Name: Efficiënte productie en zuivering van recombinant muizen Kindlin-3 uit Insect Cellen voor Biofysische Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Leer de efficiënte productie en zuivering van recombinant muizen Kindlin-3 uit insectcellen voor biofysische studies. Deze methode levert tien keer hogere opbrengst dan bacteriële expressiesystemen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Weixan Lu voor technische bijstand in de cultuur en het onderhoud van de Sf9 cel voorraden. LAY werd ondersteund door een Medical Research Council (MRC) afgestudeerde studententijd. RJCG was een Royal Society Universiteit Research Fellow. The Oxford afdeling Structurele Biologie is onderdeel van het Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Wellcome Trust Core Award Grant Number 090532/Z/09/Z.

Dit protocol veronderstelt dat de muis kindlin-3 gen (FERMT3) met succes gekloneerd in een vector stroomafwaarts van de zeer late p10 promotor en de vector bezit flankerende baculovirus sequenties recombinatie mogelijk de bacmide BAC10 KO: 1629 ontwikkeld door IM Jones en collega 28. Voor dit protocol, werd de kindlin-3-gen gekloond in pOPINE 29 en de primers en kloneringsstrategie gebruikt kan worden gevonden elders 12 beschreven. Het plasmide is ontworpen zodat de FERMT3 gen (kindlin-3) is onder controle van de p10 baculovirus promoter en de vector bevat 5 &#39;UTR/ORF603 en ORF 1629 en codeert voor een C-terminale His 6-label voor stroomafwaartse zuivering 29. 1. Insect Cel Cultuur en Onderhoud <ol><li> Vóór recombinant baculovirus amplificatie Spodoptera frugiperda cellen aangepast aan suspensiekweek (Sf9-cellen) tegekweekt en gehandhaafd. Insectencellen moet altijd worden behandeld met behulp van aseptische technieken in een speciale weefselkweek zuurkast. </li><li> Suspensiekweken van insectencellen geïncubeerd in Sf-900 II (SFM) serumvrij vloeibaar medium aangevuld met 100 ug / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine in kolven bij 27 ° C onder schudden bij 100 rpm. </li><li> Handhaaf het insect celkweek dichtheid tussen 1 x 06-01 oktober x 10 7 cellen / ml door het splitsen en verdunnen van de celkweek met verse Sf-900 II media. Opmerking: gezonde cellen moeten uniform kijken in grootte en bolvormig moet zijn. </li><li> Tel de cellen in een monstervolume behulp van een hemocytometer en lichtmicroscopie de cultuur celdichtheid berekend. </li></ol> 2. Generatie van recombinant Baculovirus <ol><li> Cultuur en handhaven Sf9 cellen in suspensie met Sf-900 II medium aangevuld met 100 ug / ml penicillin en 100 ug / ml streptomycine. Voor baculovirus generatie moet insectencellen worden gekweekt tot een dichtheid bereik van 5 x 05-1 oktober x 10 6 cellen / ml. </li><li> Zaad ongeveer 1 x 10 6 Sf9-cellen per putje van een steriele 6-well weefselkweek plaat in 2 ml Sf-900 II medium aangevuld met 100 ug / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Laat de Sf9-cellen bij kamertemperatuur in de zuurkast te houden aan de onderkant van de kunststof putjes en vormen een monolaag. </li><li> Voer recombinant baculovirus generatie door cotransfectie bacmide DNA en plasmide-DNA op monolaagkweek. <ol><li> Voor elke transfectie, meng 1-2 ug gezuiverd pOPINE-mFERMT3, die ORF1629 baculovirus elementen, met 0,5 ug gezuiverd BAC10 KO bezit: 1629 100 pl Sf-900 II SFM zonder antibiotica (oplossing A). </li><li> In een aparte buis, verdunnen 6 pi Cellfectin II reagens met 100 ul van Sf-900 II SFM zonder antibiotica voor elke transfectie reactie (oplossing B). Een &#39;master mix&#39; kan hier worden gemaakt, voor minder liquid handling, als er veel transfecties nodig. </li><li> Meng de twee oplossingen (A en B, ongeveer 200 pl) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min aan een lipide-DNA-complex. </li><li> Verdun de lipide-DNA complexen met 800 pl Sf-900 II SFM zonder antibiotica. Zuig voorzichtig de Sf9 celmonolaag media en voorzichtig pipet de oplossing A / B en de media op de top van de Sf9 monolaag. </li><li> Incubeer de getransfecteerde cellen in een bevochtigde incubator bij 27 ° CO / N en voeg nogmaals 1 ml Sf-900 II SFM zonder antibiotica elk monolaagkweek de volgende dag. Incubeer