Name: Isolatie van Double Negative αβ T-cellen uit de nier (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Leer een protocol voor de isolatie van dubbelnegatieve T-cellen uit de nier van muizen met behulp van collageenase-vertering en magnetische celscheiding. Deze methode ondersteunt onderzoek naar immunologie en nierziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door NIH PBS (R21 AI095484). Wij danken NHI tetramer kern faciliteit voor CD1d tetrameer.

1. Voorbereiding van instrumenten, Cultuur Media en reagentia <ol><li> Instrumenten: Bereid de reagentia onder steriele omstandigheden en te gebruiken onder een laminaire stroming kap. </li><li> Bereid 1 liter RPMI weefselkweekmedium, voeg 5% foetaal runderserum, 2,1 g natriumbicarbonaat, 10 ml glutamaat 100x, 10 mg HEPES, 1 mg natriumpyruvaat en 10 ml 100x penicilline / streptomycine. Let op: de aanbevolen weefselcultuurmedium, RPMI, is uitwisselbaar met DMEM. </li><li> Bereid 5% collagenase &quot;D&quot;-oplossing (5 ml collagenase &quot;D&quot; naar 9 ml weefselkweekmedium). </li><li> Voeg Percoll oplossing bij drie verschillende concentraties: 100%, 80% en 40%. De volgende concentraties worden berekend voor 1 monster. Houd oplossingen bij kamertemperatuur. <ol><li> Percoll oplossing: voeg 9 ml onverdunde Percoll (uit voorraad-oplossing); voeg 1 ml PBS 10x. </li><li> Percoll oplossing: voeg 8 ml Percoll 100%; voeg 2 ml PBS 1x. </li><li> Percoll oplossing:voeg 4 ml Percoll 80%; voeg 4 ml PBS 1x. </li></ol></li><li> Voeg 1 L van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buffer; voeg 5 ml 10% BSA (0,1% BSA), 1 ml 10% natriumazide (0,1%), 2 ml EDTA-agent, vul aan tot 1000 ml met 1x PBS. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Nier Spijsvertering <ol><li> Na de nodige institutionele goedkeuring verworven, offeren en exsanguinate de muizen met standaard methoden en volgens de geldende voorschriften en verzorging van dieren richtlijnen. <ol><li> Verdoven de muis met pentobarbital (0.07 mg / kg). </li><li> Overgaan tot verbloeding. </li><li> Plaats de muis in liggende positie op een operatietafel. </li><li> Spuit de buikstreek met 70% ethanol. </li></ol></li><li> Voeg 10 ml collagenase D oplossing van de petrischaal. </li><li> Verwijder decapsulate beide nieren van elke muis. <ol><li> Open de abdomimal holte door een middellijn incisie door de buikhuid en het buikvlies van het borstbeen tothet schaambeen. </li><li> Expose de linker nier in door de darm zijdelings opzij. </li><li> Scheiden de linker capsule voorzichtig met de tang. Opmerking: De capsule wordt als transparante laag rond de nieren en gedeeltelijk onder perinephric vetweefsel. </li><li> Verwijder de linker nier door het snijden van de pedicle schepen met behulp van een chirurgische schaar. </li><li> Herhaal dezelfde procedure voor de rechter nier. Opmerking: De rechter nier is craniaal en dichter bij de middellijn (steeltjes korter). </li></ol></li><li> Plaats de nier in de petrischaal. </li><li> Snijd het nierweefsel in kleine stukjes (1-2 mm in afmeting) met bijvoorbeeld een metalen blad en plaats de stukken in de collagenase-oplossing gedurende 30-45 minuten in de incubator bij 37 ° C (figuur 1). </li></ol> 3. Voorbereiding van Kidney cellen (KMNC) van de Kidney Spijsvertering <ol><li> Verkrijgen van een celsuspensie van de nierdigestie door het mechanisch verstoren van het weefsel met een filter (70 pm) en resuspendeer in 25 ml weefselkweekmedium en meng. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C aan de celsuspensie pellet. </li><li> Resuspendeer de pellet in 4 ml 40% Percoll oplossing en voorzichtig overlay op 4 ml 80% Percoll oplossing met een transfer plastic pipet, heel langzaam en voorzichtig. Dit zal resulteren in twee fasen duidelijk gescheiden door een doorzichtige laag. Bovenop een gele laag overeenkomt met de lipiden. </li><li> Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met de centrifuge rem van stand. </li><li> Verwijderen door aspiratie de gele en dikke toplaag (ongeveer 1-2 ml). </li><li> Verzamel alleen de lichte witachtige doorzichtige laag van het grensvlak van de twee fasen met een transferpipet. Deze suspensie Heel voorzichtig over in een 15 ml conische buis met 2 ml weefselkweekmedium en voeg 13 ml medium tot een totaal volume maken15 ml. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de monsters in 1 ml medium. </li><li> Tel het aantal KMNC gebruik trypanblauwexclusie op een hemocytometer en het resultaat wordt uitgedrukt als aantallen KMNC per ml per nier. </li><li> Was eenmaal als hierboven. </li></ol> 4. Isolatie van hematopoietische (CD45 +) Cellen van KMNC (stap I) <ol><li> Resuspendeer de cellen tot 10 7 tot 90 gl loopbuffer. </li><li> Voeg 10 ul van CD45 microkorrels en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C. </li><li> Voeg 1 ml van de buffer om de reactie te stoppen. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer in 500 gl loopbuffer. </li><li> Bereid de magnetische kolom nadeel bij de magneet en spoel met 3 ml loopbuffer. </li><li> Leid de celsuspensie door de magnetische kolom en verzamel de ongelabelde cellen passeren de kolom. </li><li> Was de cellen drie keer met 3 ml running buffer. Verzamelen dan de uitstroom. </li><li> Verwijder de kolom uit de afscheider en pipet 5 ml van het runnen van buffer op de zuilen en het spoelen van de gelabelde fractie onmiddellijk. Deze fractie bevat de CD45 + cellen. Tel de cellen. </li><li> Om het absolute aantal verschillende T cel populaties te berekenen in nieren vermenigvuldig het totale aantal KMNC door het percentage positieve cellen bepaald door flowcytometrie (figuur 2). </li></ol> 5. Isolatie van DN T-cellen uit CD45 + Voorbereiding door negatieve selectie (stap II) <ol><li> Voeg 2,5 pl (0,5 mg / ml, 1,25 ug) van elk van de volgende gebiotinyleerde antilichamen: anti-CD4, anti-CD8, anti-Fc receptor (CD16/32), anti-MHC klasse II (IA b), anti- CD1d PBS-57 tetrameer voor elke 10 7 hematopoietische cellen. </li><li> Incubeer cellen gedurende 30 min in koude kamer. </li><li> Voeg 1 ml anti-biotine microbolletjes. </li><li> Incubeer gedurende 30 minuten in een koude kamer. </li><li> Plaats de buis in thij magneet en overgaan tot uitputting. </li><li> Tel de levensvatbare cellen aan het totale aantal DN T-cellen ontkennend wordt bepaald, met behulp van een hemocytometer. </li><li> Controleer zuiverheid van DN T-cellen met flowcytometrie door het volgen van deze gating strategie: eerste poort CD45 +, tweede poort TCRαβ +. Uitsluiten CD1d + cellen. Plot CD4 + CD8 + vs DN T-cellen (Figuur 3) te identificeren. </li><li> Vermenigvuldig het totale aantal door het percentage bepaald in reinheid. Opmerking: Het gebruik van dit protocol resulteert in een bevolking van meer dan 90% zuiver DN T-cellen. </li></ol>

<ol><li>Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+previously+unknown+antigen-specific+regulatory+T+cell+and+its+mechanism+of+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression.</a> Nat Med. 6, 782-789 (2000).</li>
<li>Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+regulatory+function+of+lymphoproliferative+double+negative+T+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo.</a> J Exp Med. 196, 261-267 (2002).</li>
<li>Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+in+vivo+trogocytosis+as+a+mechanism+of+double+negative+regulatory+T+cell-mediated+antigen-specific+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression.</a> J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).</li>
<li>Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-lymphocyte+infusion+induces+transplantation+tolerance+by+activating+systemic+and+graft-infiltrating+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells.</a> Blood. 100, 3408-3414 (2002).</li>
<li>Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+in+vitro-generated+DN+T+regulatory+cells+induces+permanent+cardiac+allograft+survival+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice.</a> Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).</li>
<li>Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+graft-versus-host+disease+by+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells.</a> J Immunol. 171, 134-141 (2003).</li>
<li>Mohamood, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gld+mutation+of+Fas+ligand+increases+the+frequency+and+up-regulates+cell+survival+genes+in+CD25%2BCD4%2B+TR+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells.</a> Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).</li>
<li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3%2BCD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).</li>
<li>Hamad, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%2B+double-negative+T+cells+suppress+polyclonal+T+cell+activation+by+a+Fas-independent+mechanism+that+involves+inhibition+of+IL-2+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production.</a> J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).</li>
<li>Rabb, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+role+of+T+lymphocytes+in+renal+ischemia-reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Renal%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).</li>
<li>Burne, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+CD4%28%2B%29+T+cell+as+a+major+pathogenic+factor+in+ischemic+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure.</a> J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).</li>
<li>Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+T+cell+depletion+in+murine+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation. 74, 759-763 (2002).</li>
<li>Crispin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+double+negative+T+cells+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+produce+IL-17+and+infiltrate+the+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys.</a> J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).</li>
<li>Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+analyses+on+T-cell+subsets+in+lymph+nodes+of+MRL%2FMp-lpr%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).</li>
<li>Dowdell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+FAS+mutations+are+common+in+patients+with+genetically+undefined+autoimmune+lymphoproliferative+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome.</a> Blood. 115, 5164-5169 (2010).</li>
<li>Juvet, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcRgamma+promotes+T+cell+apoptosis+in+Fas-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice.</a> J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).</li>
<li>Thomson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcR+gamma+presence+in+TCR+complex+of+double-negative+T+cells+is+critical+for+their+regulatory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function.</a> J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er is steeds meer belangstelling DN T-cellen omdat ze worden betrokken bij verschillende pathologische aandoeningen zoals auto-immuunziekten, kanker, ent tolerantie en primaire ziekten van de nier, waaronder acute nierschade (AKI), glomerulonefritis 8, 13. Daarom is er behoefte aan een beter inzicht karakteriseren pathofysiologische functies van DN T-cellen. Echter, momenteel is er een gebrek aan inzicht in functie van deze cellen ten opzichte van CD4 en CD8 T-cellen. Een belangrijke reden is gebrek van DN T-...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51192/isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney">Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney</a>.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle

A correction was made to: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney.

Erratum: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Perifere αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - dubbel-negatieve (DN) T-cellen zijn onderverdeeld in verschillende subgroepen die verschillende fenotypes en functies 1-4 bezitten. DN T-cellen worden slecht begrepen, maar in toenemende mate betrokken bij pathofysiologische immuunreacties in verschillende ziektemodellen 4-6. DN T-cellen een uniek immuun celtype die steeds betrokken bij de regulatie van verschillende immuun-en auto-immune reacties en de modulatie van allotransplant tolerantie. 4-6, 9 zijn zeldzaam in het perifere bloed en secundaire lymfoïde organen (milt en lymfeklieren ). Ze zijn echter belangrijke inwoners van de normale nier en darmepitheel 10-12. Er is zeer weinig bekend over de functie 7 van de nier bij de statische en onder pathologische omstandigheden zoals acute nierschade (AKI) geassocieerd met nier Transplmier. Vanwege de ingewikkelde rol van de verschillende immuuncellen in het reguleren van immuunreacties waaronder alloresponses, het definiëren van de rol van elke speler is van cruciaal belang in het begrijpen alloresponses en het ontwerpen van nieuwe therapieën. Gezien de grote aantallen DN T-cellen in de nieren onder fysiologische en andere ziektetoestanden, DN T-cellen waarschijnlijk een kritieke rol in het reguleren immuun-en auto-immuunreacties in muizen en mensen, en alloresponses spelen bij transplantatiepatiënten. Accumuleren hoewel nog steeds verspreid bewijs impliceert DN T-cellen in zowel pathogene en immunosuppressieve functies, maar het is slecht begrepen waarom en hoe ze vertonen een specifiek schadelijk of onderdrukkende functie en hoe de omgeving beïnvloedt hen. Door hun geringe hoeveelheden in de nier, verbeterde methoden van isolatie noodzakelijk. Er is geen standaard protocol voor isolatie van DN T-cellen van thij niet-lymfoïde weefsels. Het protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor het isoleren van DN T-cellen van de nier; Echter kan de werkwijze ook worden gebruikt voor verschillende niet-lymfoïde weefsel.

