Name: Monitoring intraspecies competitie in een bacteriële celpopulatie door cocultivatie van fluorescerend gelabelde stammen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Leer intraspecifieke competitie in bacteriële populaties visualiseren met fluorescent gelabelde Bacillus subtilis-stammen. Deze methode volgt klonale expansie en eliminatie van mutaties in de tijd.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk in het laboratorium van de auteurs werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), het Fonds der Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds) en het Göttingen Centre for Molecular Biology (GZMB). De auteurs willen Jörg Stülke erkennen voor nuttige opmerkingen en kritische lezing van het manuscript.

1. Voorbereiding van Agar-platen, cultuurmedia, cryostocks en preculturen
<ol><li>Bereid groeimedia en benodigde reagentia voor (zie tabel met materialen en reagentia).</li>
	<li>Streep de B. subtilis stammen (b.v. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) en BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) die respectievelijk één en twee actieve GDH's uitdrukken)2 die zullen worden gebruikt in het concurrentie-experiment op SP medium agar platen om enkele kolonies te krijgen. Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C.</li>
	<li>Neem enkele kolonies en inenteer steriele kweekbuizen met een vloeibaar medium van 4 ml LB. Kweek de bacteriën 's nachts bij 28 °C en 220 tpm.</li>
	<li>Kweek 's nachts culturen bij 28 °C om te voorkomen dat de cellen lyseren of sporuleren.</li>
	<li>Meet de optische dichtheid van de culturen op een golflengte van 600 nm (OD600) met behulp van een standaard spectrofotometer.</li>
	<li>Als de culturen een OD600 van 2,0 hebben bereikt, meng dan 0,75 ml van de culturen met 0,75 ml steriele 50% glyceroloplossing in reactiebuizen van 1,5 ml. De uiteindelijke OD600 moet 1,0 zijn om cryostocks te verkrijgen die ongeveer 108 cellen/ml bevatten.</li>
	<li>Bewaar de buizen bij -80 °C.</li>
	<li>Maak drie preculturen van elke soort gelabeld met de cfp en yfp die coderen voor fluorofoorgenen. Ent de preculturen (steriele kweekbuizen met 4 ml LB vloeibaar medium) in met 1 μl cellen uit -80 °C cryostocks. Incubeer de culturen 's nachts bij 28 °C en 220 tpm.</li>
</ol>2. Cocultivatie van bacteriën, monsterverzameling en monsteropslag
<ol><li>Bereid vers 100 ml C-Glc en CE-Glc minimaal medium (zie tabel met reagentia en materialen) en breng 20 ml van elk medium over in steriele shakekolven van 100 ml.</li>
	<li>Neem 0,1 ml van de preculturen die 's nachts zijn gekweekt, verdun ze met 0,9 ml LB medium in een cuvette van 1,5 ml en bepaal de OD600.</li>
	<li>Neem voor het concurrentie-experiment die preculturen van de verschillende soorten met een vergelijkbare OD600 tussen 1,0-1,5.</li>
	<li>Om gemengde celpopulaties te verkrijgen, verdun de cellen van de preculturen met de juiste OD600 tot een OD600 van 0,05 in 20 ml C-Glc en CE-Glc minimaal medium aangevuld met 100 ml shakekolven. Voor het concurrentie-experiment moeten de twee stammen worden gemengd in een verhouding van 1:1.</li>
	<li>Neem 10 ml monsters uit de kolven, breng ze over in plastic buizen van 15 ml, oogst de cellen door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 4.000 x g in een standaard tafelcentrifuge en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Resuspend de cellen in 0,5 ml vers LB-medium en breng de cellen over in een steriele reactiebeker van 1,5 ml. Voeg 0,5 ml 50% steriele glycerol toe, meng de suspensie door rigoureuze vortexing en bewaar de monsters in een vriezer van -80 °C tot verdere behandeling.</li>
	<li>Incubeer de cellen die in de schudkolven zitten tot 24 uur bij 37 °C en 220 tpm. Houd de schudkolven in het donker om te voorkomen dat de fluoroforen op de foto worden gebleekt.</li>
	<li>Neem verdere monsters van 0,1 ml na 7 uur en 24 uur groei. Meet en noteer de OD600 van 1:10 verdunningen (in C-Glc of CE-Glc minimaal medium) van de monsters.</li>
	<li>Neem de juiste hoeveelheid cellen uit elke kweek om cryostocks te maken met een OD600 van 1,0. Bewaar de monsters bij -80 °C tot verdere behandeling.</li>
</ol>3. Monsterbehandeling, plating en incubatie voor kwantitatieve analyses
<ol><li>Ontdooi na het verzamelen van alle monsters de cryostocks en verdun de cellen in een zoutoplossing van 0,9% (zie tabel met reagentia en materialen) tot 10-3.</li>
	<li>Plaat 0,1 ml van de 10-3 verdunningen op SP medium agar platen en verdeel de cellen met steriele glazen pipetten.</li>