cellen bij 27 ° C nog eens 5 dagen. </li></ol></li><li> Oogst de recombinante baculovirus direct uit het kweekmedium (ongeveer 2 ml in totaal) en overbrengen in een schone centrifugebuis (bijvoorbeeld een 15 ml Falcon buis). <ol><li> Verduidelijken welke Sf9 cel Debrwordt door centrifugatie bij 1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng het virus, die in het resulterende supernatant en aangeduid P1, een schone buis en bewaar bij 4 ° C in het donker tot gebruik. In dit stadium de resterende Sf9 monolaag kunnen worden gebruikt om recombinante virusproductie evalueren door het bepalen van de aanwezigheid van recombinant kindlin-3 in insectencellen. </li></ol></li><li> Resuspendeer de monolaag met 0,5 ml PBS en verdun een 10 ul monster met gelijke volumes 2x SDS-PAGE laadbuffer. Verwarm de monsters bij&gt; 95 ° C gedurende ten minste 10 minuten. <ol><li> Ultrasone trillingen het monster gedurende 1 sec bij 10% amplitude behulp van een micro-sonicator tip als het te stroperig voor een goede gel laden. </li></ol></li></ol> 3. Amplificatie van recombinant Baculovirus <ol><li> Voor de amplificatie van virus in suspensie, gebruikt een celdichtheid van 1,4 x 10 6 cellen / ml en dit zou bezetten 1/20 van het totale volume kolf (bijvoorbeeld 50 ml cultuureen 2 L kolf). </li><li> Het bereiken van de amplificatie van het recombinant virus door het infecteren van de insecten celkweek met P1 virale voorraad bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,1 met de volgende formule; <img alt="" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51206/51206eq1.jpg" width="400" /> Opmerking: P1 virusproductie kan worden aangenomen dat een verwachte virale titer van 1 x 10 7 pfu / ml hebben. Toch kan een plaque assay worden uitgevoerd vóór deze fase. </li><li> Incubeer de P1-geïnfecteerde insectencellen kweek bij 27 ° C onder schudden bij 100 rpm gedurende 3 dagen (72 uur). </li><li> Oogst de virus door het scheiden van de cellen van het medium door centrifugatie bij 1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Bewaar de verkregen celpellet in dit stadium bevestiging van recombinante virusproductie door beoordeling kindlin-3-eiwit expressie door SDS-PAGE en western blotting. </li><li> Breng de geklaarde-virus verrijkte media een schone buis en bewaar bij 4 ° C inhet donker tot gebruik. Deze virale voorraad wordt aangeduid als P2. Opmerking: Een virale titer van 2 x 10 8 pfu / ml (of een versterking van 100 pve / cel) kan worden verwacht. </li></ol> 4. Expressie van kindlin-3 in Baculovirus-geïnfecteerde Sf9 <ol><li> Kweek een voldoende hoeveelheid Sf9-cellen kweken in suspensie in Sf-900 II SFM aangevuld met 100 ug / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, voor grootschalige recombinante kindlin-3 expressie voor zuivering. Incubeer de suspensie kweken bij 27 ° C onder schudden bij 100 rpm en met een totale kweekvolume: fles volumeverhouding van 01:05. </li><li> Infect suspensiekweken van Sf9 bij een dichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Supplement Sf9 kweken met een eindconcentratie van 1% (v / v) foetaal runderserum (FBS) gevolgd door versterkte recombinant virus (P2-virale stock) een MOI van 1 geven. Incubeer de geïnfecteerde kweken bij 27 ° C onder schudden bij 100 rpm. </li><li> Oogst recombinatient kindlin-3-CHIS 6-expressie Sf9-cellen 72 uur na infectie door centrifugeren bij 1000 xg &#160; en de resulterende celpellet opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik, of -80 ° C voor lange termijn opslag. </li></ol> 5. Zuivering van recombinant Kindlin-3 <ol><li> Dooi bevroren-baculovirus geïnfecteerde insecten cel (Sf9) pellets die recombinant kindlin-3 op het ijs. </li><li> Resuspendeer de ontdooide celpellet met lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 1% (v / v) Tween-20), aangevuld met EDTA-vrije proteaseremmer cocktail en 1000-2000 U van DNase1. Opmerking: Als alternatief kan gemodificeerd fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) ook worden gebruikt, wanneer de NaCl-concentratie aangepast tot 500 mM niet-specifieke interacties tussen endogene Sf9 cellen eiwitten en de geïmmobiliseerde metaal affiniteitskolom voor stroomafwaartse zuivering (zie hieronder) te voorkomen. </li><li> Lyseren de cellen door incubatie van de geresuspendeerde cellen met het wasmiddel en vortexing. Ultrasone trillingen (40% amplitude, 10 cycli van 10 seconden puls gevolgd door 10 seconden afkoeling) het monster voor verdere celdisruptie in een ijsbad of als alternatief een Dounce homogenisator. </li><li> Verduidelijken het lysaat door centrifugatie bij 48.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C. Laad het resulterende supernatant op een HisTrap kolom (5 ml kolomvolume), vooraf geëquilibreerd met lysisbuffer, bij 4 ° C met een snelheid van 1 ml / min. Opmerking: Als alternatief kan het geklaarde lysaat worden geïncubeerd met 1-5 ml bedvolume vooraf geëquilibreerd nikkel sepharose korrels (bijvoorbeeld Ni Sepharose 6 Fast Flow) bij 4 ° C gedurende 1-2 uur. Een kolom van Ni Sepharose kan worden gevormd na de bindingsstap door een kolom zwaartekracht. </li><li> Was de kolom met 10 kolomvolumes wasbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazool) om ongebonden eiwitten te verwijderen. </li><li> Gebruik een lineaire gradiënt imidazool 10-500 mM met een snelheid van 10 mM / ml (of 10 kolomvolumes) met een AKTA FPLC te eluerende gebonden recombinant kindlin-3-CHIS 6. </li><li> Fractioneren de elutie in 0,5-1 ml fracties met de Akta FPLC met die fracties die kindlin-3-CHIS 6 gewoonlijk geëlueerd bij een imidazool concentratie van 300 mM. </li><li> Beoordeel de eiwitsamenstelling van het elutiemiddel door SDS-PAGE en voor eerste zuiveringen bevestigd door Western blotting met anti-His6 antilichaam of anti-muis kindlin-3 antilichaam. </li><li> Voeg de fracties die kindlin-3 en buffer uitwisseling in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl via een reeks verdunningen in buffer en monsterconcentraties met een centrifugale concentrator eiwit met een 50 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) bij 4 ° C. Opmerking: Als alternatief dialyseer de eiwitoplossing met Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette met een MWCO van 30 kDa bij 4 ° C gedurende 4 uur tot O / N in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl. Opmerking: voor ionenwisseling (zie hieronder) een lagere concentratie van NaCl, <em&gt; ie 50 mm, en is gebruikt voor deze stap. </li><li> Breng de buffer uitgewisseld eiwitoplossing op een vooraf geëquilibreerd HiTrap heparine HP kolom (5 ml kolomvolume) met een AKTA FPLC met een snelheid van 0,5 ml / min. Opmerking: Het gebonden kindlin-3 wordt geëlueerd met een lineaire NaCl gradiënt (0,2 M NaCl tot 1 M NaCl) in dezelfde buffer verhogen met een snelheid van 10 mM / ml. Kindlin-3-CHIS6 verwacht wordt te elueren bij ongeveer 0,6 M NaCl. </li><li> Fractioneren de elutie in 0,5-1 ml fracties en de eiwitsamenstelling door SDS-PAGE en western blotting beoordelen, indien van toepassing. Opmerking: men kan een eiwitzuiverheid van bijna 95% verwacht, zoals bepaald door SDS-PAGE. </li><li> Pool fracties die kindlin-3 en concentraat met een centrifuge concentrator eiwit met een 50 kDa MWCO tot een uiteindelijk volume van 0,5-2 ml. </li><li> In een laatste stap, polijst de geconcentreerde proteïneoplossing en bufferuitwisseling het eiwit met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). <ol><li> Breng het gezuiverde eiwit op een Superdex S200 (16/60) of (10/30) vooraf geëquilibreerd in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM DTT met een snelheid van 1 ml / min of 0,5 ml / min afhankelijk kolomgrootte gebruikt. Opmerking: Gelpermeatiechromatografie ook in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) worden uitgevoerd indien nodig. </li><li> Zuiver de eiwitten op grootte door toepassing van buffer op de kolom met een snelheid van 1 ml / min of 0,5 ml / min, afhankelijk kolomgrootte gebruikt. Opmerking: Het eiwit geëlueerd uit de kolom gefractioneerd en gecontroleerd met behulp van de absorptie bij 280 nm. </li><li> Een absorptiepiek worden verwacht van SEC, die gefractioneerd en beoordeeld door SDS-PAGE om homogeniteit te bepalen, en is typisch&gt; 95% zuiver na deze stap. </li></ol></li><li> Concentreer het gezuiverde kindlin-3-CHIS 6 middels een centrifuge concentrator eiwit met een 50 kDa MWCO naar ~ 15 mg / ml, zoals spectrofotometrisch met een berekende extinctiecoëfficiënt (ε) van 109.320 M-1 cm -1 &lt;/ Sup&gt; (ervan uitgaande dat alle cysteïne-residuen worden verkleind). </li><li> Voor opslag bij -20 ° C en lange termijn opslag bij -80 ° C, de hoeveelheid eiwit in PCR buizen en flash-bevriezen de monsters in vloeibare stikstof. Als alternatief kan het eiwit direct worden gebruikt voor onderzoek met een aantal biochemische en biofysische technieken. </li></ol>

<ol><li>Moser, M., Legate, K. R., Zent, R., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tail+of+integrins%2C+talin%2C+and+kindlins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The tail of integrins, talin, and kindlins.</a> Science. 895, 899(2009).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin+2+forms+a+transcriptional+complex+with+%CE%B2-catenin+and+TCF4+to+enhance+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Kindlin 2 forms a transcriptional complex with β-catenin and TCF4 to enhance Wnt signalling.</a> EMBO Rep. 13, 750-758 (2012).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin+2+promotes+breast+cancer+invasion+via+epigenetic+silencing+of+the+microRNA200+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Kindlin 2 promotes breast cancer invasion via epigenetic silencing of the microRNA200 gene family.</a> Int J Cancer. , (2013).</li>
<li>Meves, A., Stremmel, C., Gottschalk, K., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kindlin+protein+family%3A+new+members+to+the+club+of+focal+adhesion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Kindlin protein family: new members to the club of focal adhesion proteins.</a> Trends Cell Biol. 19, 504-513 (2009).</li>
<li>Siegel, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+kindlin-1%2C+a+human+homolog+of+the+Caenorhabditis+elegans+actin-extracellular-matrix+linker+protein+UNC-112%2C+causes+Kindler+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss of kindlin-1, a human homolog of the Caenorhabditis elegans actin-extracellular-matrix linker protein UNC-112, causes Kindler syndrome.</a> Am. J. Hum. Genet. 73, 174-187 (2003).</li>
<li>Hart, R., Stanley, P., Chakravarty, P., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kindlin+3+PH+domain+has+an+essential+role+in+integrin+LFA-1-mediated+B+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The kindlin 3 PH domain has an essential role in integrin LFA-1-mediated B cell adhesion and migration.</a> J. Biol. Chem. , (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+phosphoinositide+binding+to+Kindlin-2+pleckstrin+homology+domain+in+regulating+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis of phosphoinositide binding to Kindlin-2 pleckstrin homology domain in regulating integrin activation.</a> J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).</li>
<li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin-2+regulates+podocyte+adhesion+and+fibronectin+matrix+deposition+through+interactions+with+phosphoinositides+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Kindlin-2 regulates podocyte adhesion and fibronectin matrix deposition through interactions with phosphoinositides and integrins.</a> J. Cell Sci. 124, 879-891 (2011).</li>
<li>Yates, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Functional+Characterisation+of+the+Kindlin-1+Pleckstrin+Homology+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural and Functional Characterisation of the Kindlin-1 Pleckstrin Homology Domain.</a> J. Biol. Chem. 287, 43246-43261 (2012).</li>
<li>Bouaouina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+lipid-binding+loop+in+the+kindlin+FERM+F1+domain+is+required+for+kindlin-mediated+%CE%B1IIb%CE%B23+integrin+coactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A conserved lipid-binding loop in the kindlin FERM F1 domain is required for kindlin-mediated αIIbβ3 integrin coactivation.</a> J. Biol. Chem. 287, 6979-6990 (2012).</li>
<li>Goult, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+N-terminus+of+kindlin-1%3A+a+domain+important+for+AlphaIIbBeta3+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure of the N-terminus of kindlin-1: a domain important for AlphaIIbBeta3 integrin activation.</a> J. Mol. Biol. 394, 944-956 (2009).</li>
<li>Yates, L. A., Fuzery, A. K., Bonet, R., Campbell, I. D., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+Analysis+of+Kindlin-3+Reveals+an+Elongated+Conformation+and+Maps+Integrin+Binding+to+the+Membrane-Distal+%CE%B2-Subunit+NPXY+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biophysical Analysis of Kindlin-3 Reveals an Elongated Conformation and Maps Integrin Binding to the Membrane-Distal β-Subunit NPXY motif.</a> J. Biol. Chem. 287, 37715-37731 (2012).</li>
<li>Anthis, N. J., Campbell, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tail+of+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">The tail of integrin activation.</a> Trends Biochem. Sci. 36, 191-198 (2011).</li>
<li>Harburger, D. S., Bouaouina, M., Calderwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin-1+and+-2+directly+bind+the+C-terminal+region+of+beta+integrin+cytoplasmic+tails+and+exert+integrin-specific+activation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Kindlin-1 and -2 directly bind the C-terminal region of beta integrin cytoplasmic tails and exert integrin-specific activation effects.</a> J. Biol. Chem. 284, 11485-11497 (2009).</li>
<li>Tadokoro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talin+binding+to+integrin+beta+tails%3A+a+final+common+step+in+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Talin binding to integrin beta tails: a final common step in integrin activation.</a> Science. 302, 103-106 (2003).</li>
<li>Garcia-Alvarez,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+integrin+recognition+by+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of integrin recognition by talin.</a> Mol. Cell. 11, 49-58 (2003).</li>
<li>Perera, H. D., Ma, Y. Q., Yang, J., Hirbawi, J., Plow, E. F., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+binding+of+the+N-terminal+ubiquitin-like+domain+of+kindlin-2+is+crucial+for+its+regulation+of+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Membrane binding of the N-terminal ubiquitin-like domain of kindlin-2 is crucial for its regulation of integrin activation.</a> Structure. 19, 1664-1671 (2011).</li>
<li>Ussar, S., Wang, H. V., Linder, S., Fassler, R., Moser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kindlins%3A+subcellular+localization+and+expression+during+murine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Kindlins: subcellular localization and expression during murine development.</a> Exp. Cell Res. 312, 3142-3151 (2006).</li>
<li>Bialkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+integrin+co-activator+Kindlin-3+is+expressed+and+functional+in+a+non-hematopoietic+cell%2C+the+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The integrin co-activator Kindlin-3 is expressed and functional in a non-hematopoietic cell, the endothelial cell.</a> J. Biol. Chem. 285, 18640-18649 (2010).</li>
<li>Moser, M., Nieswandt, B., Ussar, S., Pozgajova, M., Fassler, R. Kindlin-3 is essential for integrin activation and platelet aggregation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoser%2C+M+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 14, 325-330 (2008).</li>
<li>Lefort, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+talin-1+and+kindlin-3+in+LFA-1+extension+and+affinity+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation.</a> Blood. 119, 4275-4282 (2012).</li>
<li>Moser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin-3+is+required+for+beta2+integrin-mediated+leukocyte+adhesion+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Kindlin-3 is required for beta2 integrin-mediated leukocyte adhesion to endothelial cells.</a> Nat. Med. 15, 300-305 (2009).</li>
<li>Schmidt, S., Nakchbandi, I., Ruppert, R., Kawelke, N., Hess, M. W., Pfaller, K., Jurdic, P., Fassler, R., Moser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin-3-mediated+signaling+from+multiple+integrin+classes+is+required+for+osteoclast-mediated+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kindlin-3-mediated signaling from multiple integrin classes is required for osteoclast-mediated bone resorption.</a> J. Cell Biol. 192, 883-897 (2011).</li>
