Name: Stretching micropatterned Cellen op een PDMS membraan (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Leer hoe je cellen op een microgepatroneerd PDMS-membraan kunt uitrekken voor onderzoek naar celbiomechanica. Deze methode maakt gecontroleerde mechanische stimulatie van mitotische zoogdiercellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk is opgericht door Institut Curie, Parijs, Frankrijk. De mechanische brancard werd ontworpen door Damien Cuvelier (Institut Curie) en is vervaardigd door GREM (mecanique-grem.com). Het patroon op PDMS is ontwikkeld door Ammar Azioune (Bordeaux II University).

1. Passivering van de PDMS <ol><li> Knip een stuk PDMS ongeveer 35 mm x 20 mm uit een vooraf gemaakte blad (bijvoorbeeld GelPak, zoals vermeld in de tabel van materialen). </li><li> Verwijder de bovenste en onderste beschermende lagen kunststof (indien nodig) en gebruik pincet om de PDMS plaatsen in een plastic (niet celcultuur behandeld) petrischaal. </li><li> Was de PDMS met 70% ethanol gedurende 5 minuten op een rotator bij 30 oscillaties / min. </li><li> Droog het oppervlak door stromende lucht op. </li><li> Verlicht met diepe UV (λ = 180 nm) gedurende 5 min bij een afstand van de UV-lampen van ongeveer 5 cm (zie Materialen blad voor referentie licht, parameters variëren voor verschillende lampen). </li><li> Bereid 200 ul van EDC / NHS oplossing bij PDMS stuk (dit moet vers worden bereid voor gebruik omdat de reactiviteit van de oplossing vervalt in enkele hr). 1 ml 0,05 M MES + 0,5 M NaCl bij pH 6,0, voeg 11,5 mg Sulfo-NHS en 19,2 mg EDC. </li><li> Breng dePDMS vellen uit de petrischaal om het deksel van de petrischaal, die niet zijn belicht. Dit zal ervoor zorgen dat de omgeving van de PDMS zijn zeer hydrofoob en de volgende stap te vergemakkelijken. </li><li> Voeg EDC / NHS oplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel EDC / NHS met water. </li><li> Add PLL-g-PEG-oplossing (0,5 mg / ml in 10 mM HEPES pH 8,6) en incubeer van 3 uur &#39;s nachts bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel de PLL-g-PEG met water. Gepassiveerd PDMS (gefunctionaliseerd met PLL-g-PEG) worden enkele dagen bewaard bij 4 ° C. </li></ol> 2. Patroonvorming van de PDMS <ol><li> Neem een PDMS vel en plaats het op een synthetische kwarts fotomasker met het microfeatures voor patronen (zie figuur 1). Plaats de PDMS zijkant voorzien van het PLL-g-PEG geconfronteerd met de chromen kant van de fotomasker. </li><li> Belichten gedurende 7 min door het fotomasker op afstand van de UV-lampen van ongeveer 5 cm.</li><li> Voeg water op het masker + PDMS en schil de PDMS langzaam het masker af. </li><li> Incubeer met fibronectine bij 50 mg / ml in HEPES buffer bij pH 8,6 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het is mogelijk om anderen ECM eiwitten te gebruiken, maar deze zijn niet getest met dit protocol. </li><li> Spoelen met PBS. </li></ol> 3. Het toestel bevestigen <ol><li> Monteer de eerder gepassiveerd PDMS op de stretching apparaat (zie Overleg voor het oplossen van problemen). <ol><li> Bevestig een zijde van de PDMS het vaste deel van de brancard. </li><li> Bevestig de andere kant van het mobiele gedeelte van de stretcher zonder klemmen te veel van het PDMS vel. </li></ol></li><li> Snijd een rechthoek van PDMS (22 mm x 19 mm) in een dikke PDMS steek en snij een rechthoek binnen om een pool (of frame) hebben dat de cellen en media behouden (zie figuur 2). </li><li> Voeg siliconenvet onder deze PDMS zwembad en plaats deze op de top van de PDMS vel het creëren van een medium behoud zwembad. Het vet zal het glijden van het zwembad over de PDMS vel mogelijk te maken tijdens het uitrekken. </li></ol> 4. Patroonvorming van de Cellen <ol><li> Maak de cellen van een 50% confluentie kolf met Versene. </li><li> Tel de cellen en resuspendeer ze in een concentratie van 200.000 cellen / ml. </li><li> Voeg 1 ml celsuspensie in het zwembad (zie Overleg voor meer informatie). </li><li> Laat de cellen binden aan de patronen voor 10-30 min (afhankelijk van het celtype, RPE-1 cellen 10 min en HeLa-cellen 20 min. duren). </li><li> Zachtjes spoelen van de drijvende cellen met in evenwicht medium (evenwicht middelgroot incubator). </li><li> Laat de cellen verspreid voor een paar uur op de patronen (RPE-1 zal minstens 2 uur nodig hebben; HeLa cellen 3 uur nodig). </li><li> Voeg een dekglaasje bovenop de pool verdamping en middelgrote lekkage indien het PDMS onderbrekingen voorkomen. </li><li> Plekje op een omgekeerde microscoop en start beeldvorming. Vermijd het gebruik van olie immersie obstellingen als het niet zal werken als gevolg van focus problemen. </li></ol> 5. Stretching <ol><li> Draai de micrometrische schroef tijdens het corrigeren van de fase positie in de x-, y-en z-as (voornamelijk x). De positie van het podium moet worden gecorrigeerd aan de verbreding van de PDMS en het verlies van de focus tegen te gaan. (Zie &quot;Tijdens de rekken&quot; paragraaf in de discussie). </li></ol>

