Name: Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Leer fagosoomrijping en fagolysosoombiogenese in macrofagen visualiseren met fluorescent gelabelde dextranen en live-celbeeldvorming. Deze methode biedt kwantitatieve analyse met hoge temporele resolutie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de leden van de phagosome Biology Laboratory voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door een Helmholtz Young Investigator Grant (Initiative en Netwerken fondsen van de Helmholtz Association) en een Prioriteit Programma SPP1580 Grant van de Duitse Research Council (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).

<ol><li>Greenberg, S., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and innate immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li>
<li>Stuart, L., Ezekowitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Blander, J. M., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+regulation+of+phagosome+maturation+and+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">On regulation of phagosome maturation and antigen presentation.</a> Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+aging+gracefully%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: aging gracefully.</a> Biochem. J. 366, 689-704 (2002).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li>
<li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li>
<li>Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes%3A+fusion+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes: fusion and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Luzio, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-endosome+fusion+and+lysosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis.</a> J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).</li>
<li>Eissenberg, L., Goldman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+lysosomes+with+phagosomes+containing+Histoplasma+capsulatum%3A+use+of+fluoresceinated+dextran%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).</li>
<li>de Souza Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization%2C+phagolysosomal+biogenesis+and+killing+of+mycobacteria+in+enucleated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+sequential+delivery+of+fluorescent+lysosomal+probes+into+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).</li>
<li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+Fuse+with+Late+Endosomes+and%2For+Lysosomes+by+Extension+of+Membrane+Protrusions+along+Microtubules%3A+Role+of+Rab7+and+RILP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li>
<li>Huynh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAMP+proteins+are+required+for+fusion+of+lysosomes+with+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes.</a> EMBO J. 26, 313-324 (2007).</li>
<li>Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+mechanism+of+cargo+sorting+during+lysosome-phagosome+fusion+is+controlled+by+Rab34%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).</li>
<li>Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
<li>Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).</li>
<li>Hemmi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Toll-like+receptor+recognizes+bacterial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA.</a> Nature. 408, 740-745 (2000).</li>
<li>Underhill, D., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+key+mediators+of+microbe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).</li>
<li>Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I+and+class+III+phosphoinositide+3-kinases+are+required+for+actin+polymerization+that+propels+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes.</a> J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+receptor-ligand+interactions+modulate+gene+expression+and+phagosomal+properties+during+both+early+and+late+stages+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+phagosome+maturation+as+a+function+of+phagosome%2Flysosome+fusion+and+acquisition+of+hydrolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity.</a> Traffic. 6, 413-420 (2005).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126, 205-218 (2006).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+phagosome+maturation+through+the+real-time%2C+spectrofluorometric+measurement+of+hydrolytic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities.</a> Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).</li>
<li>Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+phagosomal+degradation+and+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).</li>
<li>Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Responds+to+Chloride+and+pH+as+Synergistic+Cues+to+the+Immune+Status+of+its+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).</li>
<li>Rogers, L., Foster, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).</li>
<li>Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pH%2C+ROS+production%2C+maturation%2C+and+degradation+in+dendritic+cell+phagosomes+using+cytofluorometry-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays.</a> Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In de volgende paragraaf zullen we bespreken kritische stappen van de gepresenteerde methode en zijn beperkingen. Verder zullen we verbinden een aantal van de meest voorkomende problemen met hun oplossingen, mogelijk wijzigingen aan te brengen en te overwegen de voordelen van onze methode alsmede geschikte complementaire methoden voor deze aanpak. De bereiding van de korrels, zoals de koppeling van IgG aan de korrel oppervlak is cruciaal en het gebruik van unfresh preparaten worden vermeden....