<li>Malinin, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point+mutation+in+KINDLIN3+ablates+activation+of+three+integrin+subfamilies+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A point mutation in KINDLIN3 ablates activation of three integrin subfamilies in humans.</a> Nat. Med. 15, 313-318 (2009).</li>
<li>Svensson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion+deficiency-III+is+caused+by+mutations+in+KINDLIN3+affecting+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion deficiency-III is caused by mutations in KINDLIN3 affecting integrin activation.</a> Nat. Med. 15, 306-312 (2009).</li>
<li>Liu, Y., Zhu, Y., Ye, S., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+kindlin-2+PH+domain+reveals+a+conformational+transition+for+its+membrane+anchoring+and+regulation+of+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of kindlin-2 PH domain reveals a conformational transition for its membrane anchoring and regulation of integrin activation.</a> Protein Cell. 3, 434-440 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+phosphoinositide+binding+to+kindlin-2+protein+pleckstrin+homology+domain+in+regulating+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis of phosphoinositide binding to kindlin-2 protein pleckstrin homology domain in regulating integrin activation.</a> J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).</li>
<li>Zhao, Y., Chapman, D. A., Jones, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+baculovirus+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improving baculovirus recombination.</a> Nucleic Acids Res. 31, (2003).</li>
<li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+ligation-independent+cloning+method+suitable+for+high-throughput+expression+screening+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications.</a> Nucleic Acids Res. 35, 45 (2007).</li>
<li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J Struct. Biol. 172, 55-65 Forthcoming.</li>
<li>Wasilko, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+%28TIPS%29+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+%28sGC%29+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65, 122-132 (2009).</li>
<li>Yates, L. A., Fleurdépine, S., Rissland, O. S., De Colibus, L., Harlos, K., Norbury, C. J., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+the+activity+of+a+cytoplasmic+RNA+terminal+uridylyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for the activity of a cytoplasmic RNA terminal uridylyl transferase.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 782-787 (2012).</li>
<li>Sainsbury, S., Ren, J., Saunders, N. J., Stuart, D. I., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+CrgA%2C+a+LysR-type+transcriptional+regulator+from+pathogenic+Neisseria+meningitidis+MC58%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+F.+Struct.+Biol.+Cryst.+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray analysis of CrgA, a LysR-type transcriptional regulator from pathogenic Neisseria meningitidis MC58.</a> Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 797-801 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+adhesion+and+migration+by+Kindlin-3+cleavage+by+calpain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell adhesion and migration by Kindlin-3 cleavage by calpain.</a> J. Biol. Chem. 287, 40012-40020 Forthcoming.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Baculovirusexpressiesysteem systemen worden steeds populairder en een belangrijk instrument voor de productie van milligram hoeveelheden recombinant eiwit voor eiwit karakterisering door middel van biofysische studies, waaronder X-ray kristallografie. Ondanks het feit dat meer experimenteel eist de baculovirusexpressie systemen bieden een aantal voordelen ten opzichte van E. coli waarvan er een bijna-natieve omgeving voor proteïnen van eukaryote oorsprong zoals de aanwezigheid van geschikte chaperonnes en kansen voor post-translationele modificatie. In onze eigen inspanningen om kindlin-3 te drukken, werden alternatieve uitdrukking gastheren gebruikt, waaronder zoogdieren