	<li>Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C in het donker totdat er enkele kolonies zijn verschenen.</li>
</ol>4. Het tellen van de overlevenden door stereofluorescentiemicroscopie voor kwantitatieve analyse
<ol><li>Verdeel de onderkant van de agarplaat met een zwarte pen in vier delen voor een betere oriëntatie terwijl u de overlevenden onder de stereofluorescentiemicroscoop telt.</li>
	<li>Plaats de plaat ondersteboven onder de microscoop en breng de kolonies scherp met behulp van de koude lichtbron.</li>
	<li>Zodra de kolonies scherp zijn, schakelt u over naar de juiste filterset voor GVB om de overlevende cellen van de stam met het CFP-labelte visualiseren. Tel de overlevenden van deze stam door de kolonies te labelen met een pen en noteer het nummer.</li>
	<li>Verwijder de etiketten met ethanol en schakel over naar de YFP-filterset om de overlevende cellen van de yfp-gelabeldestam te visualiseren. Tel de overlevenden opnieuw door de kolonies met een pen te labelen en noteer het nummer.</li>
</ol>5. Monsterbehandeling en microscopie voor semiquantitatieve analyses
<ol><li>Voor illustratieve cijfers, spot 10 μl van de 10-4 verdunning (ongeveer 100 cellen) vanaf stap 3.1 op een SP-agarplaat (zie figuur 3).</li>
	<li>Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C in het donker totdat er enkele kolonies zijn verschenen.</li>
	<li>Plaats de Petrischaal zonder deksel onder de microscoop en breng de plek scherp met behulp van de koude lichtbron.</li>
	<li>Maak foto's van de plekken voor illustratieve figuren. Kies een geschikte belichtingstijd voor het maken van de foto's van de kolonies met de koude lichtbron.</li>
	<li>Zonder de plaat te verplaatsen, gaat u over op de CFP-filterset, past u de belichtingstijd aan en maakt u een foto. Doe hetzelfde met de YFP-filterset en sla de foto's op voor verdere analyses.</li>
</ol>6. Gegevensanalyse
<ol><li>Gebruik software zoals Excel voor de kwantitatieve data-analyses. Bereken op basis van de getelde kolonies het percentage gele en blauwe kolonies met betrekking tot het hele aantal kolonies, dat is ingesteld op 100%.</li>
	<li>Gebruik de berekende getallen om een gestapeld staafdiagram te maken (zie figuur 4 en figuur 5). Gebruik een beeldverwerkingsprogramma zoals Adobe Photoshop om samengevoegde foto's te maken van de foto's die vanaf de verschillende plekken zijn gemaakt. Als alternatief kan de vrij beschikbare software ImageJ, te downloaden van <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> worden gebruikt voor beeldverwerking.</li>
	<li>Open de foto's vanaf één plek die zijn gemaakt met de GVB-filterset en de YFP-filterset. Optimaliseer het contrast en de helderheid om eventuele achtergrondfluorescentie van de media te verminderen.</li>
	<li>Ga naar een van de foto's en selecteer alles. Kopieer de afbeelding en plak deze op de andere afbeelding.</li>
	<li>Gebruik de functie "color dodge" om de foto's samen te voegen of leg de fluorescerende foto's over elkaar met behulp van het tabblad kanalen. Samengevoegde foto's van de kolonies uit verschillende media en verschillende tijdspunten vertegenwoordigen de groei van de verschillende stammen binnen de vloeibare cultuur.</li>
</ol>7. Specifieke tips: Dye Switch Experiment en cocultivatie van isogene stammen gelabeld met cfp en yfp
De expressie van een van de twee fluorofoor-coderende genen in B. subtilis kan de conditie en dus de groeisnelheid van de bacteriën beïnvloeden. Daarom wordt aanbevolen om de volgende experimenten uit te voeren om uit te sluiten dat de eliminatie van één concurrente stam uit de celpopulatie tijdens de teelt eenvoudigweg te wijten is aan een negatief effect van de fluorofoor:
<ol><li>Herhaal het hele experiment en cocultiveer omgekeerd gelabelde stammen (bijv. de eerdere cfp-gelabeldestam is nu gelabeld met het yfp-gen en vice versa). Hoewel omgekeerd, moeten de verkregen resultaten vergelijkbaar zijn met de eerdere observatie dat de ene stam een selectief groeivoordeel heeft ten opzichte van de andere stam.</li>
	<li>Herhaal het hele experiment en cocultiveer isogene stammen gelabeld met yfp en cfp (bijv. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) en BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)). Schat het negatieve effect van een van de twee fluoroforen op de geschiktheid van de bacteriën door de samenstelling van de celpopulatie in de loop van de tijd te volgen.</li>
</ol>

