Name: Optimalisatie en het gebruik van Agrobacterium-Gemedieerde Transient eiwitproductie in Nicotiana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: Leer een geoptimaliseerde methode voor transiënte eiwitproductie in Nicotiana met Agrobacterium-vacuüminfiltratie. Deze techniek maakt schaalbare productie van vaccinantigenen en therapeutische eiwitten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door Fraunhofer USA Centrum voor Moleculaire Biotechnologie, iBio, Inc en de Defense Advanced Research Projects Agency (subsidie ​​# HDTRA1-07-C-0054). De auteurs erkennen de gulle giften door Drs. Stanton Gelvin of Biological Science Dept, Purdue University (Agrobacterium tumefaciens stammen) en Wayne Fitzmaurice van Large Scale Biologie Corp (N. excelsiana zaden), evenals Jennifer Nicholson van de Amerikaanse Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior zaden ). De auteurs danken Margaret Shillingford en Christopher Hull voor het leveren van planten en uitstekende technische bijstand. De auteurs danken ook Drs. Stephen Streatfield en Natasha Kushnir voor redactionele ondersteuning.

1. Plant Growing Voor de daaropvolgende agroinfiltration evalueerden we twee wild-type Nicotiana soorten (N. benthamiana en N. excelsior) en een hybride (N. excelsiana) hydrocultuur geteeld op steenwol in indoor faciliteiten. <ol><li> Geniet steenwol in een plantenvoeding oplossing. </li><li> Zaaien van wild-type N. benthamiana, N. excelsior en N. excelsiana (hybride van N. benthamiana × N. excelsior) op de voedingsstoffen doorweekt steenwol oppervlak. </li><li> Kweek planten van de zaden onder gecontroleerde omstandigheden (24 ° C en 40-65% relatieve vochtigheid) en een lange-dag lichtperiode (14 uur licht en 10 uur donker met verlichting van 130-150 uE m -2 s -1) voor 4-5 weken voor N. benthamiana en N. excelsiana, en 5-6 weken voor N. excelsior. </li></ol> 2. Constructie van vectoren voor Agroinfiltration <ol><li> Plaats een synthetisch reporter gen (green fluorescent protein [GFP]), full-length hemagglutinine (HA) van de A/California/04/2009 stam van het griepvirus (HAC1), en opnieuw ontworpen lichenase enzym (LicKM) 18 afzonderlijk in de lancering vector pBID4 18 (TMV-gebaseerde vector) naar pBID4-GFP, pBID4-HAC1 en pBID4-LicKM respectievelijk 18,32,41,47 verkrijgen. </li><li> Introduceer 10-50 ng pBID4 dragen GFP of HAC1 in elektrocompetente cellen van A. tumefaciens stam GV3101 en LicKM in elektrocompetente cellen van A. tumefaciens stammen GV3101, C58C1, GLA4404, AT06, AT10, At77 en A4 met het gen MicroPulser electroporator. </li><li> Gebruik de getransformeerde Agrobacteria voor infiltratie experimenten, tenzij anders vermeld. </li></ol> 3. Vacuüminfiltratie van Agrobacterium in Nicotiana Planten <ol><li> Grow A. tumefaciens stammen overnachting (O / N) in LB-medium, YEB medium of AB medium aangevuld met 50 mg / l kanamycine bij 28 ° C onder schudden bij 200-250 tpm. </li><li> Verdun Agrobacteria in Milli-Q water tot een optische dichtheid bij 600 nm (600 A) van 0,5 of centrifuge Agrobacterium cellen gekweekt in LB of YEB of AB bij 4000 × g gedurende 10 min bij 4 ° C, resuspendeer in inductiemedium (1x MS zout, 10 mM MES, 200 pM acetosyringoon, 2% sucrose [MMA]) A 600 0,5, en roer bij kamertemperatuur gedurende 1-3 hr, tenzij anders vermeld. </li><li> Infiltreren planten in een vacuümkamer door onderdompeling Nicotiana centrale lucht weefsels in Agrobacterium suspensie en toepassen van een 50-400 mbar vacuüm gedurende 30 of 60 seconden. De optimale infiltratie wordt routinematig toegepast bij 50-100 mbar gedurende 60 sec. </li><li> Zodra het vacuum verbroken kunt u planten uit de vacuümkamer, spoel met water en groeien gedurende 5-7 dagen onder dezelfde groeiomstandigheden voor pre-infiltratie groei. </li><li> Om de werkzaamheid te testenchemische inducerende Agrobacterium vir genen, verschillende concentraties van acetosyringoon (0, 100, 200 of 400 uM) toegevoegd aan de Agrobacteria gesuspendeerd in infiltratie buffer (1x MS, 10 mM MES, 2% glucose). Voor het effect van monosaccharide op inductie van vir gen verschillende percentages van glucose (0, 1, 2 of 4%) werden toegevoegd aan Agrobacteria gesuspendeerd in de infiltratie buffer (1x MS, 10 mM MES, 200 pM acetosyringoon). N. benthamiana planten werden geïnfiltreerd zoals vermeld in stappen 3.3 en 3.4). </li><li> Agrobacterium laboratorium stammen GV3101, C58C1 en LBA4404 en wild-type stammen A4, AT06, AT10, en At77 herbergen de pBID4-LicKM vector werden verdund in Milli-Q water tot A 600 van 0.5. N. benthamiana planten werden geïnfiltreerd met elke bepaalde stam zoals vermeld in stappen 3.3 en 3.4. </li></ol> 4. Co-agroinfiltration Procedure voor de Viral silencing Suppressor <ol><li> Mix het Milli-Q-water verdund Agrobacterium GV3101 culturen die het GFP-gen en de virale zwijgen suppressor p19 van Tomato borstelige stunt virus (TBSV) op 01:01, 02:01, 03:01 en 04:01 ratio. Infiltreren N. benthamiana planten zoals hierboven beschreven. </li><li> Infiltreren N. benthamiana planten met een mengsel van twee Milli-Q-water verdund Agrobacterium GV3101 culturen: de eerste die de pBID4-HAC1 plasmide en de tweede met slechts een van de silencing onderdrukkers - p19 van TBSV of p23 van Citrus tristeza virus, in de pCassp plasmide ( pCassp19) en de PGR binaire plasmide onder de 35S-promoter (PGR-P23), respectievelijk, in een verhouding 04:01. </li></ol> 5. Western Blot analyse <ol><li> Verzamel willekeurig blad monsters van N. benthamiana, N. excelsior of N. excelsiana planten op 4-7 dpi en verpulveren in vloeibare stikstof tot een fijn poeder. </li><li> Voeg drie delen van 1x PBS buffer met 0,5% TritonX-100 aan elk monster. </li><li> Schud de geëxtraheerde monsters gedurende 15 minuten bij 4 ° C. </li><li> Draai het extract gedurende 5 minuten en verzamel totaal oplosbaar eiwit in een schone Eppendorf buis. </li><li> Verdun de extracten een geschikte verdunning (1:50 1:100) in 1x PBS extractiebuffer en voeg 5 x sample buffer (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% SDS, 0,5% broomfenolblauw, 50% glycerol v / v en 500 mM DTT) tot een uiteindelijke concentratie van 1 ×. </li><li> Kook monsters gedurende 5 minuten. </li><li> Afzonderlijke eiwitten door 10% SDS-PAGE, overdracht op Immobilon-P transfermembraan en blokkeren met 0,5% I-blok. </li><li> Detecteren GFP met konijnen polyklonaal anti-GFP-antiserum bij 1:5000 en HAC1 met muizen anti-poly-histidine monoklonaal antilichaam bij 1:1000 in blokkerende oplossing gedurende 1 uur. </li><li> Na primaire antilichaam labeling, was de membranen driemaal gedurende 10 min elk 1 x 20-PBST en geïncubeerd met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd anti-konijn antilichaam bij 1:5000 of een HRP-conjugaatd anti-muis antilichaam bij 1:10.000 1 uur voor GFP en HAC1 detectie respectievelijk. </li><li> Verwerk Western blots met behulp van de SuperSignal West Pico chemiluminescentiesubstraat. </li><li> Gebruik de GeneTools Software om band intensiteit van het eiwit te analyseren en het verkrijgen van de band gekalibreerde hoeveelheid. </li></ol> Eiwitproductie: (Calibrated hoeveelheid x verdunning van monster) / hoeveelheid monster geladen) x = 4 mg / kg. Vergelijking: Eiwit productie (P), gekalibreerd hoeveelheid (C), verdunning van het monster (D) en de hoeveelheid monster geladen (S). 6. Zymogram Assay <ol><li> Verzamel pBID4-LicKM-geïnfiltreerd N. benthamiana willekeurige weefselmonsters. </li><li> Extraheer eiwitten met dezelfde werkwijzen die hierboven beschreven voor Western blot-analyse en vervolgens analyseren met 10% SDS-PAGE met 0,1% lichenan in de gels. </li><li> Na elektroforese was de gel tweemaal gedurende 10 min elk in wasbuffer (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] en 0,1% Triton X-100) En vervolgens geïncubeerd in wasbuffer bij 65 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Na incubatie gooi de wasbuffer en vlekken op de gels met 0,5% Congo Red gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Spoel de gels in Milli-Q water drie keer voor 10 minuten elk, en voeg 1 M NaCl tot lichenase activiteit te visualiseren. De gezuiverde bacteriële lichenase eiwit werd gebruikt als een positieve controle voor enzymactiviteit. </li></ol> 7. GFP Imaging <ol><li> Voer een visuele detectie van GFP-fluorescentie geheel transiënt getransformeerde planten met een handbediende lange-golflengte UV-lamp. </li><li> Foto transient getransformeerde planten met een digitale camera door middel van een gele 8, ES 52 filter (belichtingstijd, 15 sec). </li><li> Verkrijgen beelden van Western blot analyses met behulp van de GeneSnap software op een GeneGnome en kwantificeren van de resultaten met behulp van de GeneTools software, met een kalibratiecurve gebaseerd op gezuiverde GFP standaard. </li><li> Kwantificeren HAC1 eiwit met behulp van een ijklijn op basis van zuiveringed HAC eiwit norm uit de A/Indonesia/05/05 stam van het griepvirus. </li><li> Bereken de gemiddelde waarden 3-4 repliceert voor alle experimenten. </li></ol>