Professionele fagocyten, waaronder macrofagen, spelen een belangrijke in het immuunsysteem. Naast het feit dat de eerste lijn van defensie in het aangeboren immuunsysteem, ze een cruciale rol spelen bij de activering van de adaptieve immuniteit door hun signalering en antigeen-presenterende rol 1-3. Terwijl de functie van professionele fagocyten is veelzijdig, phagosome rijping is de kritische ruggengraat van de bacteriedodende en antigeenverwerking functie van de professionele fagocyten 4,5. Bij de receptor gemedieerde engulfment en opname van een fagocytaire doel, zoals bacteriën, de ontluikende phagosome gaat door een complexe en goed georkestreerde opeenvolging van interactie en uitwisseling met compartimenten van de endocytische netwerk en verscheidene andere celorganellen 6. De aard van de verbindingen uitgewisseld met deze cellulaire entiteiten evenals de verordening en de timing van de fusie gebeurtenissen bepaalt de luminale phagosomal milieu en de phagosomal membraansamenstelling en dus 7, het lot van de rijping phagosome 8. De fysiologische relevantie van phagosome rijping wordt geïllustreerd door de verschillende strategieën die door diverse intracellulaire pathogenen om te ontsnappen aan, arrestatie of ondermijnen phagosome rijping 9. De meeste strategieën rechtstreeks verhinderen de laatste en kritieke fase van phagosome rijpingsproces: de fusie van phagosome met late endosomale / lysosomale compartimenten, die hen begiftigt met het grootste deel van de hydrolytische enzymen en antibacteriële factoren van een volwassen phagosome 7 , 8,10. Analyse van deze laatste en cruciale stap daarom kan ons sterke indicatoren over de staat van rijping van de phagosomes en als de natuurlijke fysiologische toestand wordt positief of negatief beïnvloed onder de specifieke experimentele instellingen die worden gebruikt. De late endosomale / lysosomale compartiments worden algemeen beschouwd de terminal compartimenten van de endocytische route, bepaald en onderscheiden van de vroege endocytische compartimenten door de aanwezigheid van verschillende, fase specifieke marker moleculen. Bijvoorbeeld hydrolytische enzymen of membraan componenten zoals Lysosomal geassocieerd membraaneiwitten (lampen) onder anderen 11. De terminal endocytisch compartimenten-voortaan kortweg lysosomen-ook dienen als de belangrijkste locatie voor de laatste fasen van de spijsvertering aan het einde van de fagocytaire / endocytische route 12. Zo kan verteerbare sondes door endocytose en macropinocytose het extracellulaire milieu geladen en getransporteerd door de endocytische route naar lysosomen, waar het zich ophoopt 13,14 na na een bepaalde cyclus van opname en jacht. Fluorofoor geconjugeerde probes voor fluorescentiemicroscopie zoals organische verteerbare polymeer dextran worden vaak gebruikt als endocyticprobes 15-17. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In deze werkwijze beschrijven we het gebruik van IgG-beklede microkorrels als fagocytische lading phagosome rijping onderzocht door analyse van de afgifte van lysosomale luminale inhoud phagosomes. Door het gebruik van een fluorofoor-geconjugeerde dextran sonde als een gemakkelijk detecteerbare merker van lysosomen in levende beenmerg afgeleide macrofagen (BMM) en time-lapse video beeldvorming met een confocale laser scanning microscoop, volgen we het dynamische proces van lading levering in fagosomen met hoge temporele resolutie. Vervolgens beschrijven we hoe de verzamelde time-lapse imaging data kan worden geëvalueerd met behulp van de open-source en vrij beschikbare software voor beeldanalyse, Fiji (of ImageJ), statistisch geanalyseerd met behulp van Microsoft Excel en gepresenteerd met behulp van GraphPad Prism software 14,18. Na de beschrijving van onze werkwijze kunnen analoge experimenten ontworpen met gewijzigde instellingen factoren en hun invloed op phagosome rijping onderzoeken; vrijwel elke othaar type hechtende primaire of cellijn fagocytcellen, genetische verlies van functie experimenten, inclusief gen knock-out en knock-down, mutanten of expressie van fusie-eiwitten, fagocytaire-doelstellingen, microbead deklaagmengelingen, endosomale / lysosomale sondes en factoren zoals een cytokines, chemische inhibitoren of siRNA onder andere variabelen zijn die kunnen worden toegepast op de basisbenadering van deze methode. We definiëren het doel en de fundamentele eisen van deze methode als volgt: <ul type="disc"><li> Doel van de methode: de directe, kwantitatieve en kwalitatieve observatie en analyse van phagosome rijping met een hoge temporele resolutie in levende fagocytcellen schakelen. </li><li> Fagocytische lading: Een ter zake gecoat microdeeltjes of biologische doel. Hier gebruiken we IgG-coated 3 micrometer sferische polystyreen microdeeltjes die gemakkelijk worden geïnternaliseerd via de Fc-γ receptor gemedieerde fagocytose. Als alternatief kan elk micro-organisme of gecoat microparticle waarvoor fagocytische receptor aanwezig is op de cellen kan worden gebruikt. </li><li> Fagocyten: Hechtende fagocytische cellen die de juiste fagocytische receptoren. Hier gebruiken we de muis primaire BMMs die overvloedig de Fc-γ receptoren. Als alternatief zou dendritische cellen (DC), monocyten of fagocytaire epitheelcellen of hun genetische mutanten of knock-out varianten worden gebruikt. </li><li> Lysosomale lading: Een fluorescent gelabelde lysosomale probe. Hier is Texas Red-geconjugeerd 70.000 kiloDalton dextran (Dex70kD) als het luminale lading van de lysosomen. Als alternatief kan elk fluorescent detecteerbare merker of een cellulair compartiment of organel, of een geschikte probe voor phagosomal eigenschappen zoals zuurgraad of afbrekende capaciteit kan worden gebruikt om de progressie van phagosome rijping bestuderen. </li><li> Beïnvloedende factoren: bijvoorbeeld signaalmoleculen, chemische verbindingen, gen knock-down, of transiënte expressie van mutante eiwitten kon. Hier hebben we Förgeen het gebruik van een dergelijke factor voor de eenvoud maar een recent voorbeeld met mutant eiwitexpressie en neerhalen invloedsfactoren zie Kasmapour et al.. 18 Elke factor die invloed fagocytose of de omstandigheden en mobiliteit van phagosomes en / of de compartimenten die interageren met rijping phagosomes zou kunnen worden gebruikt. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM)</td><td>PAA, Oostenrijk</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium zonder fenol rood (D-MEM)</td><td>PAA, Oostenrijk</td><td>E15-047</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>PAA, Oostenrijk</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>PAA, Oostenrijk</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA, Oostenrijk</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>PAA, Oostenrijk</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>WillCo-dish&reg; Glasbodemschaal (35 mm &empty;, #1.5)</td><td>WillCo Wells, Nederland</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>CELLviewTM glasbodemschaal, 35 mm</td><td>Greiner Bio one, Duitsland</td><td>627871</td><td>Alternatief: Beschikbaar als gesegmenteerd</td></tr><tr><td>Carboxylerde latex microsferen</td><td>Polysciences, USA</td><td>#09850</td><td>Beschikbaar in verschillende diameters, we gebruikten 3 &mu;m</td></tr><tr><td>Polystyreen microdeeltjes</td><td>Kisker Biotech, Duitsland</td><td>PPs-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH, Duitsland</td><td>305.1.3</td><td></td></tr><tr><td>muis geheel IgG</td><td>Rockland, USA</td><td>010-0102</td><td></td></tr><tr><td>EDAC crosslinker</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E6383-1g</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris</td><td>Sigma-Aldrich,USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1-ml spuit Omnifix -F</td><td>B.Braun, Duitsland</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>26&nbsp;G naald (0.45*25 mm)</td><td>B.Baun, Duitsland</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA, Oostenrijk</td><td>E15-039</td><td></td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td>Gibco, USA</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu;M spuit gemonteerde filter</td><td>Sartorius, Duitsland</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr></tbody></table>

