Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie
January 30th, 2014
Time-lapse confocale beeldvorming is een techniek nuttig voor het karakteriseren van embryonale ontwikkeling. Hier beschrijven we de methode karakteriseren craniofaciale morfogenese in wildtype en PDGFRA, Smad5 en SMO mutant embryo's.
Het algemene doel van deze procedure is om faryngeale boogbewegingen in de zich ontwikkelende kop van de zebravis te observeren en te karakteriseren. Dit wordt bereikt door eerst een transgenisch zebravis embryo in anesthetisch acrost gel in te sluiten. De tweede stap is om het in agarose ingebedde embryo in een druppel methylcellulose op een microscoopglaasje te monteren.
Vervolgens wordt het embryo tussen twee microscoopglaasjes met vacuümvet verzegeld. Uiteindelijk wordt time-lapse confocale microscopie gebruikt om verschillen tussen wild type en mutante zebravissen en de morfogenetische bewegingen van de faryngeale bogen te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven statische beeldvormingsmethoden is dat het de ontwikkeling van de faryngeale bogen in realtime vastlegt, waardoor een onderzoeker de weefselbewegingen die cruciaal zijn voor morfogenese direct kan observeren.
Om een overbrugd dekglas te maken, lijmt u een 22 bij 22 dekglas met superlijm op elke kant van een 24 bij 60 dekglas. Laat het midden vrij. Maak singles voor embryo's jonger dan een dag. Dubbels voor embryo's van één tot vier dagen oud of triples voor embryo's van vijf dagen of ouder. En voor elk specimen gebruikt u twee overbrugde dekglazen. Vul nu een 10 milliliter spuit met hoogvacuümvet.
Bereid vers anestheticum voor in 0,2% vloeibare aros en houd het op een verwarmingsblok van 42 graden Celsius. Om de onuitgekomen transgene embryo's handmatig te coaten, scheurt u de Corian langzaam open totdat het embryo is bevrijd. Breng nu de gecoate embryo's over in schoon medium met MS 2 22 en anestheticum.
Om een overbrugd dekglas voor te bereiden, drukt u het vacuümvet langzaam uit de spuit, waardoor een gladde continue draad wordt gemaakt die naast en binnen de bruggen en de rand van het dekglas ligt. Verspreid een cirkel van 4% Methylcellulose in het midden van de brug naar het dekglas. Wanneer het embryo verdoofd is, trekt u het op in een glazen pipet.
Houd de pipet verticaal omhoog zodat het embryo naar de bodem van de vloeistof in de pipet zinkt. Beweeg vervolgens de pipet naar de agro-oplossing en laat het embryo in de aros vallen zonder de vloeistof te verdrijven. Trek wat agro-oplossing en het embryo in de pipet.
Vervolgens drukt u het embryo in een druppel aro-oplossing. Op de methylcellulose. Duw het embryo naar beneden op de methylcellulose en oriënteer het embryo zoals gewenst voor beeldvorming om het specimen af te sluiten.
Plaats een overbrugd dekglas bovenop het gemonteerde dekglas met de binnenkant naar beneden. Oefen gelijkmatige druk uit op beide kanten van de gesandwichde dekglazen totdat de bruggen direct contact maken en de agros druppel beide dekglazen afsluit. Controleer of het embryo correct is gepositioneerd.
Wrijf met een houten applicator over het glas om scheuren en openingen in het vacuümvet glad te strijken. Veeg eventueel overtollig vet van de randen weg. Activeer de confocale microscoop en eventuele externe laserapparaten.
Schakel ook de computer in die op de confocale microscoop is aangesloten en selecteer start systeem en de confocale beeldvormingssoftware. Verlaag vervolgens het stageplatform van de confocale microscoop en verplaats de objectieven uit positie. Vervang het standaardplatform door een elektronisch verwarmd platform.
Schakel de controller voor het verwarmde platform in en stel de temperatuur in op 29,5 graden Celsius. Plaats het gemonteerde specimen op het verwarmde platform. Beweeg het 20 x objectief in positie en verhoog het stageplatform.
Activeer vervolgens de zichtbare lichtemitter en centreer het hoofd van het embryo in het gezichtsveld. Selecteer de fluorescente golflengte die moet worden gedetecteerd en kies kleurlookuptabellen voor elke kanaal. Stel voor elk fluorescentiekanaal de laserintensiteit in op 10,0 en de fotovermenigerspanning tussen 600 en 700.
Om de achtergrond te verminderen en de verzamelde fluorescentie-informatie te verhogen, stelt u de gemiddelde in op twee of vier en de bitdiepte op 16 bit. Activeer de ZS-stack en tijdreeksmodules. Pas indien nodig de snijbaan aan.
Stel het tijdsinterval en de lengte van het experiment in. Zet de camera op livemodus. Pas indien nodig de focus aan en verhoog de laserintensiteit.
Om fluorescentie te zien. Stel de digitale zoom in op 0,6 voor een breder zicht. Indien gewenst.
Positioneer het platform zodat alle structuren van belang zichtbaar zijn en er ruimte in het gezichtsveld is voor groei. Focus dorsoaal en anteriaal door het embryo naar de bovenste en onderste grenzen van fluorescentie. Stel de eerste en laatste Zack-snede posities minimaal 100 micrometer of meer voorbij deze grenzen in.
Stel vervolgens de displaylookuptabel in op bereikindicatoren zodat de fluorescente structuren een schaduw van grijs verschijnen en de rest van het veld blauw of zwart zou moeten zijn. Verhoog indien nodig de fotovermenigerspanning tot een niveau net onder waar verzadigde rode pixels verschijnen. Als fluorescente structuren rood verschijnen, verlaag de laserintensiteit en/of de versterking totdat ze een schaduw van grijs worden.