We hebben niets te onthullen.

In deze studie hebben we een eenvoudige agroinfiltration protocol voor alleen tijdelijke eiwitproductie in bepaalde soorten Nicotiana middels Agrobacterium stammen die de lancering vector ontwikkeld. Bovendien hebben wij de optimale omstandigheden die de hoogste recombinante eiwitproductie niveau onze transiënte fabriek expressiesysteem bereiken. Vacuüm infiltratie van de verdunde A. tumefaciens stam GV3101 herbergt de lancering vector pBID4 in N. benthamiana, N. excelsiana en N. excelsior resulteerde in hogere niveaus van target eiwitproductie binnen 7 dpi vergelijking met andere plantensoorten, zoals Pisum sativum geïnfiltreerd met GV3101 herbergen Alfalfa mosaic virus - of komkommer mozaïek-virus gebaseerde vectoren die de GFP reporter gen onder de 35S-promotor 41, of Lactuca sativa, Solanum Lycopersicum en Arabidopsis thaliana geïnfiltreerd met de C58C1 stam van A. tumefaciens die de beta-glucuronidase reportergen 57. N. benthamiana en N. excelsiana waren gemakkelijk te stofzuigen infiltreren bij 50 mbar gedurende 30-60 sec, met 90-95% infiltratie efficiëntie. De resterende 5-10% bladoppervlak niet geïnfiltreerd vanwege een drijvende bladeren op het oppervlak van de Agrobacterium-suspensie tijdens het aanbrengen van het vacuüm. Sinds de introductie vector heeft de mogelijkheid voor cel-tot-cel beweging 18, voorbijgaande proteïne ophoping in hele bladeren en bladstelen 7 dpi. Bij 10 dpi, de geschatte GFP productie iets lager omdat pBID4 expressievector kan bewegen van cel naar cel, maar niet systemisch 18 bewegen; daarom, pas gegroeide bladeren niet de vector bevatten en niet bijdragen tot de productie van het doel. Bovendien degradatie van het recombinante eiwit tijd may dragen bij aan lagere niveau eiwit op 10 dpi. Onze resultaten toonden dat infiltratie van A. tumefaciens stam GV3101 gemedieerde hoge niveaus van voorbijgaande eiwitproductie in N. benthamiana. Verder kan doeleiwit worden gemanipuleerd als N-eindstandige, C-eindstandige of interne fusies aan lichenase (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glucanase, een thermostabiel enzym van Clostridium thermocellum en verleent thermostabiliteit vele doelwit eiwitfusie 18. Infiltratie van N. benthamiana met A. tumefaciens wild-type stammen (at6, AT10 en at77) herbergt het gen van interesse opgewekt milde of ernstige symptomen: blad curling, bladsteel rek, en curling. Geen pathologische symptomen waargenomen bij N. benthamiana geïnfiltreerd met het laboratorium stam GV3101 herbergen leeg pBID4 vector, terwijl sommige genen ingebracht in pBID4 en omgetoverd tot laboratorium stammen GV3101, C58C1 of LBA4404 uitgelokt milde necrotische reacties en bladchlorose / vergeling symptomen bij geïnfiltreerd regio&#39;s van bladeren. Necrotische symptomen veroorzaakt door wild-type Agrobacterium of ontwapend stammen in nachtschadeachtigen planten zijn eerder 56,57 gerapporteerd. De necrotische reactie kan resulteren uit virulentiefactoren van type III secretie systeem, bacteriële eiwitten overgebracht naar de plantencel door het Type IV secretie systeem, en / of gevoeligheid voor flagelline 58-60. Wij hebben gevonden dat transiënte productie van heterologe eiwitten ook kunnen opwekken pathogeniteit en een overgevoelige reactie in geïnfiltreerde bladeren. Veel onderzoekers rapporteerden dat agroinfiltration van verschillende plantensoorten met plant binaire vectoren geproduceerd tot 5-20 maal hogere niveaus van voorbijgaande eiwitproductie ten opzichte van stabiel getransformeerde planten 28,57. Onze gegevens tonen aan dat N. benthamiana geïnfiltreerd met GV3101 herbergen pBID4-GFP transiënt tot expressie hoge niveaus van GFP, die vergelijkbaar is met de GFP opbrengst gerapporteerdN. benthamiana geïnfiltreerd met Agrobacterium die de Pich-GFPSYS virale vector (tot 80% van de totale oplosbare eiwit) 44. Agroinfiltration gebruik van onze lancering vector resulteerde in hoge productie van de thermostabiele eiwit LicKM, 50-maal hoger dan deze waargenomen met behulp van een standaard binair plasmide 18. Om de besmettelijkheid van A. testen tumefaciens en de stabiliteit van de lancering vector, we geïnfiltreerd een flat van N. benthamiana elk uur voor maximaal 8 uur met dezelfde Milli-Q-water verdund cultuur van GV3101 herbergen de pBID4-GFP plasmide. Onze gegevens laten zien dat de GV3101 stam efficiënt is besmettelijk gedurende minstens 8 uur en pBID4 (de lancering vector) is zeer stabiel tijdens de 8 uur durende infiltratie. Glycerol voorraad van GV3101 stam die de lancering vector pBID4-HAC1 (cel bank) bewaard bij -80 ° C is aangetoond dat het zeer stabiel te zijn gedurende drie jaar zonder veranderingen in voorbijgaande protevan de productie in geïnfiltreerd planten. N. benthamiana planten onder optimale condities en tussen 35 en 42 dagen na het zaaien gegroeid waren optimaal voor vacuüm-infiltratie gemedieerde transiënte genexpressie 40. Jongere planten (3-4 weken oud) niet volledig worden geïnfiltreerd door bladeren drijvend op de celsuspensie oppervlak en weefselschade door de mechanische werking van een vacuüm. In planten die ouder zijn dan 45 dagen, N. benthamiana builen podium, onder de optimale lichtomstandigheden gebruikt, het niveau van de tijdelijke expressie is laag. Laag molecuulgewicht fenolische verbindingen (acetosyringoon) en monosaccharaides (glucose) daar vir genen induceren in A. tumefaciens 55,61. Bovendien infiltratie van N. benthamiana met de binaire vector pCAMBIA (gfp) in aanwezigheid van acetosyringoon bij concentraties van 50-600 pM werden licht toenemen voorbijgaandegenexpressie 40. We onderzochten het effect van verschillende concentraties van acetosyringoon en glucose in het systeem door het toevoegen van deze verbindingen GV3101 culturen herbergen pBID4-GFP MMA 3 uur en vond geen verschil in GFP-expressie. Interessant, GV3101 culturen herbergen pBID4-GFP en verdund in Milli-Q water tot een A 600 van 0,5 en geïnfiltreerd zonder de vir geninductie uitgedrukt dezelfde hoeveelheden GFP als die geïnfiltreerd met geïnduceerde culturen. De A. tumefaciens vir gen (en) zou kunnen worden geïnduceerd door plantfenolsamenstellingen (acetosyringoon en sinapinezuur) en plantaardige monosaccharaides (glucose en fructose) aanwezig in bladweefsel. Derhalve speculeren wij dat soortgelijke niveaus van GFP-expressie in de aanwezigheid of afwezigheid van exogeen vir gen inductoren gevolg van het effect van cytoplasmatische vir gen inductoren aanwezig tijdens replicatie van de GFP expressie vector introductie in plantencellen zijn. N benthamiana is gebruikt als model gastheer voor voorbijgaande eiwitproductie 49. Echter, N. benthamiana &#39;s relatief laag biomassaopbrengst belemmert de toepassing ervan voor de grootschalige productie van recombinante eiwitten. De optimale gastheer moet een hoge mate van kortstondige expressie, gemakkelijke groei in een kas combineren, zijn gevoelig voor Agrobacterium infiltratie 2. Om een alternatieve gastheer selecteren, we geïnfiltreerd twee verschillende wild-type soort Nicotiana (N. benthamiana en N. excelsior) en een hybride N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) met de A. tumefaciens stam GV3101 herbergt de pBID4-GFP plasmide. Tussen deze drie soorten, het niveau van GFP-expressie iets hoger N. benthamiana. N. excelsior planten moeite met vacuüm agroinfiltration toonden door hun leerachtige bladeren, en N. excelsianaproduceerde ongeveer twee keer meer biomassa onder dezelfde groeiomstandigheden. De voorbijgaande productie van GFP op 7 dpi is relatief vergelijkbaar in N. benthamiana en N. excelsiana. Daarom N. excelsiana kan een meer geschikte gastheer voor recombinant eiwitproductie zijn. Agrobacterium gemedieerde tijdelijke eiwitproductie wordt beperkt door PTGS 26, die kan worden ondervangen door co-expressie van gene silencing suppressors van plantenvirus oorsprong 62. Voorbijgaande eiwitproductie werd aangetoond worden verbeterd 50-voudig in aanwezigheid van het p19 eiwit van TBSV, die PTGS in geïnfiltreerde weefsels 34 remt. In onze studie, onderzochten we het effect van twee virale silencing onderdrukkers (p19 en p23) afzonderlijk co-geïnfiltreerd met de lancering vector pBID4-HAC1. De co-infiltratie van deze zwijgen suppressors leek weinig invloed op transiënte expressie van HAC1 hebben, met slechts een lichte stijging HAC1eiwit accumulatie (15-25%) in de aanwezigheid van co-geïnfiltreerde p23 of p19. Een positieve invloed hebben eiwitproductie, kan het nodig zijn tot zwijgen onderdrukkers specifiek worden geselecteerd effectief voor de gerichte plantensoorten en virale vector 63 te zijn. TMV helicase heeft een onderdrukker van RNA-silencing activiteit 64,65. Onze gegevens bevestigen deze waarneming als co-infiltratie van p23 of p19 met pBID4-HAC1 resulteerde in een toename van GFP of een lichte stijging van de voorbijgaande HAC1 eiwitproductie. Concluderend hebben we aangepast en geoptimaliseerd vaste Agrobacterium groei omstandigheden en verbeterde de efficiëntie van vacuüm infiltratie. Deze technologie ons in staat om te groeien en te infiltreren honderden kilo plantaardig materiaal in een paar uur. Wij hebben met succes geautomatiseerde de plant tijdelijke expressie techniek voor high-throughput vaccin productie op industriële schaal onder de huidige Good Manufacturing Practices (cGMP) omstandigheden. Voor meer informatie about automatisering en het gebruik van de plantaardige voorbijgaande eiwitproductie voor de productie van recombinante eiwitten, waaronder subunit vaccin kandidaten, onder cGMP condities, wordt de lezer verwezen naar de website <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

