Optimalisatie en het gebruik van Agrobacterium-Gemedieerde Transient eiwitproductie in Nicotiana

Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige, efficiënte en schaalbare methode te ontwikkelen voor de productie van recombinante eiwitten in een plantensysteem met behulp van de agro-infiltratietechniek. Dit wordt bereikt door eerst de plantengroeiomstandigheden te optimaliseren. De tweede stap is het transformeren van agrobacterium met lanceringsvectoren die componenten van plantenvirussen en binaire plasmiden combineren, gevolgd door het kweken van het getransformeerde agrobacterium voor gebruik in de agro-experimenten.

Tijdens de agrobacterium-infiltratie worden de planten op hun kop gedraaid en worden de bovengrondse delen ondergedompeld in een agrobacterium-suspensie. Vervolgens wordt een vacuüm toegepast waardoor lucht wordt verwijderd uit de intercellulaire ruimtes in de bladweefsels. Door St Rapid herpersing na het vrijgeven van het vacuüm, resulteert dit in de infusie van de agrobacterium-suspensie in de bladeren.

Uiteindelijk worden immunoblotting en fluorescentie-assays gebruikt om recombinante eiwitfabriek in de geïnfiltreerde planten aan te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals handmatige infiltratie, is dat de vacuüminfiltratiemethode kan worden opgeschaald voor industriële productie van recombinante eiwitten, inclusief vaccins en therapeutische eiwitten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in de plantenbiotechnologie en verder de gebruik van planten als alternatief platform voor commerciële recombinante eiwitproductie vergemakkelijken.

We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we ontdekten dat het opschalen van agro-filtratie in groeiende planten in de grond een uitdaging is. Om verschillende redenen bevat de grond uchi's zoals virussen, bacteriën, nematoden, en bovendien variëren de grondinhoud en irrigatiewater van batch tot batch en van seizoen tot seizoen, en de grond eieren na verloop van tijd in opslag. Bovendien zou het omdraaien van planten die in de grond groeien, resulteren in ongewenst druppelen van grond in de agrobacterium-cultuur tijdens de infiltratie.

Deze procedure wordt gedemonstreerd door Rebecca Snow, een senior onderzoeksassistent van het plantenbiologie- en engineeringlaboratorium, en Emma Gut Robin Lobe. Zij en Adam Trevor, die onderzoeksassistent zijn van mijn laboratorium. Deze studie gebruikt hydrocultuurplantengroeimedium en voedingsoplossing om uniformiteit van plantengroei te garanderen en om complexiteiten te elimineren die gepaard gaan met het gebruik van grond voor plantenteelt.

Om deze procedure te beginnen, laat je rotswolblokken vijf minuten weken in een plantenmeststofoplossing, zaai je handmatig zaden op het voedingsstoffendoorweekte rotswoloppervlak. In deze studie worden de Cedar drie Nico Oceana-soorten geëvalueerd, twee wilde typesoorten, Nico Oceana, Benham Ana en Nico Oceana Excelsior, en een hybride van Benham, Ana en Excelsior genaamd Nico Oceana. Excela laat planten groeien uit de zaden onder gecontroleerde omstandigheden en een lange dagfotoperiode in een hydrocultuur-cascadesysteem groeien.

Nico Oceana, Bentham Miana en Nico Oceana Excela gedurende vier tot vijf weken, en Nico Oceana Excelsior gedurende vijf tot zes weken. De Agrobacterium tumor Fasion-stammen die in dit experiment worden gebruikt, zijn getransformeerd met de juiste lanceringsvectoren zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Voor de doeleinden van deze demonstratie worden vijf getransformeerde agrobacterium-stammen gebruikt.

GV 3 1 0 1, dragend een reportergroen fluorescent eiwit, of GFP-gen GV 3 1 0 1, dragend het virale gen van de silencing suppressor van de tomaten bossige dwergziekte P 19 en A vier GV 3 1 0 1, en een T 10. Dragend het gen van een dragereiwit gemodificeerde liase of lick KM groei agrobacteriumstammen een nacht in LB-medium, aangevuld met 50 milligram per liter can mycine bij 28 graden Celsius met schudden bij 200 tot 250 RPM op de volgende dag. Bereid agrobacterium-suspensies voor de gewenste experimenten om de haalbaarheid van het gebruik van meerdere agrobacterium-stammen voor transiente eiwitproductie te onderzoeken, verdun een laboratoriumstam en twee wilde typestammen, die de PBI vier lick km-vector bevatten in milli Q-water tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,5.

Om de noodzaak van het induceren van agrobacterium-virulentiegenen vóór infiltratie te onderzoeken, centrifugeer eerst agrobacterium-culturen die de P bid 4G FP-vector dragen, gegroeid in LB-medium bij 4.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Hersuspendeer vervolgens in MMA-inductiemedium tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,5 en roer gedurende twee uur bij kamertemperatuur om te testen of acetyl coon transiente eiwitproductie verbetert. Centrifugeer en agrobacterium-cultuur. Dragend de PBI 4G FP-vector gegroeid een nacht in LB-medium en hersuspendeerd in infiltratiebuffer met een X ms-zout 10 millimolair, MES en 2% glucose.

Verdeel de celsuspensie in vier containers. Voeg een verschillende concentratie aceto coon toe aan elk van de agrobacterium-suspensies en incubeer gedurende drie uur bij kamertemperatuur. Om het effect van co-infiltratie van een virale silencing suppressor op transient GFP-eiwitproductie te testen, mix.

Een milli Q-water verdunde agrobacterium-cultuur die het GFP-gen draagt en een cultuur die de virale silencing suppressor P 19 draagt in een vier-op-één-verhouding. Tijdens de vacuüminfiltratie van planten, die zal worden gedemonstreerd. Vervolgens is het kritisch om de vacuümdruk en de duur van de infiltratie te beheersen om planten onder vacuüm te infiltreren. Breng eerst de bereide agrobacterium-suspensie over in een container in de vacuümkamer.

Keer vervolgens de plant op zijn kop in de verdunde agrobacterium en breng een vacuüm van 50 tot 400 millibar aan gedurende 30 of 60 seconden. De optimale infiltratie wordt routinematig toegepast bij 50 tot 100 millibar gedurende 60 seconden. Zodra het vacuüm is gebroken, verwijder de planten uit de vacuümkamer, spoel ze af in water en laat ze vijf tot zeven dagen groeien onder dezelfde groeiomstandigheden die voorafgaand aan de filtratiegroei zijn gebruikt.

Om monsters voor Western-analyse voor te bereiden, verzamel eerst willekeurige bladmonsters van Nico Oceana, Benham Miana