<ol><li>Buescher, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+network+reorganization+during+dynamic+adaptations+of+Bacillus+subtilis+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism.</a> Science. 335, 1099-1103 (2012).</li>
<li>Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection-driven+accumulation+of+suppressor+mutants+in+Bacillus+subtilis%3A+the+apparent+high+mutation+frequency+of+the+cryptic+gudB+gene+and+the+rapid+clonal+expansion+of+gudB%2B+suppressors+are+due+to+growth+under+selection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selection-driven accumulation of suppressor mutants in Bacillus subtilis: the apparent high mutation frequency of the cryptic gudB gene and the rapid clonal expansion of gudB+ suppressors are due to growth under selection.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Al Mamum, A. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+and+function+of+a+large+gene+network+underlying+mutagenic+repair+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identity and function of a large gene network underlying mutagenic repair of DNA breaks.</a> Science. 338, 1344-1348 (2012).</li>
<li>Koeppel, A. F., Wertheim, J. O., Barone, L., Gentile, N., Krizanc, D., Cohan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speedy+speciation+in+a+bacterial+microcosm%3A+new+species+can+arise+as+frequently+as+adaptations+within+a+species%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Speedy speciation in a bacterial microcosm: new species can arise as frequently as adaptations within a species.</a> ISME J. 7, 1080-1091 (2013).</li>
<li>Maughan, H., Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fitness+and+alteration+of+metabolic+pathways+during+Bacillus+subtilis+evolution+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Increased fitness and alteration of metabolic pathways during Bacillus subtilis evolution in the laboratory.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4105-4118 (2011).</li>
<li>Burkholder, P. R., Giles, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+biochemical+mutations+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Bot%22%5BJournal%5D)">Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis.</a> Am. J. Bot. 34, 345-348 (1947).</li>
<li>McLoon, A. L., Guttenplan, S. B., Kearns, D. B., Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+domestication+of+a+biofilm-forming+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tracing the domestication of a biofilm-forming bacterium.</a> J. Bacteriol. 193, 2027-2034 (2011).</li>
<li>Zeigler, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+168%2C+W23%2C+and+other+Bacillus+subtilis+legacy+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The origins of 168, W23, and other Bacillus subtilis legacy strains.</a> J. Bacteriol. 190, 6983-6995 (2008).</li>
<li>Gunka, K., Tholen, S., Gerwig, J., Herzberg, C., Stülke, J., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-frequency+mutation+in+Bacillus+subtilis%3A+requirements+for+the+decryptification+of+the+gudB+glutamate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A high-frequency mutation in Bacillus subtilis: requirements for the decryptification of the gudB glutamate dehydrogenase.</a> 194, 1036-1044 (2012).</li>
<li>Commichau, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Bacillus+subtilis+mutants+with+carbon+source-independent+glutamate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Bacillus subtilis mutants with carbon source-independent glutamate biosynthesis.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 106-113 (2007).</li>
<li>Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+suppressors+and+recovery+of+repressed+biochemical+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic suppressors and recovery of repressed biochemical memory.</a> J. Biol. Chem. 284, 12585-12592 (2009).</li>
<li>Gunka, K., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+glutamate+homeostasis+in+Bacillus+subtilis%3A+a+complex+interplay+between+ammonium+assimilation%2C+glutamate+biosynthesis+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation.</a> Mol. Microbiol. 85, 213-224 (2012).</li>
<li>Yan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+the+glutamate+pool+concentrations+in+enteric+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protection of the glutamate pool concentrations in enteric bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9475-9480 (2007).</li>
<li>Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+regulation+of+Bacillus+subtilis+glutamate+dehydrogenase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Role and regulation of Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase genes.</a> J. Bacteriol. 180, 6298-6305 (1998).</li>
<li>Commichau, F. M., Herzberg, C., Tripal, P., Valerius, O., Stülke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+protein-protein+interaction+governs+glutamate+biosynthesis+in+Bacillus+subtilis%3A+the+glutamate+dehydrogenase+RocG+moonlights+in+controlling+the+transcription+factor+GltC%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A regulatory protein-protein interaction governs glutamate biosynthesis in Bacillus subtilis: the glutamate dehydrogenase RocG moonlights in controlling the transcription factor GltC.</a> Mol. Microbiol. 65, 642-654 (2007).</li>
<li>Gordo, I., Perfeito, L., Sousa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+effects+of+mutations+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fitness effects of mutations in bacteria.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 21, 20-35 (2011).</li>
<li>Rabatinová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B4+subunit+of+RNA+polymerase+is+required+for+rapid+changes+in+gene+expression+and+competitive+fitness+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The δ subunit of RNA polymerase is required for rapid changes in gene expression and competitive fitness of the cell.</a> J. Bacteriol. 195, 2603-2611 (2013).</li>
<li>Capra, E. J., Perchuk, B. S., Skerker, J. M., Laub, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+mutations+that+prevent+crosstalk+enable+the+expansion+of+paralogous+signalling+protein+families%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adaptive mutations that prevent crosstalk enable the expansion of paralogous signalling protein families.</a> Cell. 150, 222-232 (2012).</li>
<li>García-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (15), (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Verschillende methoden zijn ontwikkeld om de competitieve fitheid van bacteriën te analyseren16. In veel gevallen werden de bacteriën gelabeld met verschillende antibioticaresistentiecassettes17. Net als bij onze aanpak maakt het labelen van de cellen met antibioticaresistentiecassettes het mogelijk om de competitieve geschiktheid van de bacteriën tijdens cocultivatie onder gedefinieerde groeiomstandigheden te evalueren. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de competitieve geschiktheid te b...

