Monitoring intraspecies competitie in een bacteriële celpopulatie door cocultivatie van fluorescerend gelabelde stammen

Deze methode gebruikt co-cultivatie van fluorescent gelabelde bacillus sutilis om de snelle klonale expansie en eliminatie van gunstige en schadelijke mutaties in een bacteriële celpopulatie in de loop van de tijd te monitoren. Eerst, bereid de pre-culturen van de bacteriën voor voor het competitie-experiment. Meng gelijke hoeveelheden van de fluorescent gelabelde stammen en cultiveer de bacteriën onder verschillende voedingsomstandigheden.

Verzamel vervolgens de monsters op verschillende tijdstippen, verdun ze op gepaste wijze en vermenigvuldig de cellen op agar platen. Bepaal nu en tel de overlevende stammen door stereofluorescentiemicroscopie. Uiteindelijk kunnen de resultaten het percentage van de overlevende bacteriën bepalen ten opzichte van het totale aantal getelde kolonies.

In tegenstelling tot het monitoren van intra-soort competitie met behulp van verschillende antibioticum re cassettes voor stamlabeling. In deze methode zijn fluorescent gelabelde concurrentiestammen bijna volledig isoton en in staat om op dezelfde AGA platen te brouwen. De pre-procedure zal worden gepresenteerd door Lorena, die een PhD-student in mijn lab is, inoculeer de vier milliliter LB-medium met een microliter bacteriën vanuit minus 80 graden Celsius, cryo-voorraden en laat de pre-culturen een nacht groeien bij 28 graden Celsius en 220 RPM verdun 0,1 milliliter cultuur in 0,9 milliliter LB-medium in een 1,5 milliliter vete en bepaal de optische dichtheid.

Vervolgens om gemengde celpopulaties voor de competitie-experimenten te verkrijgen, inoculeer 100 milliliter schudkolven bevattende 20 milliliter van CGLC en CGLC. Minimaal medium in een een-op-een verhouding, breng 10 milliliter van de culturen over naar 15 milliliter plastic buizen. Oogst de cellen door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 4.000 maal zwaartekracht en gooi het supernatant weg.

Resuspendeer vervolgens de cellen in 0,5 milliliter vers LB-medium en breng de cellen over naar een steriele 1,5 milliliter reactiebeker, voeg 0,5 milliliter van 50% steriele glycerol toe. Meng de suspensie door krachtig te vortexen en bewaar de monsters in een min 80 graden Celsius vriezer. Cultiveer vervolgens de resterende bacteriën in de schudkolven.

Bewaar de schudkolven in het donker om fotobleken van het florakrachtmonster te voorkomen, neem 0,1 milliliter van de culturen na zeven uur en 24 uur groei, meet en noteer de optische dichtheid van een tot 10 verdunning van de monsters, maak cryo-voorraden van de monsters om te bewaren bij min 80 graden Celsius. Na het verzamelen van alle monsters, ontdooi de cryo-voorraden en verdun de cellen in een 0,9% zoutoplossing voor elke stam. Plateer 0,1 milliliter van de 10 tot de negatieve vijfde verdunning op een SP-medium agarplaat en verdeel de cellen met behulp van een steriele glaspipet.

Incubeer de platen een nacht bij 37 graden Celsius in het donker tot er enkele kolonies verschijnen met een zwarte pen. Verdeel de bodem van de agarplaat in vier delen voor een betere oriëntatie tijdens het tellen van de overlevenden onder de stereofluorescentiemicroscoop. Plaats nu de plaat ondersteboven onder de microscoop en breng de kolonies scherp met behulp van de koude lichtbron.

Zodra de kolonies scherp staan, schakel naar de juiste filterset voor CFP Flora vier. Om de overlevende cellen van de CFP-gelabelde stam te visualiseren, tel de overlevenden van deze stam door de kolonies te labelen met een pen. En noteer het aantal.

Verwijder de labels met ethanol. Schakel vervolgens naar de YFP-filterset. Om de overlevende cellen van de YFP-gelabelde stam te visualiseren.

Tel de overlevenden opnieuw door de kolonies te labelen met een pen. En noteer het aantal. Open de foto's van een plek die zijn genomen met de CFP-filterset en de YFP-filterset.

Optimaliseer het contrast en de helderheid om eventuele achtergrondfluorescentie van het medium te verminderen. Ga naar een van de foto's en selecteer alles. Kopieer de foto en plak hem op de andere foto.

Smelt de foto's samen door in het laagmenu de optie lichtere kleur te selecteren. In dit experiment werden een celpopulatie bestaande uit twee BCI-stammen gelabeld met Fluor CFP en YFP om het effect van verschillende stikstofbronnen op de groei te evalueren door geschikte verdunning op agarplaten te plateren. De clonale samenstelling van een celpopulatie in de loop van de tijd kan nauwkeurig worden bepaald door simpelweg de gele en blauwe fluorescerende kolonies te tellen.

Glutamaatdehydrogenase-enzymactiviteit beïnvloedt de fitheid van otus sterk, afhankelijk van de beschikbaarheid van exogeen glutamaat. Bij afwezigheid van exogeen glutamaat is een hoge GDH-activiteit nadelig voor de bacteriën, omdat de enzymen G en B glutamaat afbreken dat nodig is voor anabolisme. Daarentegen is synthese van twee functionele gdh's voordelig voor de bacteriën wanneer exogeen glutamaat beschikbaar is, omdat naast G glucose glutamaat als koolstofbron wordt gebruikt.

Vergelijkbare resultaten werden verkregen in een die switch-experiment. Opnieuw werden bacteriën uitgerust met hoge GDH-activiteit uitgeconcurreerd door cellen met verminderde GDH-activiteit in groeimedia zonder glutamaat. Daarentegen werden bacteriën die slechts één actief GDH synthetiseerden uit de cultuur geëlimineerd.

Toen het medium werd aangevuld met glutamaat, bleef de initiële samenstelling van de gemengde celpopulatie duidelijk bijna constant over tijd. Ongeacht Fluor samengevat. Het gebruik van Flora Force is een krachtig hulpmiddel voor het monitoren van intra-soort competitie in een bacteriële celpopulatie zodra de concurrentiekrachten zijn gegenereerd.

Deze techniek kan in vijf dagen worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd.