Stretching micropatterned Cellen op een PDMS membraan

Het algemene doel van deze procedure is om patrooncellen te rekken op een elastisch membraan van poly dimethylsiloxaan of PDMS. Dit wordt bereikt door de creatie van een PDMS-vel, gevolgd door het aanbrengen van een micropatroon op de PDMS. Het micropatroon-PDMS-vel wordt vervolgens gemonteerd op het rekapparaat en er wordt een medium-vasthoudend reservoir bovenop geplaatst.

Vervolgens worden de cellen op het oppervlak van het micro-gepatteerde PDMS-vel geplaatst en krijgt men de tijd om ze aan het patroon te laten hechten voordat ze worden doegespoeld om niet-gehechte cellen te verwijderen. De laatste stap is het aanbrengen van een verlenging aan het PDMS met cellen om de cellen uit te rekken. Ten slotte wordt videomicroscopie gebruikt om aan te tonen dat het uitoefenen van krachten op de retractieve vezels van mitotische zoogdiercellen bij celrekking leidt tot vervorming van de cel.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de biomechanica, zoals: wat zijn de effecten van externe krachten op cellulaire processen zoals celdeling? We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we krachten wilden uitoefenen op een delende cel; begin met het uitsnijden van een stuk PDMS van ongeveer 35 bij 20 millimeter uit een vooraf geproduceerde plaat. Hier wordt een commercieel verkrijgbare dunne PDMS-plaat gebruikt, omdat deze reproducebaarder is en minder snel breekt in vergelijking met op maat gemaakte PDMS.

Verwijder de bovenste en onderste beschermende plasticlagen en gebruik een pincet om de PDMS in een plastic petrischaal te plaatsen. Was de PDMS vervolgens gedurende vijf minuten met 70% ethanol op een rotator bij 30 oscillaties per minuut. Droog na het wassen het oppervlak door er lucht overheen te blazen.

Belicht vervolgens het PDMS gedurende vijf minuten met diep ultraviolet licht op een afstand van ongeveer vijf centimeter van de ultravioletlampen. Bereid ondertussen een E-D-C-N-H-S-oplossing voor zoals beschreven in het tekstprotocol. De oplossing moet vlak voor gebruik worden bereid, omdat de reactiviteit van de oplossing binnen enkele uren afneemt.

Verplaats de PDMS-vellen van de petrischaal naar het deksel van de petrischaal, dat niet is belicht. Dit zorgt ervoor dat de omgeving van het PDMS zeer hydrofoob is en vergemakkelijkt de volgende stap.

Pipetteer de E-D-C-N-H-S-oplossing over de PDMS en laat dit 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Spoel na de incubatie het overtollige E-D-C-N-H-S af met water.

Voeg vervolgens de PLL-geënt PEG-oplossing toe en laat dit drie uur tot een nacht incuberen bij kamertemperatuur; spoel na incubatie het overtollige PLL-geënte PEG van het PDMS af met water. Het PDMS is nu gepassiveerd of gefunctionaliseerd met PLL-geënt PEG en kan gedurende enkele dagen worden bewaard bij vier graden Celsius. Om het PDMS te patroneren, wordt een PDMS-vel op een synthetisch kwarts fotomasker geplaatst dat de microstructuren voor het patroneren bevat.

Plaats de PDMS-zijde met de gegrafted PEG-PLL naar de chromezijde van het fotomasker. Belicht vervolgens zeven minuten door het fotomasker op een afstand van ongeveer vijf centimeter van de ultravioletlampen. Na de belichting.

Voeg water toe aan het masker en het PDMS en pel vervolgens het PDMS langzaam van het masker af; monteer het eerder gepassiveerde PDMS op het rekapparaat. Bevestig één zijde van het PDMS aan het vaste deel van de rekker. Fixeer de andere zijde aan het mobiele deel van de rekker zonder te veel van de PDMS-vel vast te klemmen.

Als de PDMS te strak is vastgeklemd, wordt deze korter, wat kan leiden tot breuk aangezien de spanning groter zal zijn voor dezelfde rekguinst. Zorg ervoor dat de schroeven goed zijn aangedraaid, anders zal de PDMS-plaat verschuiven zodra de rek begint, of later tijdens het experiment. Incubeer vervolgens de PDMS gedurende één uur met een fibronectine-oplossing.

Bij kamertemperatuur is het mogelijk om andere extracellulaire matrixeiwitten te gebruiken, maar deze zijn niet getest met dit protocol. Spoel als laatste stap de PDMS af met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Snijd vervolgens een rechthoek van PDMS uit een dikke PDMS-plaat.

Snijd vervolgens een tweede rechthoek binnenin. Om een reservoir te maken dat de cellen en het medium vasthoudt, brengt u siliconenvet aan onder dit rechthoekige uitgesneden PDMS en plaatst u dit bovenop de PDMS-plaat om een medium-retentiereservoir te vormen. Het vet zorgt ervoor dat het reservoir tijdens het rekken kan glijden over de PDMS-plaat om de cellen te patroneren.

Los eerst de cellen los uit een kweekfles bij 50% confluentie. Zodra de cellen in suspensie zijn, worden ze meerdere keren gepipetteerd met een 200 µL tip om aggregaten op te breken, zodat individuele cellen aan het patroon kunnen binden. Voeg vervolgens één milliliter van de cel-suspensie toe aan de pool.

Laat de cellen 10 tot 30 minuten binden aan de patronen, afhankelijk van het celtype, in een incubator bij 37 °C. Zodra de cellen aan de patronen zijn gehecht, worden de zwevende cellen voorzichtig weggespoeld met geëquilibreerd medium.

Verwijder het medium met een aspiratiepipet terwijl er gelijktijdig medium wordt toegevoegd. Het is cruciaal om een voldoende flux te handhaven om niet-gehechte cellen weg te spoelen, terwijl de cellen ondergedompeld blijven in het medium. Plaats vervolgens een dekglas bovenop het reservoir om verdamping en lekkage van het medium te voorkomen in het geval dat het PDMS breekt, en laat de cellen enkele uren op de patronen uitspreiden.

Plaats het apparaat vervolgens op een omgekeerde microscoop en start de beeldvorming. Vermijd het gebruik van olie-immersieobjectieven, aangezien deze niet zullen werken vanwege focusproblemen. Om de micro-patrooncellen te rekken, draait u aan de micrometrische schroef terwijl u de positie van de tafel in de x-, y- en z-assen corrigeert.

De positie van de tafel moet worden gecorrigeerd om de verbreding van de PDMS en het verlies van focus tegen te gaan. De techniek die in dit videoprotocol wordt gepresenteerd, maakte het mogelijk om krachten uit te oefenen op de retractievezels van mitotische zoogdiercellen door het substraat aan het begin van de metafase uit te rekken. Sommige van deze retractievezels werden van het cellichaam weggetrokken, wat resulteerde in een mechanische kracht die op de cortex van de mitotische cellen werd uitgeoefend; om dit te bereiken, wordt de cel vóór het uitrekken op een ovaal patroon geplaatst.

Het patroon wordt aangebracht terwijl het PDMS wordt uitgerekt tijdens het impregneren van ronde patronen via het fotomasker. Na het uitrekken wordt het substraat zodanig gespannen dat het patroon een cirkel wordt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u cellen op macro-patronen kunt enten en vervolgens rekkrachten op het substraat kunt uitoefenen.