Bodembacteriën zijn meestal begiftigd met flexibele regulerende netwerken en brede metabolische capaciteiten. Beide functies stellen de cellen in staat om hun katabole en anabole paden aan te passen om te concurreren met hun collega's en andere micro-organismen voor de voedingsstoffen, die beschikbaar zijn in een bepaalde ecologische niche1. Als de bacteriën zich echter niet kunnen aanpassen aan hun omgeving, kunnen andere mechanismen het voortbestaan van een soort verklaren. Inderdaad, omdat veel bacteriën zich snel verspreiden en de populaties hoge celdichtheden kunnen bereiken, kunnen subpopulaties spontaan gunstige mutaties hebben geaccumuleerd die de cellen een selectief groeivoordeel bieden en daarom hun conditie verhogen. Bovendien kunnen mutatiehotspots en stress-geïnduceerde adaptieve mutagenese de evolutie van een maladapted bacterie2,3vergemakkelijken. Accumulatie van mutaties en groei onder continue selectie is dus de oorsprong voor de enorme microbiële diversiteit, zelfs binnen hetzelfde geslacht4,5. Net als in de natuur komt het vormen van bacteriële genomen ook voor in het laboratorium als gevolg van continue teelt onder selectie. Dit wordt geïllustreerd door de domesticatie van de Gram-positieve bacterie B. subtilis, die wereldwijd wordt gebruikt in fundamenteel onderzoek en in de industrie. In de jaren 1940 werd B. subtilis behandeld met DNA-schadelijke röntgenfoto's gevolgd door teelt onder een specifieke groeitoestand6. De mutaties die zich tijdens hun domesticatie in de bacteriën hebben opgehoopt, zijn verantwoordelijk voor het verlies van veel groeikenmerken, d.w.z. de B. subtilis laboratoriumstam 168 verloor het vermogen om complexe kolonies te vormen7,8.
Tegenwoordig is voor de best bestudeerde modelbacteriën Escherichia coli en B. subtiliseen verscheidenheid aan krachtige hulpmiddelen beschikbaar om hun genomen genetisch te manipuleren om specifieke wetenschappelijke vragen te beantwoorden. Soms veroorzaakt de inactivatie van een interessant gen een ernstig groeidefect, dat dan duidelijk zichtbaar is op standaard groeimedium9. Mutaties die daarentegen een zwak groeidefect veroorzaken en dus slechts een geringe invloed hebben op de conditie van de stam, worden vaak genegeerd. In beide gevallen resulteren langdurige incubatie en passaging van de mutante stammen gedurende meerdere generaties echter meestal in de accumulatie van suppressor mutanten die het fenotype van de ouderstam hebben hersteld2,9. De karakterisering van suppressor mutanten en de identificatie van de mutaties die het groeidefect van de parent mutant stam hebben hersteld is een zeer nuttige benadering die opheldering van belangrijke en vaak nieuwe cellulaire processen mogelijk maakt10,11.