<ol><li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).</li>
<li>Terenna, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+mechanisms+redirecting+cell+polarity+and+cell+shape+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast.</a> Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).</li>
<li>Guillot, C., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+epithelial+tissue+homeostasis+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis.</a> Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).</li>
<li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat%2FDachsous%2FFour-jointed+planar+cell+polarity+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li>
<li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+cell+mechanics%2C+cell-cell+interactions%2C+and+proliferation+on+epithelial+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).</li>
<li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).</li>
<li>Mitrossilis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-cell+response+to+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real-time single-cell response to stiffness.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).</li>
<li>Fink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+forces+control+mitotic+spindle+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">External forces control mitotic spindle positioning.</a> Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li>
<li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+micropatterns%3A+A+direct+printing+protocol+using+deep+Uvs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs.</a> Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).</li>
<li>Azioune, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+method+for+high-throughput+surface+patterning+of+deformable+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates.</a> Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).</li>
<li>Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+on+silicon+elastomer+%28PDMS%29+with+deep+UVs%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Exch%22%5BJournal%5D)">Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs.</a> Protoc. Exch. , (2011).</li>
<li>Sinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+respond+to+mechanical+stress+by+rapid+disassembly+of+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae.</a> Cell. 144 (3), 402-413 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Hoewel deze techniek vele malen gebruikt en getest, zijn er verschillende belangrijke stappen die leiden tot een mislukt experiment. Over het PDMS: Voor dit werk, GelPak, een commercieel beschikbare dunne PDMS vel, werd gebruikt. Alternatief PDMS platen kunnen direct worden gegoten uit PDMS mix. Wij raden u aan GelPak omdat het meer reproduceerbaar, en minder kans op breken in vergelijking met op maat gemaakte PDMS. Over het apparaat: <...