studie van fagolysosoom biogenesis live macrofagen

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Fagocyterende cellen spelen een belangrijke rol in het aangeboren immuunsysteem door het verwijderen en het elimineren van binnendringende micro-organismen in hun fagosomen. Phagosome rijping is de complexe en strak gereguleerd proces waarbij een ontluikende phagosome ondergaat drastische transformatie door middel van goed georkestreerde interacties met verschillende cellulaire organellen en compartimenten in het cytoplasma. Dit proces, dat essentieel is voor de fysiologische functie van fagocyten door begiftigt phagosomes hun lytische en bactericide eigenschappen, afgesloten met fusie van phagosomes met lysosomen en biogenese van phagolysosomes die wordt beschouwd als de laatste en kritieke fase van rijping voor phagosomes zijn. In dit rapport beschrijven we een live cell imaging gebaseerde methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van het dynamische proces van lysosoom om content delivery, dat is een kenmerk van fagolysosoom biogenese phagosome. Deze aanpak maakt gebruik van IgG-gecoate microbolletjes als model voor phagocytosis en fluorofoor-geconjugeerde dextran moleculen als een luminale lysosomale lading sonde, om de dynamische levering van lysosmal inhoud aan de phagosomes in real time in levende macrofagen te volgen met behulp van time-lapse imaging en confocale laser scanning microscopie. Hier beschrijven we in detail de achtergrond, de voorbereidende stappen en stap-voor-stap experimentele opstelling gemakkelijke en nauwkeurige plaatsing van deze methode in andere laboratoria mogelijk. De beschreven werkwijze is eenvoudig, robuust, en vooral kan gemakkelijk worden aangepast aan phagosomal interacties en rijping bestuderen verschillende systemen en onder verschillende experimentele opstellingen zoals het gebruik van verschillende typen fagocytische cellen, verlies-van-functie experimenten verschillende probes en fagocytische deeltjes.

De juiste bereiding van de cellen en kralen voor beeldvorming is kritisch. Figuur 1 toont de omtrek van het zaaien, probe-laden en eerste beeldvormende stappen in deze methode, gebaseerd op onze geoptimaliseerde protocol BMMs. Het is derhalve van belang dat het protocol parameters worden getest en geoptimaliseerd, afhankelijk van het type cellen en probes die worden gebruikt. Na toevoeging van de met IgG beladen kralen om de voorgeladen cellen, is het belangrijk dat het gezi...

Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om het dynamische proces van fagosoomsrijping en fagolysosoombiogenese in fagocyten in real-time vast te leggen. Dit wordt bereikt door de lysosomale compartimenten van de cellen te laden met fluorescent geconjugeerde dex-strengs, om de visualisatie van lysosomale compartimenten en de overdracht van de luminale lading naar fagosomen mogelijk te maken. In een tweede stap worden micropartikels toegevoegd, die dienen als fagocytisch model.Vervolgens wordt de levering van lysosomaal materiaal aan de fagosomen geanalyseerd met behulp van live-cell imaging en daaropvolgende digitale beeldbewerking. Om het rijpingsproces van de fagosomen te kwantificeren, tonen de resultaten het effect van verschillende factoren op het rijpingsproces van fagosomen op basis van de levering van lysosomale inhoud aan de fagosomen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de evaluatie van macrofaagrijping in gefixeerde cellen, is de kwantitatieve uitlezing met een hoge temporele resolutie. Begin met het oplossen van Texas red-gelabelde 70 kilodalton Dextran of Dex 70 KD in PBS tot een concentratie van 20 mg/mL en bewaar aliquoten bij -20 °C.Verdun vervolgens de Dex 70 KD-stamoplossing in compleet celkweek-Docos, modified eagles medium of DMEM tot ongeveer 1 mg/mL. Sonicate de DExT-strengaliquot in een ultrasoon bad gedurende vijf minuten. Centrifugeer de oplossing vervolgens in een microcentrifuge op maximale snelheid gedurende vijf minuten om eventuele klontjes of verontreinigingen uit de oplossing te verwijderen.Verplaats de SuperAgent voorzichtig naar een schone buis, waarbij het pellet aan de bodem wordt vermeden. Verdun de oplossing vervolgens tot een uiteindelijke werkconcentratie van 20 µg/mL in compleet cellenkweek-DMEM en filter deze.Steriliseer de oplossing via een gemonteerd spuitfilter van 0,22 micrometer. Voeg vervolgens twee milliliter uit het beenmerg afgeleide muismacrofagen toe tot een concentratie van 5 × 10⁴ cellen per milliliter. Incubeer de cellen in DMEM in een ongecoate schaal met glazen bodem gedurende ten minste 12 uur bij 37 °C in een met 5% CO2 gebufferde atmosfeer.Om de aanhechting en acclimatisatie na aanhechting te waarborgen, wordt het medium geaspireerd en worden twee milliliters voorverwarmd DExT strand DMEM aan de glazen bodemschaal toegevoegd, waarna de cellen gedurende twee tot acht uur worden geïncubeerd. Was de cellen drie keer met voorverwarmd compleet DMEM. Aspireer het medium na de laatste spoeling en voeg twee milliliters compleet DMEM toe.Incubeer de cellen gedurende vier tot 12 uur. Spoel de cellen vervolgens met voorverwarmd DMEM compleet zonder fenolrood en voeg minstens 30 minuten voor aanvang van de beeldvorming twee milliliter gefilterd DMEM compleet zonder fenolrood toe. Breng daarna een aliquot van 1% IgG-gecoate kraal-suspensie, bereid zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, naar kamertemperatuur.Sonicate de oplossing in een ultrasoon waterbad gedurende twee tot drie minuten. Voeg vervolgens, onder een biosafety cabinet klasse II, één tot zes µL van de kraalsuspensie toe aan de cellen. Diffundeer de dichte wolk kralen door de suspensie in de glazen bodemschaal voorzichtig te mengen met een pipet.Breng het monster vervolgens naar de microscoop en stel scherp op het gebied van interesse. Optimaliseer voorafgaand aan de time-lapse imaging de instellingen, waaronder scanning, snelheid, vergroting en resolutie, om in staat te zijn elke 7 tot 20 seconden één frame vast te leggen.Pas de instellingen voor excitatie en emissie aan op basis van het gebruikte beeldvormingssysteem en de probes, en optimaliseer deze instellingen om overmatige fotobleking te voorkomen. Neem vervolgens de time-lapse video op en sla deze op in het oorspronkelijke bestandsformaat van uw microscoop. Vermijd het exporteren van de video in gecomprimeerde formaten zoals JPG of PNG.Start vervolgens Fiji en de Image J-distributie, die een pakket voor beeldverwerking bevat met gereorganiseerde toolmenu's en aanvullende native plug-ins die gratis beschikbaar zijn. Downloaden. Open het bestand in Fiji en selecteer de video die geëvalueerd moet worden. Stel vervolgens de opties, filters en meetparameters in zoals gedetailleerd in het bijbehorende tekstprotocol.Scan vervolgens door de beelden en noteer het frame waarin een volledig gevormd nascent bead phagosome is ontstaan en de F zure cup is gesloten. Gebruik het Ovaal-selectiehulpmiddel om een circulair interessegebied of ROI te selecteren op de geïnternaliseerde bead. Zorg ervoor dat de selectie nauw aansluit op de buitenrand van de bead.Ga vervolgens naar 'analyze' en klik op 'measure' om de meting uit te voeren. Het resultaat wordt weergegeven in een apart venster met de titel 'results'. Pas bij het volgende frame van belang de positie van de ROI aan als het kraaltje is verschoven en herhaal de meting, waarna deze aan de lijst in het resultatenvenster wordt toegevoegd.Elk geanalyseerd frame kan worden geïdentificeerd op basis van de waarde in de labelkolom. Nadat de meting van alle relevante frames is voltooid, kopieert u de waarden uit de kolom int den naar een spreadsheetapplicatie. De kolom int den geeft de intensiteiten van het geselecteerde gebied weer.Met behulp van deze methoden werden heldere beelden vastgelegd van uit het beenmerg afgeleide macrofagen die waren geladen met de DExT-strengsondes. Dit beeld is van tijdstip nul, precies op het moment dat de cel de opname van de IgG-gecodeerde kraal, hier aangegeven, had voltooid. De getoonde beelden zijn pseudogekleurd voor een betere zichtbaarheid en beelden het fagosoom van nul tot 85 minuten na opname.Het gemeten fagosoom, ROI, is omlijnd met de stippellijn en de instanties van dextraan-afgifte en -accumulatie in het fagosoom worden aangewezen door de pijlen. Er zijn vervolgens grafieken gegenereerd vanuit deze beelden, die een duidelijke temporele trend laten zien van de signaalassociatie met het fagosoom over de tijd. Deze grafiek vertegenwoordigt een gemiddelde van 10 fagosomen uit de twee hier getoonde cellen.Hoewel de absolute signaalintensiteit vaak varieert tussen de geanalyseerde fagosomen, is de temporele trend gewoonlijk zeer vergelijkbaar. Bij de afgifte van Dex 70 KD aan de fagosomen werd binnen 35 tot 40 minuten na fagocytose een plateau bereikt. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe de rijping van fagosomen kan worden geëvalueerd met behulp van time-lapse confocale microscopie.

