryngeale boogbewegingen in de zich ontwikkelende kop van de zebravis te observeren en te karakteriseren. Dit wordt bereikt door eerst een transgenisch zebravis embryo in anesthetisch acrost gel in te sluiten. De tweede stap is om het in agarose ingebedde embryo in een druppel methylcellulose op een microscoopglaasje te monteren.
Vervolgens wordt het embryo tussen twee microscoopglaasjes met vacuümvet verzegeld. Uiteindelijk wordt time-lapse confocale microscopie gebruikt om verschillen tussen wild type en mutante zebravissen en de morfogenetische bewegingen van de faryngeale bogen te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven statische beeldvormingsmethoden is dat het de ontwikkeling van de faryngeale bogen in realtime vastlegt, waardoor een onderzoeker de weefselbewegingen die cruciaal zijn voor morfogenese direct kan observeren.
Om een overbrugd dekglas te maken, lijmt u een 22 bij 22 dekglas met superlijm op elke kant van een 24 bij 60 dekglas. Laat het midden vrij. Maak singles voor embryo's jonger dan een dag. Dubbels voor embryo's van één tot vier dagen oud of triples voor embryo's van vijf dagen of ouder. En voor elk specimen gebruikt u twee overbrugde dekglazen. Vul nu een 10 milliliter spuit met hoogvacuümvet.
Bereid vers anestheticum voor in 0,2% vloeibare aros en houd het op een verwarmingsblok van 42 graden Celsius. Om de onuitgekomen transgene embryo's handmatig te coaten, scheurt u de Corian langzaam open totdat het embryo is bevrijd. Breng nu de gecoate embryo's over in schoon medium met MS 2 22 en anestheticum.
Om een overbrugd dekglas voor te bereiden, drukt u het vacuümvet langzaam uit de spuit, waardoor een gladde continue draad wordt gemaakt die naast en binnen de bruggen en de rand van het dekglas ligt. Verspreid een cirkel van 4% Methylcellulose in het midden van de brug naar het dekglas. Wanneer het embryo verdoofd is, trekt u het op in een glazen pipet.
Houd de pipet verticaal omhoog zodat het embryo naar de bodem van de vloeistof in de pipet zinkt. Beweeg vervolgens de pipet naar de agro-oplossing en laat het embryo in de aros vallen zonder de vloeistof te verdrijven. Trek wat agro-oplossing en het embryo in de pipet.
Vervolgens drukt u het embryo in een druppel aro-oplossing. Op de methylcellulose. Duw het embryo naar beneden op de methylcellulose en oriënteer het embryo zoals gewenst voor beeldvorming om het specimen af te sluiten.
Plaats een overbrugd dekglas bovenop het gemonteerde dekglas met de binnenkant naar beneden. Oefen gelijkmatige druk uit op beide kanten van de gesandwichde dekglazen totdat de bruggen direct contact maken en de agros druppel beide dekglazen afsluit. Controleer of het embryo correct is gepositioneerd.
Wrijf met een houten applicator over het glas om scheuren en openingen in het vacuümvet glad te strijken. Veeg eventueel overtollig vet van de randen weg. Activeer de confocale microscoop en eventuele externe laserapparaten.
Schakel ook de computer in die op de confocale microscoop is aangesloten en selecteer start systeem en de confocale beeldvormingssoftware. Verlaag vervolgens het stageplatform van de confocale microscoop en verplaats de objectieven uit positie. Vervang het standaardplatform door een elektronisch verwarmd platform.
Schakel de controller voor het verwarmde platform in en stel de temperatuur in op 29,5 graden Celsius. Plaats het gemonteerde specimen op het verwarmde platform. Beweeg het 20 x objectief in positie en verhoog het stageplatform.
Activeer vervolgens de zichtbare lichtemitter en centreer het hoofd van het embryo in het gezichtsveld. Selecteer de fluorescente golflengte die moet worden gedetecteerd en kies kleurlookuptabellen voor elke kanaal. Stel voor elk fluorescentiekanaal de laserintensiteit in op 10,0 en de fotovermenigerspanning tussen 600 en 700.
Om de achtergrond te verminderen en de verzamelde fluorescentie-informatie te verhogen, stelt u de gemiddelde in op twee of vier en de bitdiepte op 16 bit. Activeer de ZS-stack en tijdreeksmodules. Pas indien nodig de snijbaan aan.