De cellen samenstellen van een weefsel in hogere organismen zijn onderworpen aan mechanische spanningen en rekkrachten afkomstig hetzij van de externe omgeving of uit de omliggende cellen 1,2. Cellen moeten zich aanpassen aan en tegen deze krachten, om de integriteit van het weefsel te behouden. Dergelijke krachten zijn ook belangrijk voor weefsels morfogenese tijdens ontwikkeling 3,4. Toepassing mechanische krachten op gekweekte cellen is een manier om te bootsen wat zou gebeuren in een weefsel, maar met een kwantitatieve en onafhankelijke regeling van celvorm en celvervorming 5,6. Hiervoor kunnen verschillende technieken worden gebruikt. Men kan drukken op de cellen (de volledige cel of deel daarvan), bijvoorbeeld met AFM of derivaten 7,8 en rek het substraat de cellen groeien op. De methode beschreven in dit document laat zien hoe een vliegtuig substraat bedekt met cellen strekken. Deze techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld ter beoordeling van de rol van krachten op mitotic zoogdiercellen 9. Mitotische cellen verbonden blijven op het substraat door retractie vezels en strekken de membraan een kracht uitgeoefend op de vezels, die op zijn beurt veroorzaakt de rotatie van de mitotische spoel. Het belang van het combineren van lijm micropatterns en stretching is om onafhankelijke controle van de krachten en de vorm van individuele cellen te bereiken. Het is bijvoorbeeld mogelijk om een ​​eivormige cel uitstrekken tot een perfect isotroop ronde vorm, terwijl uniaxiale rek wordt toegepast. Als de cellen niet worden gevlochten op micropatterns, eenassige stretching resultaten in cel rek, met de meeste cellen met een lange as in lijn met de stretch as. Het is dan moeilijk om het effect van de lange as uitlijning en het effect van het traject toegepast om de cellen te scheiden. Het apparaat is geschikt voor elke live cell imaging, inclusief lange time lapse fluorescentie microscopie, en drugs kan tijdens het experiment worden toegevoegd. De diepe UV&#39;s micropatterning methode 10werd in detail beschreven in Azioune et al.. 11 Patterning op PDMS werd beschreven in Azioune et al.. 12 De huidige stretching protocol is een video-versie van Carpi et al.. 13

<table><tbody><tr><td>GelPak</td><td>GelPak</td><td>PF-60-X4</td><td>Er zijn verschillende diktes/plakkerigheid beschikbaar. Een alternatief zou zijn om zelf uw PDMS te gieten&nbsp;</td></tr><tr><td>Siliconenvet</td><td>GE Bayer Silicones</td><td>Baysilone-Paste</td><td>Deze is biocompatibel</td></tr><tr><td>Rektoestel</td><td>GREM mécanique</td><td>Stretcher 2011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime;-ethylcarbodiimide hydrochloride)</td><td>Sigma</td><td>3450</td><td>6 maanden stabiel bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide natriumzout)</td><td>Sigma</td><td>56485</td><td>Beschermen tegen vocht</td></tr><tr><td>Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)</td><td>SurfaceSolutions (Zurich)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Synthetische Kwarts fotomasker</td><td>Toppan</td><td></td><td>Neem standaard binaire fotomasker in Kwarts</td></tr><tr><td>Fibronectine uit runderenplasma</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

stretching micropatterned cellen op een pdms membraan

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanische krachten op cellen en / of weefsels spelen een belangrijke rol in talrijke processen. We hebben een apparaat om cellen op een polydimethylsiloxaan (PDMS) membraan, geschikt imaging strekken ontwikkeld. Deze techniek is reproduceerbaar en veelzijdig. De PDMS membraan kan worden micropatterned om cellen of weefsels te beperken tot specifieke geometrie. De eerste stap is micropatterns drukken op de PDMS membraan met een diepe UV techniek. De PDMS membraan wordt vervolgens gemonteerd op een mechanische brancard. Een kamer is gebonden bovenop het membraan met biocompatibele vet glijden tijdens het traject mogelijk. De cellen worden gezaaid en mogen verspreiden voor enkele uren op de micropatterns. Het monster kan meerdere malen worden uitgerekt en zonder rek met behulp van een micrometrische schroef. Het duurt minder dan een minuut om het traject van toepassing zijn op haar volle omvang (ongeveer 30%). De hier gepresenteerde techniek heeft een gemotoriseerd apparaat, dat nodig is voor een niet bevattenpplying herhaalde cycli stretch snel en / of computergestuurde strekken, maar dit kan worden uitgevoerd. Uitrekken van cellen of weefsel kan van belang zijn voor vragen met betrekking tot cel krachten, cel reactie op mechanische stress of weefsel morfogenese. Deze video presentatie zal laten zien hoe je typische problemen die zich kunnen voordoen bij het doen van dit soort schijnbaar eenvoudige experiment te voorkomen.