Planten worden nu erkend als een veilige, betrouwbare, schaalbare en goedkoop platform voor de productie van heterologe recombinante biofarmaceutische en industriële eiwitten 1-3 en hebben belangrijke voordelen ten opzichte van microbiële en dierlijke celexpressiesystemen 4. Planten zijn in staat om correct gevouwen eiwitten tot expressie met post-translationele modificaties, inclusief gemonteerde multimere antilichamen 5-7. Verschillende plantaardige recombinante farmaceutische eiwitten ondergaan klinische evaluatie 8. Deze omvatten patiëntspecifieke recombinante idiotype vaccins (scFv) voor de behandeling van non-Hodgkin lymfoom 9, hemagglutinine-gebaseerde pandemie en seizoensgebonden influenzavaccin gegadigden 10,11 (Cummings et al.. Aan Vaccine ingediend), anti-Streptococcus oppervlakteantigeen I / II antilichaam voor de behandeling van tandcariës 12 en humane insuline voor de behandeling van diabetes 13. Bovendien menselijk recombinant glucocerebrosidase voor enzym-substitutietherapie bij patiënten met de ziekte van Gaucher is in Israël en de VS goedgekeurd en wordt geleverd onder de Expanded Access Program buiten de VS 14,15. Heterologe eiwitten kunnen worden geproduceerd in stabiel getransformeerde (transgeen of transplastomic) of tijdelijk getransformeerde planten. Voorbijgaande eiwitproductie biedt verschillende voordelen ten opzichte productie in transgene planten, waaronder de korte termijn expressie en accumulatie 16 bereiken, en kan worden bereikt door bacteriële binaire vectoren of recombinante planten virale vectoren in plantenweefsels 4. De meest geavanceerde transiënt expressiesysteem is gebaseerd op het gebruik van &quot;launch vectoren&quot; die bestanddelen van plantenvirussen en binaire plasmiden combineren, door agroinfiltration 17,18 geleverd. Agroinfiltration van een lancering vector op basis van tabak mozaïek virus (TMV) is met succes in het lab toegepastschalen naar vaccin antigenen produceren tegen pathogenen zoals het humaan papillomavirus 19, Yersinia pestis 20, influenzavirussen A 21,22, Bacillus anthracis 23 en pokkenvirus 24 in N. benthamiana bladeren. Agrobacterium gemedieerde tijdelijke expressie is een veelbelovende werkwijze voor de gelijktijdige productie van verschillende eiwitten 2,25-27. Zo zijn plantaardige tijdelijke expressiesystemen gebruikt om tumor-specifieke recombinante antilichamen 28,29, een geglycosyleerd recombinant antilichaam tegen de epidermale groeifactor receptor 30 en een monoklonaal antilichaam specifiek voor miltvuur beschermende antigeen 31,32 produceren. Co-infiltratie van Nicotiana benthamiana planten met een target-gen en een suppressor van gene silencing resulteert in verbeterde doeleiwitexpressie 33,34. Agroinfiltration is een gemeenschappelijke methode voor het uniform introducing bacteriën drager zijn van een gen van belang in plantaardige weefsels 35-37. Vacuüm infiltratie van Agrobacterium voor transiënte genexpressie in intacte bladeren is een snelle, schaalbare en bruikbare werkwijze voor productie van heterologe eiwitten zonder dat transgene planten 38-41 genereren. Tijdens vacuüm agroinfiltration, zijn planten ondersteboven weggeknipt en bovengrondse delen ondergedompeld in Agrobacterium schorsing. Dan vacuüm wordt toegepast waardoor gassen te evacueren van blad intercellulaire ruimten via huidmondjes. Snelle re-onder druk na release van het vacuüm resultaten in de infusie van de Agrobacterium schorsing in het blad. Na vacuüm infiltratie van Agrobacteria, zijn planten verder gekweekt en doel expressie wordt bewaakt. De hoogste doelwitexpressiecassette worden typisch waargenomen 2-3 dagen na infiltratie (dpi) met een binaire vector en 4-7 dpi met een lancering vector, waarna het expressieniveau meestal decreases 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens is het meest gebruikte middel voor het afleveren van een gen van belang in een plant voor eiwitproductie. Agroinfiltration werkt uitzonderlijk goed in N. benthamiana maar relatief slecht in de meeste andere planten, zoals Arabidopsis thaliana 46. In deze studie hebben we een eenvoudige, efficiënte en economische methode voor transiënte eiwitproductie in 5-6 weken oude N. benthamiana behulp A. tumefaciens infiltratie. Het grote nadeel van industriële schaal van de agroinfiltration techniek centrifugatie geoogst bacteriën en resuspensie van de bacteriële pellet in medium dat 4&#39;-hydroxy-3 &#39;, 5&#39;-dimethoxyacetofenon (acetosyringoon), monosacchariden, en 2 - (N-morfolino) -ethaansulfonzuur (MES) buffer voor de inductie van de vir-genen. We zijn in staat om deze problemen te overwinnen door het optimaliseren van de Agrobacterium geweest </em&gt; groei in AB medium (minimaal medium), gevolgd door direct verdunnen in Milli-Q water en door het beheersen van de infiltratie duur en de omstandigheden. We hebben vergeleken doeleiwit productie in de wildtype tabak gastheersoort N. benthamiana en N. houtwol, evenals in hybride N. excelsiana.

<table><tbody><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td><td>PI 555478 TW16</td><td>Infiltratie</td></tr><tr><td>Nicotiana excelsior</td><td>Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td><td>PI 555685 TW47</td><td>Infiltratie</td></tr><tr><td>Nicotiana excelsiana</td><td>Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td><td>LSBC EBA 042304.02</td><td>Infiltratie</td></tr><tr><td>Vacuum skid</td><td>Abbas, Ashland, MA</td><td>Op maat gemaakt</td><td>Plantinfiltratie</td></tr><tr><td>Rockwool</td><td>Grodan Inc., Ontario, Canada</td><td>AO 50/40</td><td>Hydroponisch medium voor het kweken van planten</td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino) ethansulfonic acid</td><td>Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ</td><td>172595000</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Murashige &amp; Skoog zout (MS-zout)</td><td>Phyto Technology Lab</td><td>M524</td><td>Weefselkweekmedium</td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D134406-5G</td><td>Agrobacterium-inductie</td></tr><tr><td>Immobilon-P transfermembraan</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>IPVH00010</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>I-block</td><td>Applied Biosystems, Foster City, CA</td><td>T2015</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Konijnen polyklonaal anti-GFP antiserum&nbsp;</td><td>Washington Biotechnology, Baltimore, MD</td><td></td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Muis anti&ndash;poly-histidine monoklonaal antilichaam</td><td>Qiagen GmbH, Hilden</td><td>34670</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase-geconjugeerd anti-konijn antilichaam&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>111-035-003</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase-geconjugeerd anti-muis antilichaam</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115-035-003</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal&reg; West Pico chemiluminescent substraat</td><td>Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td><td>34078</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucaan)</td><td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland</td><td>P-LICHN</td><td>Lichenase-activiteit</td></tr><tr><td>Congo Red&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>C6277</td><td>Gelkleuring</td></tr><tr><td>Digitale camera&nbsp;</td><td>Olympus, Center Valley, PA</td><td>C-8080</td><td>Chemiluminescentie beeldvorming</td></tr><tr><td>GeneGnome</td><td>Syngene, Frederick, MD</td><td></td><td>Chemiluminescentie beeldvorming&nbsp;</td></tr><tr><td>GFP-standaard&nbsp;</td><td>Gemaakt in huis</td><td></td><td>Chemiluminescentie beeldvorming&nbsp;</td></tr><tr><td>Plantenmeststofoplossing</td><td>Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE</td><td>67-23-20</td><td>Planten groeien</td></tr><tr><td>Lichenase-standaard</td><td>Gezuiverd in huis</td><td></td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>BioRad, Hercules, CA</td><td>165-2100</td><td>Agrobacterium-transformatie&nbsp;</td></tr></tbody></table>