Wij zijn geïnteresseerd in de bestrijding van glutamaat homeostase in B. subtilis12. Net als E. colireageert B. subtilis op verstoring van glutamaathomeostase (d.w.z.blok in glutamaatdegradatie2) door de accumulatie van suppressormutanten. De genomische veranderingen in deze suppressor mutanten die werden verkregen door spontane mutatie bleken glutamaat homeostase snel te herstellen9,13. Daarom is het niet verwonderlijk dat aanpassing van B. subtilis aan een specifieke groeitoestand tijdens domesticatie van de bacterie wordt weerspiegeld in enzymsynthese en in de geëvolueerde enzymatische activiteiten, die betrokken zijn bij glutamaatmetabolisme12. Er is gesuggereerd dat het gebrek aan exogene glutamaat in het groeimedium tijdens het domesticatieproces de drijvende kracht was voor het ontstaan en fixeren van het cryptische glutamaatdehydrogenase (GDH) gudBCR-gen in de laboratoriumstam 1682,14. Deze hypothese wordt ondersteund door onze observatie dat de verminderde hoeveelheid GDH-activiteit in de laboratoriumstam de bacteriën een selectief groeivoordeel biedt wanneer exogene glutamaat schaars is2. Bovendien resulteert de teelt van een B. subtilis stam, het synthetiseren van de GDH GudB, bij afwezigheid van exogene glutamaat in de accumulatie van suppressor mutanten die het gudB gen2hebben geactiveerd . Het is duidelijk dat de aanwezigheid van een katabolisch actieve GDH nadelig is voor de cel omdat endogene glutamaat dat anders voor anabolisme zou kunnen worden gebruikt, wordt afgebroken tot ammonium en 2-oxoglutaraat (figuur 1). Wanneer glutamaat daarentegen door het medium wordt geleverd, heeft een B. subtilis-stam die is uitgerust met GDH-activiteit op hoog niveau een selectief groeivoordeel ten opzichte van een soort die slechts één functionele GDH synthetiseert. Het is redelijk om aan te nemen dat GDH-activiteit op hoog niveau de bacteriën in staat stelt glutamaat als tweede koolstofbron te gebruiken naast andere koolstofbronnen die door het medium2 worden geleverd (zie figuur 1). GDH-activiteit heeft dus een sterke invloed op de geschiktheid van bacteriën, afhankelijk van de beschikbaarheid van exogene glutamaat.
Hier presenteren we een zeer illustratieve methode om de intraspecies-competitie tussen twee B. subtilisstammen die verschillen in een enkele locus op het chromosoom te monitoren en te visualiseren (Figuur 2). De twee stammen werden gelabeld met de yfp- en cfp-genen die coderen voor de fluoroforen YFP en GVB, en gecocultiveerd onder verschillende voedingsomstandigheden. Door na verloop van tijd te bemonsteren en door geschikte verdunningen op agarplaten te plateren, konden de overlevenden in elk van de culturen gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van een gemeenschappelijke stereofluorescentiemicroscoop. De procedure die in dit artikel wordt beschreven, is eenvoudig uit te voeren en geschikt om de snelle klaonale expansie en eliminatie van respectievelijk gunstige en schadelijke mutaties in een celpopulatie in de loop van de tijd te visualiseren.