<html> De in deze video protocol techniek de vordering van krachten op het terugtrekken vezels mitotische zoogdiercellen. Immers, tijdens de celdeling, in de mitotische fase zoogdiercellen trekken de vorm van een bol nemen en achter dunne actine kabels omgeven door membraan die zijn bevestigd aan het substraat. Deze kabels (retractie vezels), zijn het geheugen van de cel geometrie voordat je in divisie. Maken micropatterns met diepe UV door een fotomasker op PDMS dunne film (figuur 1) kon de geometrische...

Dit manuscript presenteert een techniek om de krachten te passen of release op hechtende cellen of weefsels met behulp van unidirectionele stretching.

Stretching micropatterned Cellen op een PDMS membraan

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Het algemene doel van deze procedure is om patrooncellen te rekken op een elastisch membraan van poly dimethylsiloxaan of PDMS. Dit wordt bereikt door de creatie van een PDMS-vel, gevolgd door het aanbrengen van een micropatroon op de PDMS. Het micropatroon-PDMS-vel wordt vervolgens gemonteerd op het rekapparaat en er wordt een medium-vasthoudend reservoir bovenop geplaatst.Vervolgens worden de cellen op het oppervlak van het micro-gepatteerde PDMS-vel geplaatst en krijgt men de tijd om ze aan het patroon te laten hechten voordat ze worden doegespoeld om niet-gehechte cellen te verwijderen. De laatste stap is het aanbrengen van een verlenging aan het PDMS met cellen om de cellen uit te rekken. Ten slotte wordt videomicroscopie gebruikt om aan te tonen dat het uitoefenen van krachten op de retractieve vezels van mitotische zoogdiercellen bij celrekking leidt tot vervorming van de cel.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de biomechanica, zoals: wat zijn de effecten van externe krachten op cellulaire processen zoals celdeling? We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we krachten wilden uitoefenen op een delende cel; begin met het uitsnijden van een stuk PDMS van ongeveer 35 bij 20 millimeter uit een vooraf geproduceerde plaat. Hier wordt een commercieel verkrijgbare dunne PDMS-plaat gebruikt, omdat deze reproducebaarder is en minder snel breekt in vergelijking met op maat gemaakte PDMS.Verwijder de bovenste en onderste beschermende plasticlagen en gebruik een pincet om de PDMS in een plastic petrischaal te plaatsen. Was de PDMS vervolgens gedurende vijf minuten met 70% ethanol op een rotator bij 30 oscillaties per minuut. Droog na het wassen het oppervlak door er lucht overheen te blazen.Belicht vervolgens het PDMS gedurende vijf minuten met diep ultraviolet licht op een afstand van ongeveer vijf centimeter van de ultravioletlampen. Bereid ondertussen een E-D-C-N-H-S-oplossing voor zoals beschreven in het tekstprotocol. De oplossing moet vlak voor gebruik worden bereid, omdat de reactiviteit van de oplossing binnen enkele uren afneemt.Verplaats de PDMS-vellen van de petrischaal naar het deksel van de petrischaal, dat niet is belicht. Dit zorgt ervoor dat de omgeving van het PDMS zeer hydrofoob is en vergemakkelijkt de volgende stap.Pipetteer de E-D-C-N-H-S-oplossing over de PDMS en laat dit 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Spoel na de incubatie het overtollige E-D-C-N-H-S af met water.Voeg vervolgens de PLL-geënt PEG-oplossing toe en laat dit drie uur tot een nacht incuberen bij kamertemperatuur; spoel na incubatie het overtollige PLL-geënte PEG van het PDMS af met water. Het PDMS is nu gepassiveerd of gefunctionaliseerd met PLL-geënt PEG en kan gedurende enkele dagen worden bewaard bij vier graden Celsius. Om het PDMS te patroneren, wordt een PDMS-vel op een synthetisch kwarts fotomasker geplaatst dat de microstructuren voor het patroneren bevat.Plaats de PDMS-zijde met de gegrafted PEG-PLL naar de chromezijde van het fotomasker. Belicht vervolgens zeven minuten door het fotomasker op een afstand van ongeveer vijf centimeter van de ultravioletlampen. Na de belichting.Voeg water toe