optimalisatie en het gebruik van<em&gt; agrobacterium</em&gt;-gemedieerde transient eiwitproductie in<em&gt; nicotiana</em

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-gemedieerde tijdelijke eiwitproductie in planten is een veelbelovend om vaccinantigenen en therapeutische eiwitten binnen een korte tijd. Echter, is deze technologie nog maar net beginnen te worden toegepast op grote schaal te produceren zo veel technologische belemmeringen voor opschaling worden nu overwonnen. Hier tonen we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het op industriële schaal voorbijgaande eiwitproductie op basis van vacuüm infiltratie van Nicotiana planten met Agrobacteriën dragen lancering vectoren. Optimalisatie van Agrobacterium teelt in AB medium maakt een directe verwatering van de bacteriecultuur in Milli-Q water, de vereenvoudiging van de infiltratie-proces. Onder de drie geteste soorten van Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. houtwol) werd gekozen als de meest veelbelovende gastheer vanwege het gemak van infiltratie, hoge reporter eiwitproductie en twee-foude hogere biomassaproductie onder gecontroleerde omstandigheden. Inductie van Agrobacterium pBID4-GFP (tabak mozaïek virus gebaseerde) met chemicaliën zoals acetosyringoon en monosaccharide had geen effect op het eiwit productieniveau. Infiltreren plant onder 50 tot 100 mbar gedurende 30 of 60 seconden resulteerde in ongeveer 95% infiltratie van plant blad weefsels. Infiltratie met Agrobacterium laboratoriumstam GV3101 toonde de hoogste eiwitproductie in vergelijking met Agrobacteria laboratoriumstammen LBA4404 en C58C1 en wild-type Agrobacteria stammen AT6, AT10, at77 en A4. Co-expressie van een viraal RNA silencing suppressor p23 of p19, in N. benthamiana resulteerde in eerdere accumulatie en verhoogde productie (15-25%) doelwiteiwit (influenzavirus hemagglutinine).

Voorbijgaande eiwitproductie in Nicotiana planten op basis van vacuüm infiltratie met Agrobacteriën uitvoeren lancering vectoren (tabak mozaïek virus-based) is een snelle en economische benadering van vaccin antigenen en therapeutische eiwitten te produceren. We vereenvoudigde de procedure en verbeterd doel accumulatie door het optimaliseren van de voorwaarden van bacteriën kweken, selecteren gastheer soorten, en co-introduceren van RNA-silencing onderdrukkers.