Stel het tijdsinterval en de lengte van het experiment in. Zet de camera op livemodus. Pas indien nodig de focus aan en verhoog de laserintensiteit.
Om fluorescentie te zien. Stel de digitale zoom in op 0,6 voor een breder zicht. Indien gewenst.
Positioneer het platform zodat alle structuren van belang zichtbaar zijn en er ruimte in het gezichtsveld is voor groei. Focus dorsoaal en anteriaal door het embryo naar de bovenste en onderste grenzen van fluorescentie. Stel de eerste en laatste Zack-snede posities minimaal 100 micrometer of meer voorbij deze grenzen in.
Stel vervolgens de displaylookuptabel in op bereikindicatoren zodat de fluorescente structuren een schaduw van grijs verschijnen en de rest van het veld blauw of zwart zou moeten zijn. Verhoog indien nodig de fotovermenigerspanning tot een niveau net onder waar verzadigde rode pixels verschijnen. Als fluorescente structuren rood verschijnen, verlaag de laserintensiteit en/of de versterking totdat ze een schaduw van grijs worden.
Stel indien nodig de offset in. Zodat gebieden buiten het monster blauw zijn. Stel de voor de kleinste diameter in die toelaat dat beelden tijdig worden verzameld.
De Z-interval moet altijd worden ingesteld op de aanbevolen optimale afstand voor de diameter van de snijbaan, voer korte scans uit om de instellingen te testen, gebruik altijd de laagste mogelijke laserintensiteit. Voer nu het experiment uit gedurende de gewenste tijdsduur. Verwijder daarna het embryo van het verwarmde platform en scheid langzaam de dekglazen, dompel het dekglas en embryo onder in een 30 millimeter Petrischaal.
Gebruik een glazen pipet om het embryo voorzichtig van het dekglas te wassen en verwijder het dekglas uit de Petrischaal. Plaats het embryo in een 28,5 graden Celsius incubator om zich verder te ontwikkelen. Aan het einde van de experimenten neemt u individuele Zack-beelden van agros gemonteerde broer- en zus embryo's die op het begin van de experimenten op dezelfde manier waren geplaatst als het specimen, maar
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methodologie voor time-lapse confocale beeldvorming om de craniofaciale morfogenese in zebravissenembryo's te karakteriseren. De techniek maakt real-time observatie van de bewegingen van de kieuwbogen mogelijk, wat inzicht biedt in de verschillen tussen wild-type en mutante embryo's.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Time-lapse confocale beeldvorming is een krachtig instrument in de ontwikkelingsbiologie.
- Inzicht in craniofaciale morfogenese is cruciaal voor het begrijpen van ontwikkelingsstoornissen.
- Zebravisjes dienen als een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van de embryonale ontwikkeling.
- Mutante stammen kunnen de genetische basis van morfologische veranderingen onthullen.
Doel van de studie
- Het observeren en karakteriseren van bewegingen van de kieuwbogen bij zebravissen.
- Het vergelijken van morfogenetische bewegingen tussen wild-type en gemuteerde embryo's.
- Het verbeteren van het inzicht in de craniofaciale ontwikkeling.
Gebruikte methoden
- Inbedden van transgene zebrafish-embryo's in anesthetisch acrost-gel.
- Monteren van embryo's in methylcellulose op microscoopglaasjes.
- Afdichten van embryo's tussen microscoopglaasjes met vacuümvet.
- Gebruik van time-lapse confocale microscopie voor real-time beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Real-time imaging legt kritieke weefselbewegingen tijdens de ontwikkeling vast.
- Verschillen in de ontwikkeling van de faryngeale bogen worden waargenomen tussen wild-type en mutante embryo's.
- De techniek biedt inzicht in de dynamiek van de craniofaciale morfogenese.
- Time-lapse imaging is superieur aan statische methoden voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen.
Conclusies
- Time-lapse confocale beeldvorming is effectief voor het bestuderen van embryonale ontwikkeling.
- De methodologie kan worden toegepast op verschillende genetische achtergronden bij zebravis.