aan het masker en het PDMS en pel vervolgens het PDMS langzaam van het masker af; monteer het eerder gepassiveerde PDMS op het rekapparaat. Bevestig één zijde van het PDMS aan het vaste deel van de rekker. Fixeer de andere zijde aan het mobiele deel van de rekker zonder te veel van de PDMS-vel vast te klemmen.Als de PDMS te strak is vastgeklemd, wordt deze korter, wat kan leiden tot breuk aangezien de spanning groter zal zijn voor dezelfde rekguinst. Zorg ervoor dat de schroeven goed zijn aangedraaid, anders zal de PDMS-plaat verschuiven zodra de rek begint, of later tijdens het experiment. Incubeer vervolgens de PDMS gedurende één uur met een fibronectine-oplossing.Bij kamertemperatuur is het mogelijk om andere extracellulaire matrixeiwitten te gebruiken, maar deze zijn niet getest met dit protocol. Spoel als laatste stap de PDMS af met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Snijd vervolgens een rechthoek van PDMS uit een dikke PDMS-plaat.Snijd vervolgens een tweede rechthoek binnenin. Om een reservoir te maken dat de cellen en het medium vasthoudt, brengt u siliconenvet aan onder dit rechthoekige uitgesneden PDMS en plaatst u dit bovenop de PDMS-plaat om een medium-retentiereservoir te vormen. Het vet zorgt ervoor dat het reservoir tijdens het rekken kan glijden over de PDMS-plaat om de cellen te patroneren.Los eerst de cellen los uit een kweekfles bij 50% confluentie. Zodra de cellen in suspensie zijn, worden ze meerdere keren gepipetteerd met een 200 µL tip om aggregaten op te breken, zodat individuele cellen aan het patroon kunnen binden. Voeg vervolgens één milliliter van de cel-suspensie toe aan de pool.Laat de cellen 10 tot 30 minuten binden aan de patronen, afhankelijk van het celtype, in een incubator bij 37 °C. Zodra de cellen aan de patronen zijn gehecht, worden de zwevende cellen voorzichtig weggespoeld met geëquilibreerd medium.Verwijder het medium met een aspiratiepipet terwijl er gelijktijdig medium wordt toegevoegd. Het is cruciaal om een voldoende flux te handhaven om niet-gehechte cellen weg te spoelen, terwijl de cellen ondergedompeld blijven in het medium. Plaats vervolgens een dekglas bovenop het reservoir om verdamping en lekkage van het medium te voorkomen in het geval dat het PDMS breekt, en laat de cellen enkele uren op de patronen uitspreiden.Plaats het apparaat vervolgens op een omgekeerde microscoop en start de beeldvorming. Vermijd het gebruik van olie-immersieobjectieven, aangezien deze niet zullen werken vanwege focusproblemen. Om de micro-patrooncellen te rekken, draait u aan de micrometrische schroef terwijl u de positie van de tafel in de x-, y- en z-assen corrigeert.De positie van de tafel moet worden gecorrigeerd om de verbreding van de PDMS en het verlies van focus tegen te gaan. De techniek die in dit videoprotocol wordt gepresenteerd, maakte het mogelijk om krachten uit te oefenen op de retractievezels van mitotische zoogdiercellen door het substraat aan het begin van de metafase uit te rekken. Sommige van deze retractievezels werden van het cellichaam weggetrokken, wat resulteerde in een mechanische kracht die op de cortex van de mitotische cellen werd uitgeoefend; om dit te bereiken, wordt de cel vóór het uitrekken op een ovaal patroon geplaatst.Het patroon wordt aangebracht terwijl het PDMS wordt uitgerekt tijdens het impregneren van ronde patronen via het fotomasker. Na het uitrekken wordt het substraat zodanig gespannen dat het patroon een cirkel wordt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u cellen op macro-patronen kunt enten en vervolgens rekkrachten op het substraat kunt uitoefenen.

stretching-micropatterned-cells-on-a-pdms-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We presenteren in dit artikel een nieuw strekken platform dat kan worden gebruikt om cel responsen op complexe anisotrope biaxiale mechanische vervorming onderzoeken en kwantificeren van de mechanische eigenschappen van biologisch weefsel.