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een eenvoudige, efficiënte en schaalbare methode voor de transiënte productie van recombinant eiwit in een plantaardig systeem met behulp van de agro-infiltratietechniek. Dit wordt bereikt door eerst de groeiomstandigheden voor de planten te optimaliseren. De tweede stap is het transformeren van agrobacterium met launch-vectoren die componenten van plantenvirussen en binaire plasmiden combineren, gevolgd door het kweken van de getransformeerde agrobacterium voor gebruik in de agro-experimenten.Tijdens de infiltratie met agrobacterium worden de planten ondersteboven gekeerd en worden de bovengrondse delen ondergedompeld in een agrobacteriumsuspensie. Vervolgens wordt er een vacuüm aangelegd, waardoor lucht uit de intercellulaire ruimtes in het bladweefsel wordt verwijderd. De snelle heropdrukking na het opheffen van het vacuüm resulteert in de infusie van de agrobacteriumsuspensie in de bladeren.Uiteindelijk worden immunoblotting en fluorescentie-assays gebruikt om de productie van recombinant eiwit in de geïnfiltreerde planten aan te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals handmatige infiltratie, is dat de vacuuminfiltratiemethode kan worden opgeschaald voor industriële productie van recombinante eiwitten, waaronder vaccins en therapeutische eiwitten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de plantbiotechnologie en het gebruik van planten als alternatief platform voor commerciële productie van recombinant eiwit verder faciliteren.We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we ontdekten dat het opschalen van agro-infiltratie bij planten die in bodem groeien uitdagend is. Om verschillende redenen bevat bodem contaminanten zoals virussen, bacteriën en nematoden; bovendien variëren de bodemsamenstelling en het irrigatiewater van batch tot batch en van seizoen tot seizoen, en de bodem degradeert na verloop van tijd tijdens opslag. Daarnaast zou het omkeren van planten die in bodem groeien leiden tot ongewenste druppeling van bodem in de agrobacteriumcultuur tijdens de infiltratie.Deze procedure wordt gedemonstreerd door Rebecca Snow, senior research assistant van het laboratorium voor plantbiologie en engineering, en Emma Gut Robin Lobe. Zij en Adam Trevor zijn research assistants van mijn laboratorium. In deze studie wordt gebruikgemaakt van een hydroponisch plantengroeimedium en een voedingsoplossing om de uniformiteit van de plantengroei te waarborgen en de complexiteiten die gepaard gaan met het gebruik van grond voor plantenteelt te elimineren.Om deze procedure te starten, weekt u steenwolplaten gedurende vijf minuten in een plantenmestoplossing en zaait u handmatig zaden op het met nutriënten verzadigde oppervlak van de steenwol. In deze studie worden drie Nico Oceana-soorten geëvalueerd: twee wildtype soorten, Nico Oceana, Benham Ana en Nico Oceana Excelsior, en een hybride van Benham, Ana en Excelsior genaamd Nico Oceana Excela. Kweek de planten uit de zaden onder gecontroleerde omstandigheden en een lange dag-fotoperiode in een hydroponisch cascade-teeltsysteem.Nico Oceana, Bentham Miana en Nico Oceana Excela gedurende vier tot vijf weken, en Nico Oceana Excelsior gedurende vijf tot zes weken. De Agrobacterium tumor Fasion-stammen die in dit experiment zijn gebruikt, zijn getransformeerd met de betreffende lanceervectoren zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Ten behoeve van deze demonstratie worden vijf getransformeerde agrobacteriumstammen gebruikt.GV 3 1 0 1, met een reporter-gen voor groen fluorescent protein, of GFP-gen GV 3 1 0 1, met het virale gen van de silencing-suppressor P 19 van het tomato bushy stunt virus en A four GV 3 1 0 1, en een T 10, met het gen van een gemodificeerd carrier-proteïne lyase of lick KM, kweek agrobacterium-stammen overnacht in LB-medium, aangevuld met 50 mg/L kanamycin bij 28 °C met schudden op 200 tot 250 RPM. Bereid de volgende dag agrobacterium-suspensies voor de gewenste experimenten om de haalbaarheid van het gebruik van meerdere agrobacterium-stammen voor transiënte eiwitproductie te onderzoeken; verdun een laboratoriumstam en twee wildtype-stammen, die de PBI four lick km-vector bevatten, in milli-Q-water tot een optische dichtheid bij 600 nm van 0,5.Om de noodzaak van het induceren van virulentiegenen van Agrobacterium vóór infiltratie te onderzoeken, centrifugeert u eerst Agrobacterium-culturen die de P bid 4G FP-vector dragen en zijn gekweekt in LB-medium bij 4,000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Resuspendeer deze vervolgens in MMA-inductiemedium tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,5 en roer twee uur lang bij kamertemperatuur. Om te testen of acetylconon de transiënte eiwitproductie verhoogt, centrifugeert u een Agrobacterium-cultuur die de PBI 4G FP-vector dragen en overnight is gekweekt in LB-medium, en resuspendeert u deze in infiltratiebuffer bestaande uit 1X ms-zout, 10 millimol MES en 2% glucose.Verdeel de celsuspensie over vier containers. Voeg aan elke Agrobacterium-suspensie een verschillende concentratie aceto-conus toe en incubeer gedurende drie uur bij kamertemperatuur. Om het effect van co-infiltratie van een virale silencing-suppressor op de transiënte GFP-proteïneproductie te testen, mengt u.Een met Milli-Q-water verdunde agrobacteriumcultuur die het GFP-gen draagt en een cultuur die de virale silencing-suppressor P 19 draagt, in een verhouding van vier op één tijdens de vacuuminfiltratie van planten, die gedemonstreerd zal worden. Vervolgens is het cruciaal om de vacuümdruk en de duur van de infiltratie te beheersen om planten vacuüm te infiltreren. Plaats eerst de voorbereide agrobacteriumsuspensie in een container binnen de vacuümkamer.Keer de plant vervolgens ondersteboven in de verdunde agrobacterium en pas een vacuüm van 50 tot 400 millibar toe gedurende 30 of 60 seconden. De optimale infiltratie wordt routinematig toegepast bij 50 tot 100 millibar gedurende 60 seconden. Zodra het vacuüm is verbroken, worden de planten uit