- De verkregen inzichten kunnen onderzoek naar ontwikkelingsstoornissen informeren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Time-lapse confocale beeldvorming maakt directe observatie van dynamische weefselbewegingen in levende embryo's mogelijk, wat cruciale inzichten biedt in de morfogenetische processen die ten grond liggen aan de craniofaciale ontwikkeling. Deze aanpak ondersteunt de validatie van targets door genetische perturbaties te koppelen aan fenotypische uitkomsten in een ziekterelateerd systeem, waardoor het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase wordt vergroot. De methodologie faciliteert mechanische risicoreductie door real-time vergelijking van wildtype- en mutant-fenotypen mogelijk te maken, wat bijdraagt aan go/no-go beslissingen bij de preklinische beoordeling van targets.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt de toetsing van therapeutische hypothesen mogelijk door te visualiseren hoe genetische mutaties de morfogenese van de kieuwbogen bij zebravissen verstoren.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar platform voor functionele targetvalidatie via longitudinale beeldvorming van weefselgedrag in de craniale neurale kam.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door diverse weefselgedragingen te detecteren die craniofaciale afwijkingen veroorzaken, waarbij genotype aan fenotype wordt gekoppeld.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele voor de verlenging van de kieuwboggen en beweging langs de anterieur-posterieure en dorsaal-ventrale assen.
- Operationele waarde: Maakt standaardisatie van de assay mogelijk door consistente montage van embryo's, anesthesie en beeldvormingsparameters over verschillende experimentele condities heen.
- Schaalbaarheid: Compatibel met het toenemende aantal transgene zebravislijnen, wat high-content screening van mutante en ge-microinjecteerde embryo's ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt gebruik van een ziekterelevant systeem om craniofaciale morfogenese te modelleren, waarbij observaties in smoothened- en SMAD5-mutanten de mechanismen van menselijke ontwikkelingsstoornissen weerspiegelen.
- Preklinisch model: Zebravis-embryo's dienen als een predictief systeem voor het beoordelen van morfogenetische verstoringen voorafgaand aan studies bij zoogdieren.
- Risicogebaseerde voortgang: Time-lapse-imaging maakt de detectie van vroege fenotypische defecten mogelijk, zoals het uitblijven van de rostrale migratie van de zevende kieuwbog bij 48 hpf, wat bijdraagt aan risicobeperking in een vroeg stadium.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot preklinische beoordeling, waardoor real-time analyse van de morfogenetische gevolgen van genetische manipulaties mogelijk is.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten door directe observatie van weefselbewegingen die cruciaal zijn voor morfogenese in wild-type embryo's en mutant embryo's.
- Screening: Biedt assay-gereedheid en kwantitatieve resultaten via time-lapse opname van de dynamiek van de faryngeale bogen in ontwikkelende zebraviskoppen.
- Analyses: Maakt meting van de verlenging en beweging van de faryngeale boog mogelijk met behulp van confocale software, wat statistische resultaten oplevert voor het vergelijken van condities.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit via de analyse van mutante fenotypes die menselijke craniofaciale afwijkingen spiegelen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar imaging-platform dat toepasbaar is op diverse genetische achtergronden en veelgebruikte zebravis-technieken zoals morpholino-injectie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in de craniofaciale ontwikkeling te verminderen via directe in vivo observatie.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde parameters voor embryo-preparatie, montage en beeldvorming.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go beslissingen door vroege detectie van morfogenetische verstoringen mogelijk te maken, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering door genetische perturbaties te koppelen aan kwantificeerbare fenotypische uitkomsten in een schaalbaar model.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in zebravis-embryologie, de omgang met transgene organismen en het bedienen van confocale microscopie.
- Afhankelijk van instrumentatie, waaronder een confocale microscoop met mogelijkheden voor Z-stacks en tijdreeksen, een verwarmde tafel en lasersystemen.
- Vereist standaardisatie tussen teams van anesthesieprotocollen, montagemedia (agarose, methylcellulose) en afdichtingstechnieken (vacuümvet, overbrugde dekglasplaatjes).
- Omvat overwegingen voor adaptatie over verschillende modelsystemen, in het bijzonder bij het aanpassen van de embryo-leeftijdsspecifieke montage (enkele/dubbele/driedubbele overbrugde plaatjes) en beeldgevingsparameters voor het ontwikkelingsstadium.
- Bevat praktische beperkingen, zoals potentiële ontwikkelingsvertragingen door anesthesie en montage, hoewel deze in de bron als minimaal worden beschreven.