<table><tbody><tr><td>Laminar flow hood&nbsp;</td><td>Baker Company, Inc</td><td></td><td>Of gelijkwaardige apparatuur&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Of gelijkwaardige apparatuur&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Atmosfeer gecontroleerde incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&nbsp;(37 &deg;C met 5% CO2)</td></tr><tr><td>Analytische flow cytometer</td><td>LSR II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Media Tech</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum&nbsp;</td><td>Corning Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,1% natriumazid (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Buffer fosfaat gebufferde saline (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Mediatech</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>EDTA buffer&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1161</td><td></td></tr><tr><td>LS kolommen&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD45+ microbeads</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>6.78E-51</td><td></td></tr><tr><td>Biotine microbeads&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&nbsp; PerCP&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&nbsp; APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>anti-TCR Pacific Blue&nbsp; (ab-keten, clone: H57-597)</td><td>Invitrogen</td><td>HM3628</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0043</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 FITC</td><td>eBioscience</td><td>8011-0087</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 gebiotinyleerd (GK1.5)</td><td>BD</td><td>553728</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 gebiotinyleerd&nbsp; (clone 53-6.7)</td><td>BD</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>anti-MHC klasse II (I-A b) gebiotinyleerd</td><td>BD</td><td>553609</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Loopbuffer - MACS Separatie Buffer&nbsp;</td><td>MIlteny I Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J muizen</td><td>Jackson Labs</td><td>000664</td><td>Nieren - Lymfeklieren</td></tr><tr><td>Petrischaal&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>356517</td><td></td></tr><tr><td>70 &#956;m filter&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Zuiger&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Of gelijkwaardige apparatuur&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneMate Tubes 50 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-3</td><td>Of gelijkwaardige apparatuur&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneMate Tubes 15 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-1</td><td>Of gelijkwaardige apparatuur&nbsp;</td></tr><tr><td>CD1d &#945;-galcer tetrameer</td><td>NHI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van double negative αβ t-cellen uit de nier

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Er is geen standaard protocol voor de isolatie van DN T-cellen van de niet-lymfoïde weefsels ondanks hun betrokkenheid vaker gerapporteerd in verschillende immuunresponsen. DN T-cellen een uniek immuun celtype dat is betrokken bij regulering van immuun-en auto-immuunreacties en tolerantie voor allotransplants 1-6. DN T-cellen zijn echter zeldzaam in perifeer bloed en secundaire lymfoïde organen (milt en lymfeknopen), maar zijn belangrijke inwoners van de normale nier. Er is zeer weinig bekend over hun pathofysiologische functies 7 vanwege hun gebrek in de periferie. We hebben recent beschreven een uitgebreide fenotypische en functionele analyse van deze populatie in de nieren 8 in stationaire toestand als tijdens ischemie reperfusie schade. Analyse van DN T-cel functie zal aanzienlijk worden uitgebreid door het ontwikkelen van een protocol voor de isolatie van de nier. Hier beschrijven we een nieuw protocol dat toelaat Isolation van zeer zuivere ab CD4 + CD8 + T-cellen en DN T-cellen van de muis nieren. Kortom, wij verteren nierweefsel met collagenase en isoleren nier cellen (KMNC) door dichtheidsgradiënt. Dit wordt gevolgd door twee stappen hematopoietische T-cellen verrijken van 3% tot 70% van KMNC. De eerste stap bestaat uit een positieve selectie van hematopoïetische cellen met behulp van een CD45 + isolatie kit. In de tweede stap worden DN T-cellen negatief geïsoleerd door verwijdering van niet-gewenste cellen met CD4, CD8 en MHC klasse II monoklonale antilichamen en CD1d α-GalCer tetrameer. Deze strategie leidt tot een populatie van meer dan 90% zuiver DN T-cellen. Oppervlak kleuring met bovengenoemde antilichamen gevolgd door FACS-analyse wordt gebruikt om de zuiverheid te bevestigen.