de vacuümkamer gehaald, afgespoeld met water en gedurende vijf tot zeven dagen gekweekt onder dezelfde groeiomstandigheden als gebruikt voor de groei vóór filtratie.Om monsters voor Western-analyse voor te bereiden, verzamel eerst willekeurige bladsamples van Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior- of Nico Oceana Excela-planten vier tot zeven dagen na infiltratie (DPI). Pulveriseer de bladsamples in vloeibare stikstof tot een fijn poeder. Voeg drie volumes 1X PBS-buffer met 0,5% Triton X 100 toe aan elk monster en breng het monster over naar een Eppendorf-buisje. Schud of roteer de geëxtraheerde monsters voorzichtig gedurende 15 minuten bij 4 °C.Centrifugeer het extract gedurende vijf minuten en verzamel het totale oplosbare eiwit in een schone eppendorfbuis. Verdun de extracten tot de juiste verdunning in één XPBS-extractiebuffer en voeg vijf x monsterbuffer toe tot een uiteindelijke concentratie van één X. Kook de monsters vijf minuten voordat de eiwitten worden gescheiden via SDS-PAGE.Nadat de eiwitten op een immobiliserend P-transfermembraan zijn overgebracht, wordt GFP gedetecteerd met konijn polyklonaal anti-GFP antiserum in een verdunning van 1:5.000 in blokkeringsoplossing. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur met zachte schudbewegingen, nadat de membranen drie keer zijn gewassen met 1X-P-B-S-T 20. Incubeer gedurende één uur met het met mierikswortelperoxidase geconjugeerde anti-konijn antilichaam in een verdunning van 1:5.000 voor de detectie van GFP.Vervolgens worden de western blots verwerkt en worden de bandintensiteiten die overeenkomen met de eiwitten geanalyseerd zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. De visuele detectie van GFP-fluorescentie in volledige transient getransformeerde planten wordt uitgevoerd met een handlamp voor lange golflengte UV; gebruik een digitale camera en een belichtingstijd van 15 seconden om de transient getransformeerde planten te fotograferen door een geel eight ES 52 filter. Verkrijg beelden van de western blot-analyses met de gene snapped-software op een genome.Kwantificeer de resultaten met behulp van de gene tool-software met een kalibratiecurve op basis van een gezuiverde GFP-standaard; Nick Oceana Bentham Miana werd gekweekt op Rockwell-platen gedrenkt in commercieel verkrijgbare meststoffen om de optimale condities voor plantengroei en biomassa-accumulatie te bepalen. De aanwezigheid van fosfor is cruciaal voor het bereiken van kieming en groei van NICO Oceana. Bentham-zaden, zoals blijkt uit deze zes weken oude planten die groeien in respectievelijk een mestoplossing met 4,8% fosfor of een mestoplossing met 0% fosfor.De effecten van agrobacterium-groeimedia en infiltratiemedia op de plantgezondheid en eiwitproductie werden onderzocht door de GFP-productie in nicotiana hamana-planten te vergelijken. Deze planten werden vacuümgeïnfiltreerd met PBI 4G FP-bevattende agrobacterium-culturen die waren gegroeid in drie verschillende media. YEB-, AB- en LB-culturen die overnacht waren gegroeid in YEB- of LB-medium werden bij lage snelheid gecentrifugeerd en resuspendeerd in MMA-inductiemedium, of er werden overnacht in YEB-, LB- of AB-media gegroeide culturen direct één op vijf of één op 10 verdund met Milli-Q-water. Zoals blijkt uit dit western blot-resultaat, vertoonden planten die waren geïnfiltreerd met agrobacterium-culturen gegroeid in YEB-, LB- of AB-media en verdund met Milli-Q-water geen significant verschil in gemiddelde GFP-productie ten opzichte van culturen die waren gecentrifugeerd en resuspendeerd in MMA.Daarom wordt Milli-Q-water aanbevolen voor het verdunnen van agrobacteriumculturen voor plantinfiltratie, en dit werd routinematig gebruikt in daaropvolgende experimenten om een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,5 te bereiken. Vervolgens werden de effecten van de dichtheid van de agrobacterium-celсусpensie en het tijdverloop op de doelexpressie onderzocht. Vier verschillende dichtheden van de celsuspensie van agrobacterium met PBI 4G FP werden beoordeeld en bladmonsters werden verzameld op vier, zeven en 10 dagen na infiltratie (DPI) voor western blot-analyse. Op vier DPI waren er duidelijke verschillen in GFP-fluorescentie tussen planten die waren geïnfiltreerd met verschillende dichtheden van de agrobacterium-celsuspensie; er werd geen GFP-expressie waargenomen bij een OD600 van 0,05. Op zeven DPI was GFPDe fluorescentie was vergelijkbaar bij planten die waren geïnfiltreerd met cel-suspensies met dichtheden van 1,0, 0,5 en 0,1 A₆₀₀, maar was lager bij planten geïnfiltreerd met een A₆₀₀ van 0,05, in contrast op 10 DPI. Er werden geen verschillen in GFP-productie waargenomen tussen planten die waren geïnfiltreerd met een van de vier cel-suspensiedichtheden om de diversiteit van beschikbare Agrobacterium-stammen voor transiënte eiwitproductie te vergroten.Nicotiana benthamiana-planten werden vacuümgeïnfiltreerd met zeven verschillende stammen agrobacteriën die de vector pKBI4-kan waren. De geïnfiltreerde bladeren werden verzameld op zeven DPI en het niveau van kinase-expressie werd bepaald via Western blot. Zoals in deze grafiek wordt getoond, werd het hoogste niveau van liase-productie bereikt met de stammen GV3101, IA4 en LBA4404, met slechts geringe verschillen.Hoewel de laagste expressie werd waargenomen bij C58 C1, werd een intermediaire lyaseproductie bereikt met de stammen AT77, AT06 en AT10. De enzymatische activiteit van de lyase werd aangetoond met een XMO Graham-assay. Het gezuiverde bacteriële lyase-eiwit werd gebruikt als positieve controle voor de enzymactiviteit. Het is interessant om op te merken dat Nicotiana benthamiana-planten die waren geïnfiltreerd met de wilde-type Agrobacterium-stammen A4 en AT77 pathologische symptomen vertoonden, zoals dwerggroei, verlenging en kromming van de bladstelen en bladkrulling bij 7 DPI.De symptomen waren mild bij Nicotiana benham-planten die waren geïnfiltreerd met het wildtype T 10-stam. Geen symptomen werden waargenomen bij Nicotiana benham-planten die waren