Stel indien nodig de offset in. Zodat gebieden buiten het monster blauw zijn. Stel de voor de kleinste diameter in die toelaat dat beelden tijdig worden verzameld.
De Z-interval moet altijd worden ingesteld op de aanbevolen optimale afstand voor de diameter van de snijbaan, voer korte scans uit om de instellingen te testen, gebruik altijd de laagste mogelijke laserintensiteit. Voer nu het experiment uit gedurende de gewenste tijdsduur. Verwijder daarna het embryo van het verwarmde platform en scheid langzaam de dekglazen, dompel het dekglas en embryo onder in een 30 millimeter Petrischaal.
Gebruik een glazen pipet om het embryo voorzichtig van het dekglas te wassen en verwijder het dekglas uit de Petrischaal. Plaats het embryo in een 28,5 graden Celsius incubator om zich verder te ontwikkelen. Aan het einde van de experimenten neemt u individuele Zack-beelden van agros gemonteerde broer- en zus embryo's die op het begin van de experimenten op dezelfde manier waren geplaatst als het specimen, maar
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methodologie voor time-lapse confocale beeldvorming om craniofaciale morfogenese in zebravis-embryo's te karakteriseren. De techniek maakt real-time observatie van faryngeale boogbewegingen mogelijk, wat inzichten biedt in de verschillen tussen wild-type en mutante embryo's.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Time-lapse confocale beeldvorming is een krachtig hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie.
- Begrip van craniofaciale morfogenese is cruciaal voor inzichten in ontwikkelingsstoornissen.
- Zebravissen dienen als een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van embryonale ontwikkeling.
- Mutanten kunnen de genetische basis van morfologische veranderingen onthullen.
Doel van het onderzoek
- Om faryngeale boogbewegingen in zebravissen te observeren en karakteriseren.
- Om morfogenetische bewegingen te vergelijken tussen wild-type en mutante embryo's.
- Om het begrip van craniofaciale ontwikkeling te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Inbedden van transgene zebravis-embryo's in anesthetische acrost-gel.
- Bevestigen van embryo's in methylcellulose op microscoopglaasjes.
- Afdichting van embryo's tussen microscoopglaasjes met vacuümvet.
- Gebruik van time-lapse confocale microscopie voor real-time beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Real-time beeldvorming legt kritische weefselbewegingen vast tijdens de ontwikkeling.
- Er worden verschillen in faryngeale boogontwikkeling waargenomen tussen wild-type en mutante embryo's.
- De techniek biedt inzichten in de dynamiek van craniofaciale morfogenese.
- Time-lapse beeldvorming is superieur aan statische methoden voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen.
Conclusies
- Time-lapse confocale beeldvorming is effectief voor het bestuderen van embryonale ontwikkeling.
- De methodologie kan worden toegepast op verschillende genetische achtergronden in zebravissen.
- De verkregen inzichten kunnen onderzoek naar ontwikkelingsstoornissen informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Time-lapse confocal imaging enables direct observation of dynamic tissue movements in living embryos, providing critical insights into morphogenetic processes that underlie craniofacial development. This approach supports target validation by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system, enhancing predictive confidence in early discovery. The methodology facilitates mechanistic de-risking by allowing real-time comparison of wild-type and mutant phenotypes, informing go/no-go decisions in preclinical target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing how genetic mutations disrupt pharyngeal arch morphogenesis in zebrafish.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for functional target validation through longitudinal imaging of tissue behaviors in cranial neural crest.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by detecting varied tissue behaviors that cause craniofacial abnormalities, linking genotype to phenotype.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements of pharyngeal arch elongation and movement along anterior-posterior and dorsal-ventral axes.
- Operational Value: Enables assay standardization through consistent embryo mounting, anesthesia, and imaging parameters across experimental conditions.
- Scalability: Compatible with increasing abundance of transgenic zebrafish lines, supporting high-content screening of mutant and microinjected embryos.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses a disease-relevant system to model craniofacial morphogenesis, with observations in smoothened and SMAD5 mutants reflecting human developmental disorder mechanisms.
- Preclinical Model: Zebrafish embryos serve as a predictive system for assessing morphogenetic disruptions prior to mammalian studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Time-lapse imaging allows detection of early phenotypic defects, such as failed rostral migration of the seventh pharyngeal arch at 48 hpf, informing early-stage de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, enabling real-time analysis of morphogenetic consequences of genetic manipulations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by directly observing tissue movements critical to morphogenesis in wild-type and mutant embryos.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via time-lapse capture of pharyngeal arch dynamics in developing zebrafish heads.
- Analytics: Enables measurement of pharyngeal arch elongation and movement using confocal software, providing statistical outputs for comparing conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through analysis of mutant phenotypes that mirror human craniofacial disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to various genetic backgrounds and commonly used zebrafish techniques like morpholino injection.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in craniofacial development through direct in vivo observation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined embryo preparation, mounting, and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of morphogenetic disruptions, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by linking genetic perturbations to quantifiable phenotypic outcomes in a scalable model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, transgenic handling, and confocal microscopy operation.
- Dependent on instrumentation including confocal microscope with Z-stack and time-series capabilities, heated stage, and laser systems.
- Necessitates cross-team standardization of anesthesia protocols, mounting media (agarose, methylcellulose), and sealing techniques (vacuum grease, bridged cover slips).
- Involves adaptation considerations across model systems, particularly in adjusting embryo age-specific mounting (single/double/triple bridged slips) and imaging parameters for developmental stage.
- Includes practical limitations such as potential developmental delays from anesthesia and mounting, though reported as minimal in the source.