A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) hebben de intrinsieke vermogen om onderscheid te maken en zichzelf organiseren in verschillende weefsel patronen; hoewel dit vereist de presentatie van ruimtelijke milieu-hellingen. Wij presenteren stencil micropatterning als een eenvoudige en robuuste methode om biochemische en mechanische gradiënten genereren voor het besturen van HPSC differentiatie patronen.

Stencil micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen voor Probing ruimtelijke organisatie van Differentiatie Fates

Een protocol voor het produceren van een groot gebied van nanogepatterreerde substraten uit kleine nanogepatterreerde mallen voor studie van nanotopografische modulatie van celgedrag wordt gepresenteerd.

Uitbreiding van nanopatterned Substrates met steek Techniek voor Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Dit rapport beschrijft een eenvoudige, gemakkelijk uit te voeren techniek, met behulp van lagedrukvacuüm, om microfluïdische kanalen te vullen met cellen en substraten voor biologisch onderzoek.

Een veelzijdige methode van patroonvorming Eiwitten en cellen

Hier presenteren we een protocol dat beschrijft de fabricage van rekbare, dual channel, orgel chip microfluidic cel cultuur apparaten voor Recapitulerend orgel-niveau functionaliteit in vitro.

Schaalbare fabricage van rekbare, Dual Channel, Microfluidic orgel Chips

Hier presenteren we een protocol voor micropatrintercellen met eencellige resolutie met behulp van DNA-geprogrammeerde adhesie. Dit protocol maakt gebruik van een benchtop fotolithografieplatform om patronen van DNA-oligonucleotiden op een glasplaat te creëren en vervolgens celmembranen te labelen met in de handel verkrijgbare complementaire oligonucleotiden. Hybridisatie van de oligo's resulteert in geprogrammeerde celadhesie.

Eenvoudige, betaalbare en modulaire patronen van cellen met behulp van DNA

We beschrijven verbeteringen aan een standaardmethode voor het meten van cellulaire tractiekrachten, gebaseerd op microcontactprinten met een enkele subtractieve patroonstap van puntarrays van extracellulaire matrixeiwitten op zachte hydrogels. Deze methode zorgt voor een eenvoudigere en consistentere fabricage van eilandpatronen, essentieel voor het regelen van de vorm van de celcluster.

Patroongeneratie voor micropatterntractiemicroscopie

Traditioneel wordt celkweek uitgevoerd op vlakke substraten die de natuurlijke omgeving van cellen in vivo slecht nabootsen. Hier beschrijven we een methode om celkweeksubstraten te produceren met fysiologisch relevante gebogen geometrieën en micropatterned extracellulaire eiwitten, waardoor systematisch onderzoek naar cellulaire detectie van deze extracellulaire signalen mogelijk is.

Generatie van multicue cellulaire micro-omgevingen door UV-fotopatterning van driedimensionale celcultuursubstraten

Dit protocol beschrijft een inktvrije, labelvrije, substraatonafhankelijke, high-throughput celpatroonmethode op basis van het magnetische Archimedes-effect.

Celpatronen met behulp van magnetische-Archimedes-strategie

Hier presenteren we een veelzijdig equibiaxiaal rekapparaat dat pneumatisch wordt bediend en compatibel is met microscopie met hoge resolutie.

Equibiaxiaal rekapparaat voor sterk vergrote live-cell confocale fluorescentiemicroscopie

We presenteren een dynamisch en omkeerbaar testplatform voor stijfheid, vervaardigd met behulp van een ultrazacht siliconenelastomeer (polydimethylsiloxaan, PDMS) met ingebedde ijzerdeeltjes. Deze nieuwe test is geschikt voor het bestuderen van opkomende tijdsafhankelijke fysieke veranderingen in celfenotypes, inclusief contactgeleiding. Hier meten we de uitlijning van neonatale ratten in de cardiomyocyten bij matrijping met behulp van magnetisme.

Magneto-reologische elastomeren met micropatroon om veranderingen in de uitlijning van cardiomyocyten te stimuleren

Leer hoe je cellen op een microgepatroneerd PDMS-membraan kunt uitrekken voor onderzoek naar celbiomechanica. Deze methode maakt gecontroleerde mechanische stimulatie van mitotische zoogdiercellen mogelijk.

Stretching micropatterned Cellen op een PDMS membraan

Meer video's verkennen