<table><tbody><tr><td>(NH4)2SO4&nbsp;</td><td>Roth, Germany</td><td>3746</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Difco, USA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium ferric citrate (CAF)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>9714</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Roth, Germany</td><td>5239</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Applichem, Germany</td><td>A3617</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Roth, Germany</td><td>4043</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4&bull;3H2O</td><td>Roth, Germany</td><td>6878</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Applichem, Germany</td><td>A3582</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth, Germany</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Roth, Germany</td><td>6751</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull;7H2O&nbsp;</td><td>Roth, Germany</td><td>P027</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&nbsp;</td><td>Roth, Germany</td><td>T881</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&bull;4H2O</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>102786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth, Germany</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient broth</td><td>Roth, Germany</td><td>X929</td><td></td></tr><tr><td>Potassium glutamate</td><td>Applichem, Germany</td><td>A3712</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Roth, Germany</td><td>8952</td><td></td></tr><tr><td>Tryptophan</td><td>Applichem, Germany</td><td>A3445</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Roth, Germany</td><td>2363</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Reactiebuisjes</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>72,690,001</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml Reactiebuisjes</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Plastic buisjes met schroefdop</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>62,554,001</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Polystyreen cuvettes</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>67,742</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Glas kweekbuisjes&nbsp;</td><td>Brand, Germany</td><td>7790 22</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Schooiflacons met aluminium doppen</td><td>Brand, Germany</td><td>928 24</td><td></td></tr><tr><td>Steriele 10 ml glazen pipetten</td><td>Brand, Germany</td><td>278 23</td><td></td></tr><tr><td>Incubator (28 en 37 &deg;C)</td><td>New Brunswick</td><td>M1282-0012</td><td></td></tr><tr><td>Standaard pipettenset (2-20 &mu;l, 10-100 &mu;l, 100-1.000 &mu;l)</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>4910 000.034, 4910 000.042,</td><td></td></tr><tr><td>Tabel centrifuge voor 1.5 en 2 ml reactiebuisjes</td><td>Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany</td><td>75002425</td><td></td></tr><tr><td>Tabel centrifuge voor 15 ml plastic buisjes</td><td>Heraeus Biofuge Primo R, Germany</td><td>75005440</td><td></td></tr><tr><td>Standaard spectrofotometer</td><td>Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany</td><td>80-2112-21</td><td></td></tr><tr><td>Stereofluorescentie microscoop&nbsp;</td><td>Zeiss SteREO Lumar V12, Germany</td><td>495008-0009-000</td><td></td></tr><tr><td>Vriezer (-20 en -80 &deg;C)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Koelkast (4 &deg;C)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td>Zirbus, LTA 2x3x4, Germany</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany</td><td>766</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Vortex 3, IKA, Germany</td><td>3340000</td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>CP2202S, Sartorius, Germany</td><td>vervangen door</td><td></td></tr><tr><td>Zwarte pen (permanente marker)</td><td>Staedler, Germany</td><td>317-9</td><td></td></tr><tr><td>Powerpoint programma</td><td>Microsoft, USA</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Office Excel programma</td><td>Microsoft, USA</td><td>-</td><td>Programma voor dataverwerking</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5</td><td>Adobe, USA</td><td>vervangen door CS6, download</td><td>Computerprogramma voor beeldverwerking</td></tr><tr><td>Computer</td><td>PC of Mac</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ZEN pro 2011 software voor de stereofluorescentie microscoop</td><td>Zeiss, Germany</td><td>410135 1002 110</td><td>AxioCam MRc Rev. Verkregen via Zeiss</td></tr><tr><td colspan="4">Specifieke oplossing recepten</td></tr><tr><td colspan="4">SP Medium</td></tr><tr><td>8 g Nutrient broth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25 mg MgSO4&bull;7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 g agar voor solid SP medium</td><td></td><td></td><td>indien vereist</td></tr><tr><td>voeg 1 L met H2O toe</td><td></td><td></td><td>autoclaveer gedurende 20 min bij 121 &deg;C</td></tr><tr><td>1 ml CaCl2 (0.5 M), gesteriliseerd door filtratie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml MnCl2 (10 mM), gesteriliseerd door filtratie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), gesteriliseerd door filtratie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">LB Medium</td></tr><tr><td>10 g Tryptone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 g Yeast extract</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 g NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 g agar voor solid LB medium</td><td></td><td></td><td>indien vereist</td></tr><tr><td>voeg 1 L met H2O toe</td><td></td><td></td><td>autoclaveer gedurende 20 min bij 121 &deg;C</td></tr><tr><td colspan="4">C-Glc minimaal Medium</td></tr><tr><td>200 ml 5 x C-zouten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), gesteriliseerd door filtratie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), gesteriliseerd door filtratie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml III&rsquo; zouten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 ml Glucose (20%)</td><td></td><td></td>