geïnfiltreerd met de laboratoriumstam GV 3 1 0 1. Een vergelijking van de plantbiomassa-productie in de wildtype-soorten onthulde dat onder dezelfde groeicondities de hoogste bladbiomassa die kan worden gegenereerd uit Nicotiana excela ongeveer tweemaal hoger is in vergelijking met Nicotiana.De productie van Benham-eiwit werd onderzocht in Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior en Nico Oceana Excela die waren geïnfiltreerd met de agrobacteriumstam GV 3 1 0 1 die PBI 4G F-P-G-F-P bevat. De accumulatie werd na zeven DPI beoordeeld in volledig geïnfiltreerde bladeren. Visuele inspectie van de GFP-expressie onder UV-licht toonde een gelijkmatige distributie van GFP in Nico Oceana Hamana en Nico Oceana Excela, en een ongelijkmatige distributie in Nico Oceana Excelsior vanwege de moeilijkheid om het volledige bladoppervlak van Nico Oceana Excelsior te infiltreren. Western blot-analyse van de GFP-accumulatie in deze geïnfiltreerde bladeren na zeven DPI toonde aan dat het GFP-niveau hoger was in Nico Oceana Hamana dan in Nico Oceana Excela en Nico Oceana Excelsior, met een laag niveau van eiwitproductie in Nico Oceana.Excelsior is het gevolg van een ongelijkmatige infiltratie en ongelijkmatige distributie van geaccumuleerd GFP in het verzamelde blad. Om het effect van vacuümdruk op de bladeren te testen, werden Nico Oceana Benham-planten geïnfiltreerd met de agrobacteriumstam GV 3 1 0 1 die PBI 4G FP bevat, onder vacuümdrukken van 400, 200, 100 of 50 millibar met een vacuümtijd van 30 of 60 seconden. Er werden geen verschillen in GFP-productie waargenomen en er was een geringe tot geen nadelige impact op de gezondheid van de plant wanneer vacuümdrukken van 5, 100 en 200 millibar gedurende 30 of 60 seconden werden toegepast.Het effect van de duur van het vacuüm op de expressie van het target werd beoordeeld door elke uur één tray Nico Oceana Benham planten te infiltreren met een A 600 van 0.5 van GV 3 1 0 1 met PBI 4G FP gedurende acht uur. In dezelfde agrobacteriumcultuur, zoals getoond in dit representatieve resultaat, was het niveau van GFP-productie op alle tijdstippen tot acht uur vergelijkbaar, wat suggereert dat de agrobacterium over deze periode zijn vermogen behoudt om enkelstrengs DNA over te dragen. Aangezien er is gerapporteerd dat veel chemicaliën en monosachariden de transiënte eiwitproductie in diverse plantensoorten versterken.Deze studie beoordeelde daarnaast het effect van verschillende concentraties acetofenon en glucose op de transiënte GFP-proteenproductie in Nicotiana oceana Bentham, geïnfiltreerd met de agrobacteriumstam GV 3 1 0 1 die PBI 4G FP draagt. De agrobacteriën werden overnacht gekweekt in YEB-medium, gecentrifugeerd en geresuspendeerd tot een a 600 van 0,5, óf in MMA bevattend 2% glucose met acetofenon in de aangegeven concentraties, óf in MMA bevattend 200 micromolar acetofenon met glucose in de aangegeven concentraties. Zoals hier getoond, induceerden geen van de geteste concentraties van deze verbindingen een significante toename in GFP-proteenproductie in vergelijking met de controle, waarbij het inductiemedium geen acetofenon of glucose bevatte.Vervolgens werd het effect van co-infiltratie van een silencing-suppressor op de transiënte expressie van GFP- en HAC1-genen in bladeren van Nicotiana oceana Benham onderzocht. Voorafgaand aan de infiltratie werden Agrobacterium GV3101-culturen met PBI4G FP en de virale silencing-suppressor P19 van het tomato bushy stunt virus respectievelijk gemengd in verhoudingen van 1:1, 2:1, 3:1 en 4:1. Zoals aangegeven door de resultaten van de Western blot-analyse op 7 DPI, leidde de aanwezigheid van P19 bij geen enkele verhouding van de twee Agrobacterium-suspensies tot een toename of afname van de GFP-productie in Nicotiana benhamiana.Bovendien werd het effect van twee virale onderdrukkers van gen-silencing, P 23 en P 19, op het voorkomen van post-transcriptionele gen-silencing voor HAC one onderzocht. POS van agrobacterium met de launch-vector PBI four HAC one en een van de twee virale onderdrukkende silencing-plasmiden werden in een respectieve verhouding van vier op één gemengd en co-geinfiltreerd in Nicotiana Bentham Miana. De geïnfiltreerde bladmonsters werden verzameld vanaf drie tot acht DPI.Deze grafiek toont de gemiddelde niveaus van HAC one-expressie uit drie experimenten, bepaald via Western blot-analyse. Co-infiltratie van Nico Oceana Benham met P 23 of P 19 resulteerde in een toename van de HAC one-productie vergeleken met het gebruik van geen silencing-suppressor bij 60 pi. Dit suggereert dat P 23 en P 19 efficiënt zijn in dit systeem.Er werd ook waargenomen dat het niveau van de HAC one-proteineproductie bij zeven DPI begon af te nemen, zowel in aanwezigheid als in afwezigheid van een silencing-suppressor. Dit geeft aan dat de timing van de afname in de transiënte proteineproductie in Nicotiana benthamiana geïnfiltreerd met de launch-vector doelspecifiek is. Tot slot wordt de stabiliteit van de Agrobacterium-celbank jaarlijks geëvalueerd door Nicotiana benthamiana-planten te infiltreren met dezelfde batch van de Agrobacterium-celbank om de proteïneaccumulatie te bepalen.Deze representatieve resultaten geven aan dat de productie van het HA-protein zeer stabiel is geweest gedurende meer dan drie jaar. De gemiddelde HAC-productie in Nicotiana benam-planten is 651 ± 49,4 mg/kg. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe de agro-infiltratietechniek kan worden toegepast voor de grootschalige productie van recombinante eiwitten, die kunnen worden gebruikt voor de vervaardiging van subunit-vaccins, therapeutische eiwitantilichamen en diagnostische antigenen.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de plantkruising hydroponisch te beheersen, levensvatige agrobacteriën te gebruiken, de vacuümdruk en -duur te controleren en de drager van de eiwitexpressie te monitoren. Zodra de techniek beheerst is, kan de agrofiltratietechniek binnen 24 uur worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd onder gecontroleerde omstandigheden.