study-of-phagolysosome-biogenesis-in-live-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

This video demonstrates a high-resolution total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy technique for real-time visualization of phagosome formation and closure during macrophage-mediated phagocytosis of IgG-opsonized red blood cells (RBCs) attached to the surface of a glass bottom dish. The macrophages extend pseudopodia around the RBCs and engulf them inside the phagosomes, detaching them from the glass surface.

TIRF Microscopy-Based Visualization of Phagosome Formation and Closure

We beschrijven werkwijzen voor levende cellen videomicroscopie...

Live-cel Video Microscopie van pathogene schimmel Fagocytose

We beschrijven een experimentele opstelling om fagosoombevorming en -afsluiting in drie dimensies in levende macrofagen met ongekend hoge resolutie te visualiseren, met behulp van total internal reflection fluorescentiemicroscopie. Het maakt het mogelijk om de basis van de fagocytische cup, de uitbreidende pseudopoden, evenals de precieze plaats van fagosooombaan te monitoren.

&quot;Phagosome Closure Assay&quot; naar phagosome Formatie Visualiseer in drie dimensies behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM)

We beschrijven een methode om de snelheid van fagosomen te meten die zich in levende cellen, geïnfecteerd met of zonder het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) type 1, naar het centrum van de cel bewegen, met behulp van spinning disk confocale fluorescentiemicroscopie om gefluorescerende geïnfecteerde cellen te identificeren en helder veld microscopie om fagosomen te detecteren.

Phagosome Migratie en Velocity Gemeten Live primaire humane macrofagen geïnfecteerd met HIV-1

Hier beschrijven we een microscoopgebaseerde techniek om de vroege cascades van gebeurtenissen tijdens fagocytose van pathogenen zoals de schimmels Candida albicans en deeltjes die groter zijn dan 0,5 µm, waaronder zymosan en IgG-gecoate kralen, te visualiseren en te kwantificeren.

Het visualiseren van de vroege stadia van Phagocytosis

We presenteren de methoden voor de beoordeling van de fagocytische capaciteit van primaire lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen met behulp van fluorescently geëtiketteerde myeline puin en intracellulaire lipide druppel kleuring.

In Vitro Fagocytose van myeline puin door macrofagen beenmerg-afgeleide

We beschrijven hier een eenvoudige en snelle methode voor de isolatie van Salmonella typhimurium-phagosomes van macrofagen bevattende coating van de bacteriën met biotine en daar.

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Hier beschrijven we methoden draaiende schijf confocale microscopie afbeelding één fagocytische gebeurtenissen via muis resident peritoneale macrofagen. De protocollen kunnen worden uitgebreid tot andere fagocytische cellen.

Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

Het mechanisme geassocieerd met fagocytose bij Leishmania-infectie blijft slecht begrepen. Hier beschrijven we methoden om de vroege gebeurtenissen te evalueren die plaatsvinden tijdens leishmania-interactie met de gastheercellen.

Onderzoek naar de fagocytose van Leishmania met behulp van confocale microscopie

Deze studie verheldert de fagocytische verwerking van Godanti Bhasma (GB) deeltjes in zoogdiercellen, waarbij hun cellulaire opname, vacuoledynamiek, verzuring en afbraak worden gekarakteriseerd. Deze bevindingen vergroten niet alleen ons begrip van fundamentele fagocytosemechanismen, maar vestigen GB ook als een veelbelovend modelsysteem voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën.

Onderzoek naar de sequentiële cellulaire gebeurtenissen van fagocytose veroorzaakt door Godanti Bhasma in zoogdiercellen

Leer fagosoomrijping en fagolysosoombiogenese in macrofagen visualiseren met fluorescent gelabelde dextranen en live-celbeeldvorming. Deze methode biedt kwantitatieve analyse met hoge temporele resolutie.

Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen

Meer video's verkennen