monitoring intraspecies competitie in een bacteriële celpopulatie door cocultivatie van fluorescerend gelabelde stammen

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Veel micro-organismen zoals bacteriën verspreiden zich extreem snel en de populaties kunnen hoge celdichtheden bereiken. Kleine fracties van cellen in een populatie hebben altijd geaccumuleerde mutaties die schadelijk of gunstig zijn voor de cel. Als het fitnesseffect van een mutatie de subpopulatie een sterk selectief groeivoordeel biedt, kunnen de individuen van deze subpopulatie snel overcompeteren en zelfs hun directe medemensen volledig elimineren. Kleine genetische veranderingen en selectiegestuurde accumulatie van cellen die gunstige mutaties hebben verworven, kunnen dus leiden tot een volledige verschuiving van het genotype van een celpopulatie. Hier presenteren we een procedure om de snelle klaonale expansie en eliminatie van respectievelijk gunstige en schadelijke mutaties in een bacteriecelpopulatie in de loop van de tijd te monitoren door cocultivatie van fluorescerend gelabelde individuen van de Gram-positieve modelbacterie Bacillus subtilis. De methode is gemakkelijk uit te voeren en zeer illustratief om intraspecies concurrentie weer te geven tussen de individuen in een bacteriële celpopulatie.

De hier beschreven methode werd met succes toegepast om de intraspecies-concurrentie te visualiseren in een celpopulatie bestaande uit B. subtilis-stammen die werden gelabeld met de cfp- en yfp-genen die coderen voor respectievelijk de fluoroforen GVB en YFP. Zoals weergegeven in figuur 3, kan de methode worden gebruikt om intraspecies-concurrentie op een zeer illustratieve manier te visualiseren. Door de monsters op kleine gebieden te spotten, werd de klonale samenstelling van...

Bacteriën kunnen tijdens hun leven schadelijke of gunstige mutaties ophopen. In een populatie van cellen kunnen individuen die gunstige mutaties hebben geaccumuleerd, snel hun medemens overtreffen. Hier presenteren we een eenvoudige procedure om intraspecies-concurrentie in een bacteriële celpopulatie in de loop van de tijd te visualiseren met behulp van fluorescerend gelabelde individuen.

Monitoring intraspecies competitie in een bacteriële celpopulatie door cocultivatie van fluorescerend gelabelde stammen

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

Deze methode maakt gebruik van co-cultivatie van fluorescentielabelled Bacillus subtilis om de snelle clonale expansie en eliminatie van gunstige en schadelijke mutaties in een bacteriële celpopulatie in de loop van de tijd te monitoren. Bereid eerst de preculturen van de bacteriën voor het competitie-experiment voor. Meng gelijke hoeveelheden van de fluorescentielabelled stammen en co-cultiveer de bacteriën onder verschillende nutritionele condities.Verzamel vervolgens de monsters op verschillende tijdstippen, verdun deze op passende wijze en zaai de cellen uit op agarplaten. Visualiseer en tel nu de overlevende stammen met behulp van stereoflourescentiemicroscopie. Uiteindelijk kunnen de resultaten het percentage overlevende bacteriën bepalen ten opzichte van het totale aantal getelde koloniën.In tegenstelling tot het monitoren van intrasoortelijke competitie met behulp van verschillende antibioticaresistentie-cassettes voor stamlabeling, zijn bij deze methode fluorescent gelabelde competitorstammen vrijwel volledig isotoon en in staat om op dezelfde AGA-platen te groeien. De procedure wordt gepresenteerd door Lorena, een PhD-student in mijn laboratorium: inoculeer vier millilite

monitoring-intraspecies-competition-bacterial-cell-population

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Speare, L., et al. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a co-incubation assay used to study how bacterial strains compete in a shared environment. It is widely applied in microbiology to identify mechanisms, such as contact-dependent or contact-independent killing, that drive these interactions.