optimization-utilization-agrobacterium-mediated-transient-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Planten bieden een nieuw systeem voor de productie van farmaceutische eiwitten op commerciële schaal die is beter schaalbaar, kostenefficiënte en veilige dan de huidige expressie paradigma. In deze studie, rapporteren we een eenvoudig en handig, toch schaalbare aanpak van target-gen-bevattende...

Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

Agro-infiltratie en PVX-agro-infectie zijn routinematige functionele assays voor voorbijgaande ectopische expressie van genen in planten. Deze methoden zijn efficiënte assays in effectoromics strategieën (snelle weerstand en avirulence gen ontdekking) en cruciaal voor modern onderzoek in moleculaire plant pathologie. Ze voldoen aan de vraag naar robuuste functionele analyse met hoge doorvoer in fabrieken.

Agro-infiltratie en PVX Agro-infectie in aardappel en Nicotiana benthamiana

Vorming van eiwitcomplexen in vivo kan worden gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie complementatie. Interactie partners gefuseerd aan complementaire delen van fluorescente labels en tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren, waardoor een opnieuw fluorescentiesignaal op nabijheid van de twee eiwitten.

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

In deze studie werd de expressie van een doelgerichte humane recombinante eiwit in verschillende productieplatforms vergeleken. We concentreerden ons op traditionele fermentor-gebaseerde culturen en op planten, waarbij we de instelling van elk systeem beschreven en, op basis van de gerapporteerde resultaten, de inherente grenzen en voordelen voor elk platform benadrukten.

Een vergelijkende analyse van recombinant eiwit expressie in verschillende biofactories: Bacteriën, Insect Cells and Plant Systems

Plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata (Pd), spelen een centrale rol in plant fysiologie en plant-virus interacties. Kritische Pd vervoer zijn signalen dat rechtstreekse eiwitten aan Pd sorteren. Onze kennis over deze sequenties is echter nog in de kinderschoenen. Beschrijven we een strategie om te identificeren Pd lokalisatie signalen in Pd-gerichte eiwitten.

Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta

Dit manuscript beschrijft een gemakkelijke en snelle experimentele procedure voor het bepalen van de eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op de meting van luciferase activiteit.

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

Voorbijgaande heterologe expressie van biosynthetic enzymen in Nicotiana benthamiana bladeren kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe producten van hoogwaardige triterpene. Hierin is beschreven van een gedetailleerd protocol voor snelle (5 dagen) preparative-schaal productie van triterpenen en analogen met behulp van dit krachtige plantaardige platform.

Voorbijgaande expressie in Nicotiana Benthamiana verlaat voor de productie van de Triterpene op een voorbereidende schaal

Hier presenteren we gemakkelijk te gebruiken protocollen voor het produceren en zuiveren van diterpenoid metabolieten door de combinatorische expressie van biosynthetische enzymen in Escherichia coli of Nicotiana benthamiana, gevolgd door chromatografische product Zuivering. De resulterende metabolieten zijn geschikt voor verschillende studies, waaronder moleculaire structuur karakterisering, enzym functionele studies, en bioactiviteitentesten.

Een aanpasbare aanpak voor de enzymatische productie en zuivering van Diterpenoid natuurlijke producten

We beschrijven hier een eenvoudige methode voor expressie, extractie en zuivering van recombinant menselijke IgG versmolten tot GFP in Nicotiana benthamiana. Dit protocol kan worden uitgebreid tot zuivering en visualisatie van tal van eiwitten die kolomchromatografie gebruiken. Bovendien is het protocol aanpasbaar aan het persoonlijke en virtuele college onderwijs laboratorium, het verstrekken van project-based exploratie.

Productie van IgG Fusion Proteins transiently uitgedrukt in Nicotiana benthamiana

Hier presenteren we een methode om de vorming van ternaire complexen tussen drie eiwitpartners te visualiseren met behulp van fluorescerende gelabelde eiwitten door biFC-gebaseerde FRET-FLIM-assay. Deze methode is waardevol voor het bestuderen van eiwit-eiwitinteractiecomplexen in vivo.

Bepaling van de tripartiete interactie tussen twee monomeren van een MADS-box transcriptiefactor en een calciumsensoreiwit door BiFC-FRET-FLIM-assay

Fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) is een beeldvormingstechniek voor het detecteren van eiwitinteracties in levende cellen. Hier wordt een FRET-protocol gepresenteerd om de associatie van histonmodificerende enzymen met transcriptiefactoren te bestuderen die ze rekruteren voor de doelpromotors voor epigenetische regulatie van genexpressie in plantenweefsels.

Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren in vivo door fluorescentieresonantie-energieoverdracht

Leer een geoptimaliseerde methode voor transiënte eiwitproductie in Nicotiana met Agrobacterium-vacuüminfiltratie. Deze techniek maakt schaalbare productie van vaccinantigenen en therapeutische eiwitten mogelijk.

Optimalisatie en het gebruik van

Meer video's verkennen