Wild-type C57BL / 6 (B6) nier bevat ongeveer 1,5-2,1 x 10 6 mononucleaire cellen per nier. Ongeveer minder dan 10% zijn hematopoïetische CD45 + cellen. Voor de bereiding van nier cellen (KMNC), worden de nieren in kleine stukjes zoals getoond in figuur 1, gevolgd door digestie met 5% collagenase. Dit wordt gevolgd door het uitvoeren van een dichtheidsgradiënt centrifugatie KMNC laag (Figuur 2, linkerpaneel) verzamelen. KMNC werden vervo...

DNabT cellen zijn zeldzaam onder perifere T-cellen; maar ze zijn er in overvloed in bepaalde niet-lymfoïde weefsels. Moeilijkheid van het isoleren van DN T-cellen van niet-lymfeweefsel belemmert hun functionele analyse Ondanks toenemende erkend pathofysiologische betekenis. We beschrijven een nieuw protocol voor isolatie van hooggezuiverde DN T-cellen van muizen nier.

Isolatie van Double Negative αβ T-cellen uit de nier

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Het algemene doel van deze procedure is om te beschrijven hoe pure en dubbel negatieve T-cellen uit de muisnier kunnen worden geïsoleerd. Dit wordt bereikt door de nier eerst te verteren in een collagenase-oplossing. Vervolgens worden de mononucleaire cellen gescheiden via een dichtheidsgradiënt, waarna hematopoëtische CD 45-positieve cellen worden verzameld door middel van positieve selectie.Uiteindelijk kunnen de dubbel negatieve T-cellen vervolgens door middel van negatieve selectie worden geïsoleerd. In 1998 ontdekte ons team dat immuuncellen, in het bijzonder T-cellen, in tegenstelling tot het huidige dogma, acuut nierletsel veroorzaakten. Er waren zeer weinig van deze cellen in de nier en het hart om te bestuderen, dus hebben we een techniek ontwikkeld om deze beter te kunnen onderzoeken.Het verraste ons om een populatie cellen aan te treffen, de dubbel negatieve T-cel zonder CD4 of CD8, die in hoge aantallen aanwezig waren, zowel in de normale nier als tijdens letsel. De gedetailleerde en verbeterde techniek om deze beter te bestuderen en de mechanismen te onderzoeken, zal worden beschreven in deze komende video. Wij bestuderen dubbel negatieve T-cellen sinds 2001, en onlangs hebben we samengewerkt met het laboratorium van Dr. Rob om de regionale methode voor de isolatie van deze cellen aan te passen, om zo een zuivere populatie te verkrijgen die gebruikt kan worden voor verschillende biologische immuunresponsen.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de immuuncellen in de nier, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals niet-lymfatische weefsels. Voeg vóór aanvang van de operatie eerst 10 milliliters collagenase D toe aan een Petrischaal voor de weefselverzameling. Bespuit vervolgens het buikgebied van een geëuthanaseerde muis met 70% ethanol.Maak vervolgens een midline-incisie door de abdominale huid en het peritoneum vanaf het sternum tot aan het pubis, en verschuif daarna de darm lateraal naar de zijkant om de linker nier bloot te leggen. Identificeer het linker kapsel, dat zichtbaar is als een transparante laag rondom de nier en gedeeltelijk bedekt is door perinefrisch vetweefsel, en scheid dit voorzichtig met een pincet van de nier. Knip vervolgens het pedikelvat door met een chirurgische schaar om het weefsel te verwijderen en plaats de nier in de Petrischaal.Verwijder vervolgens de rechternier en gebruik een gewoon metalen vormmes om het nierweefsel in kleine stukjes van één tot twee millimeter te snijden. Verteer de stukjes in de collagenase-oplossing gedurende 30 tot 45 minuten bij 37 °C en disrupteer daarna het niersuspensaat mechanisch door een zeef van 70 micron om de mononucleaire cellen van de nier te isoleren. Resuspendeer de celsuspensie in 25 milliliters weefselkweekmedium.Centrifuge vervolgens de cellen na voorzichtig agiteren en resuspendeer het pellet in vier milliliters van een 40% Percoll-oplossing. Gebruik daarna een plastic transferpipet om de Percoll-celoplossing voorzichtig bovenop vier milliliters van een 80% Percoll-oplossing te plaatsen, zodat twee fasen ontstaan die duidelijk gescheiden zijn door een doorschijnende laag. Scheid de cellen gedurende 30 minuten bij 1500 Gs en kamertemperatuur met de rem uitgeschakeld, en aspireer vervolgens ongeveer één tot twee milliliters van de dikke, gele, lipiderijke bovenlaag.Gebruik een nieuwe transferpipet om de licht witachtige, doorschijnende laag van de interface van de twee fasen op te nemen in een conische buis van 15 milliliter die twee milliliter weefselkweekmedium bevat. Voeg vervolgens 13 milliliter medium toe om het totale volume op 15 milliliter te brengen. Verdun na het wassen en tellen de cellen tot 1 × 10⁷ in 90 µL running buffer.Incubeer de cellen vervolgens in 10 µL CD 45 microbeads bij 4 °C. Voeg na 15 minuten 1 mL running buffer toe om de reactie te stoppen. Centrifugeer vervolgens de cellen en resuspendeer ze.Resuspendeer de pellet in 500 microliters vers loopbuffer. Plaats vervolgens een kolom in een magneet voor kralenseparatie en spoel de kolom met drie milliliters loopbuffer. Laat daarna de celsuspensie door de magnetische kolom lopen en verzamel de ongelabelde cellen die door de kolom passeren.Was de buis met de cellen drie keer met drie milliliter running buffer, waarbij het effluent telkens wordt opgevangen, en verwijder vervolgens de kolom van de magneet. Pipetteer vijf milliliter running buffer op de kolom en spoel onmiddellijk de gemarkeerde fractie met de CD 45-positieve cellen uit. Incubeer de cellen vervolgens, na het tellen, in 2,5 microliter van elk van deze gebiotineerde antilichamen per 1 × 10⁷ hematopoëtische cellen bij vier graden Celsius.Incubeer de cellen na 30 minuten nog een half uur bij vier graden Celsius in één milliliter anti-biotine microbeads. Plaats een nieuwe kolom in de magneet en load de cellen vervolgens op de kolom zoals zojuist gedemonstreerd, waarbij deze keer de negatieve fractie wordt opgevangen. Tel tot slot de levensvatbare cellen om het totale aantal dubbel-negatieve T-cellen in de negatieve fractie te bepalen en vermenigvuldig dit getal met het zuiverheidspercentage zoals bepaald via flowcytometrische analyse.Hoewel nieren van C57BL/6-muizen ongeveer 1,5 tot 2,1 × 10⁶ mononucleaire cellen per nier bevatten, is minder dan 10% hiervan hematopoëtische CD45-positieve cellen. Na dichtheidsgradiëntcentrifugatie om de mononucleaire cellaag van de nier te verzamelen, kunnen de CD45-positieve cellen verder worden gezuiverd tot ongeveer 80 tot 95% door middel van magnetische bead-separatie van CD45-positieve cellen. Van de verrijkte hematopoëtische CD45-positieve cellen is ongeveer 30 tot 60% dubbel-negatieve T-cellen.Negatieve selectie van de CD 45-positieve cellen om de CD 4-positieve, CD 8-positieve, MHC-klasse II-positieve en tetrameer-positieve cellen te verwijderen, resulteert in hooggezuiverde dubbel-negatieve T-cellen met een zuiverheid van 90 tot 95%. Met dit protocol is het mogelijk om tot 0,5 × 10⁶ hematopoëtische CD 45-positieve magnetisch gelabelde cellen per muis te verkrijgen. Deze procedure zal zorgen voor een beter begrip van de biologische functies en mechanismen van dubbel-negatieve T-cellen in verschillende weefsels.

isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Isolatie van lymfocyten met behulp van de Miltenyi MAC-kit is een betrouwbare manier om cellen van hele lymfeweefsel homogenaten te zuiveren. Cellen gezuiverd met behulp van de Miltenyi systeem zijn meestal ≥ 96% zuiver. Hier tonen we de stappen die zijn genomen om CD4 + T-cellen, een van de vele kits worden aangeboden door Miltenyi isoleren.