Coincubation Assay for Studying Competitive Interactions Between Bacterial Strains

This video demonstrates a fluorescence microscopy-based method to study bacterial competition at the single-cell level. This method provides insights into the structure and function of bacterial communities.

Bacterial Co-Incubation Assay: A Fluorescence Microscopy-Based Technique to Visualize Intraspecific Bacterial Competition at the Single-Cell Level

We beschrijven een kwalitatieve test voor bacteriële concurrentie gemedieerd door de...

Een Visual Assay om T6SS-gemedieerde Bacteriële Concurrentie Monitor

Bacteriën produceren uitgescheiden verbindingen die het potentieel heeft om de fysiologie van hun microbiële buren beïnvloeden. Hier beschrijven we een coculture scherm dat de opsporing van dergelijke chemisch gemedieerde interspecies interacties door het mengen bodemmicroben met fluorescerende transcriptionele reporter stammen van Bacillus subtilis op vaste media toelaat.

Met behulp Coculture te sporen Chemisch Mediated Interspecies Interacties

De rol van het assortiment (ruimtelijke segregatie) in de evolutionaire scenario's kunnen worden onderzocht met behulp van eenvoudige microbiële systemen in het laboratorium die het mogelijk maken gecontroleerde aanpassing van de ruimtelijke verdeling. Door wijziging van de oprichter celdichtheid, kunnen diverse assortiment niveaus worden gevisualiseerd met behulp van fluorescent gelabelde bacteriestammen in de kolonie biofilms van Bacillus subtilis.

Monitoring ruimtelijke segregatie in Surface Kolonisatie microbiële populaties

Bacteriën coderen diverse mechanismen voor het aangaan van interbacteriële concurrentie. Hier presenteren we een op cultuur gebaseerd protocol voor het karakteriseren van concurrerende interacties tussen bacteriële isolaten en hoe ze van invloed zijn op de ruimtelijke structuur van een gemengde populatie.

Coincubation assay voor het kwantificeren van concurrerende interacties tussen Vibrio fischeri isolaten

Dit live-bacteriële celbeeldvormingsprotocol maakt visualisatie mogelijk van interacties tussen meerdere bacteriële soorten op het eencellige niveau in de tijd. Time-lapse imaging maakt het mogelijk om elke bacteriesoort in monocultuur of cocultuur te observeren om interspecies interacties te ondervragen in bacteriële gemeenschappen met meerdere soorten, waaronder individuele celmotiliteit en levensvatbaarheid.

Kinetische visualisatie van single-cell interspecies bacteriële interacties

Dit manuscript beschrijft een methode voor het gebruik van eencellige fluorescentiemicroscopie om bacteriële concurrentie in cocultuur te visualiseren en te kwantificeren.

Kwantificering van interbacteriële concurrentie met behulp van single-cell fluorescentiebeeldvorming

Titel Cell Encapsulation door Droplets

Het vermogen van menselijke embryonale stamcellen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in alle celtypen van het lichaam, suggereert dat zij een grote belofte voor zowel de medische toepassingen en als een research tool voor het aanpakken van fundamentele vragen bij ontwikkeling en ziekte vast te houden. Hier bieden wij een beknopte, stap-voor-stap protocol voor de winning van menselijke embryonale stamcellen uit embryo's door immunosurgical isolatie van de binnenste celmassa.

Afleiding van menselijke embryonale stamcellen door Immunosurgery

Leer intraspecifieke competitie in bacteriële populaties visualiseren met fluorescent gelabelde Bacillus subtilis-stammen. Deze methode volgt klonale expansie en eliminatie van mutaties in de tijd.

Monitoring intraspecies competitie in een bacteriële celpopulatie door cocultivatie van fluorescerend gelabelde stammen

Meer video's verkennen