Isolatie van CD4 + T-cellen van de muis lymfeknopen Met behulp van Miltenyi MACS Zuivering

The video explains a way to purify B-cells by immunomagnetic targeting and separation from peripheral blood mononuclear cells suspension. The method involve labeling unwanted cell types with specific antibodies or ligands (linked to magnetic particles) targeting specific cell surface proteins, to be depleted from the heterogenous cell suspension by magnetic separation.

Negative Immunomagnetic Selection: A Method to Purify B-cells from Peripheral Blood Mononuclear Cells

This video demonstrates a protocol for the magnetic labeling-based isolation of a low-concentration population of CD4+Vδ1+γδ T cells from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Using a combination of FITC-conjugated anti-Vδ1 antibodies, magnetic anti-FITC microbeads, and anti-CD4 antibody-coated superparamagnetic beads, the CD4+Vδ1+ T-cells can be successfully purified from the PBMC population.

Selective Isolation of CD4+ V&delta;1+ &gamma;&delta; T Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells

Hier bieden we een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie en klonen van de schaarse T-cel entiteit van perifere Vδ1+CD4+ T-cellen die, zoals we onlangs hebben laten zien, een extrathymische αβ T-cel voorloper is. Deze techniek maakt het mogelijk om deze cellen kwantitatief te isoleren, klonen en efficiënt uit te breiden in ex vivo cultuur.

Isolatie en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur van Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-cellen, een Extrathymic αβT-cel Progenitor

Technieken die betrouwbaar en efficiënt zijn voor het isoleren van immuuncellen in de nieren zijn nodig voor downstream-toepassingen. Dit vereist oppervlakte-antilichaammarkering van een klein aantal immuuncellen in de nieren. Hierin beschrijven we een beknopte methode voor het isoleren van immuuncellen in de nieren die schijnbaar dit doel bereikt.

Betrouwbaar en High Efficiency Winning van Kidney immuuncellen

Hier presenteren we een protocol bij het opwekken van tolerantie in transplantatie, en beoordelen van in vitro en in vivo de onderdrukkende capaciteit van afzonderlijke cel subsets van de ontvanger en de immuunstatus van de ontvanger naar donor of exogene antigenen.

In Vitro en In Vivo beoordeling van T-, B- en myeloïde cellen onderdrukkende activiteit en humorale reacties van transplantatie ontvangers

Hier presenteren we een nieuwe klinische rang isolatie en cultuur methode voor nieren gerelateerde stromale cellen (kPSCs) op basis van hele orgel perfusie met spijsverteringsenzymen en NG2-cel verrijking. Met deze methode is het mogelijk om het verwerven van voldoende cel nummers voor cellulaire therapie.

Een nieuwe klinische Grade isolatie methode voor menselijke nieren gerelateerde stromale cellen

We presenteren een eenvoudig protocol voor de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen uit volbloed verkregen van patiënten met de diagnose Sézary-syndroom, gevolgd door selectie van CD4 + T-cellen, hun stimulatie met phorbol12-myristate13-acetaat en A23187 ionofoor, en voorbereiding van RNA voor transcriptomische profilering.

Isoleren van menselijke perifere bloedmonucleaire cellen en CD4 + T-cellen van patiënten met het Sézary-syndroom voor transcriptomische profilering

Na virale infectie, nier herbergt een relatief groot aantal CD8+ T cellen en biedt een kans om niet-mucosale TRM cellen te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om muisnierlymfocyten te isoleren voor stromingscytometrieanalyse.

Isolatie van Mouse Kidney-Resident CD8+ T cellen voor Flow Cytometry Analysis

Hier presenteren we een protocol om hoogwaardige kernen uit bevroren muizennieren te isoleren die de representatie van medullaire nierceltypen verbeteren en de genexpressieartefacten van enzymatische weefseldissociatie vermijden.

Nuclei-isolatie van volwassen muizennier voor single-nucleus RNA-sequencing

Dit protocol beschrijft een overlevingsprocedure voor een veilige en goed verdraagde bilaterale murale nierlymfadenectomie.

Murine bilaterale nierlymfadenectomie

Leer een protocol voor de isolatie van dubbelnegatieve T-cellen uit de nier van muizen met behulp van collageenase-vertering en magnetische celscheiding. Deze methode ondersteunt onderzoek naar immunologie en nierziekten.

Isolatie van Double Negative αβ T-cellen uit de nier

Meer video's verkennen