cellijnen en bacteriële expressie stammen (ongepubliceerde waarnemingen). Algemeen de vele E. coli-stammen getest geproduceerd zeer kleine hoeveelheden recombinant kindlin-3 (~ 0,5 mg / L van cultuur, ongepubliceerde waarnemingen). De baculovirus-gedreven expressie in insectencellen was bijzonder doeltreffend en in samenwerkingmparison om tijdelijke expressie in zoogdiercellen ontvankelijker voor het genereren van de grote benodigde biomassa voor het isoleren van een milligram recombinante cytoplasmatische eiwitten (ongepubliceerde waarnemingen). We speculeren dat de aanwezigheid eukaryote chaperonnes de efficiënte productie van kindlin-3 kunnen toestaan. De baculoviridae infecteren insectencellen en voor recombinante eiwitexpressie het baculovirus gebruikt in dit werk is gebaseerd op het Autographa californica nucleaire polyhedrosisvirus (AcNPV). In de natuur is de AcNPV, die de Autographa californica (alfalfa takkenschaar) insectenlarven infecteert, vereist de polyhedrine eiwit aan afsluitingen waarbij de vironen zijn ingekapseld in een kristallijne eiwitmatrix aldus de nodige bescherming van hun vrijlating te vormen. In gekweekte cellen de vorming van occlusielichamen is niet vereist voor replicatie en derhalve overbodig. Bij expressie vreemde eiwitten kan de polyhedrine eiwit gen zijn replaced in een recombinant AcNPV met het gen voor het eiwit van belang. AcNPV kunnen andere lepidopteron diersoorten infecteren en voor de toepassing van recombinante eiwitexpressie army worm Spodoptera frugiperda popstadium ovariumcellen gebruikt. In de hier geschetste benadering, wordt de AcNPV bacmide (BAC10) zo gebouwd dat een essentieel viraal gen, ORF1629, wordt geïnactiveerd door toevoeging van chloramfenicol acetyl transferase resulteert in een knock-out bacmide (BAC10: KO 1629), zodat het niet infectieuze baculovirions 28 vormen. Cotransfectie van Sf9 cellen met gelineariseerd BAC10: KO 1629 en FERMT3-bevattende transfervector herstelt de inactieve ORF1629, door omzetting, wat resulteert in een levensvatbaar genoom die ook is opgenomen de FERMT3 gen onder de controle van de polyhedrine promoter 28. We beschrijven een zuivering protocol voor de isolatie van zeer zuivere recombinant muis kindlin-3 via een three stap chromatografische aanpak. De hier gebruikte methode kan gemakkelijk worden toegepast op andere His-gemerkte eiwitten. We gebruikten een ionenuitwisseling stap kindlin-3 verder te zuiveren maar wij geloven dat dit een verdere pseudo-affiniteit stap als kindlin-3 bezit een groot aantal basische residuen, waaronder een poly-lysine rek binnen de F1 domein. Bovendien wordt kindlin-3 geacht te binden aan en interactie met de cytoplasmatische zijde van de plasmamembraan, waar het functioneert en derhalve voorspellen wij dat de clustering van basische resten zal het eiwit aan het negatief geladen membraan tegen te gaan. De bij de zuivering protocollen beschreven buffers standaard beschouwd en worden vaak gebruikt in structurele biologie. De thermofluor assay (figuur 5) toont aan dat kindlin-3 stabiel meeste bufferomstandigheden boven pH 6,0. Dit was bijzonder nuttig en belangrijk voor het informeren van onze experimenten bij het bestuderen kinldin-3: β1Een staart interactie met NMR, die uitstekende spectra leverde bij een pH van 6,1 met lage concentraties van NaCl 12. Voordat een biofysische onderzoek kan worden uitgevoerd, is het belangrijk aan te tonen dat het gezuiverde eiwit van belang inderdaad correct gevouwen en is functioneel actief. In een eerdere publicatie toonden we aan dat de recombinante kindlin-3 tot expressie gebracht en gezuiverd met behulp van deze methode een monomeer en monodispers in oplossing, zoals bepaald door grootte-uitsluitingschromatografie, dynamische lichtverstrooiing, analytische ultracentrifugatie en kleine hoek X-ray scattering en was ook in staat te binden en het herkennen van de membraan-distale NPxY en upstream Serine / Threonine cluster van β 1A cytoplasmatische staarten 14, hetgeen bevestigt dat het zich gedraagt ​​als het natieve eiwit, hetgeen in lijn is met eerdere cellulaire en fysiologische studies 14,20,22. Het gebruik van een thermische stabiliteit test is een extra manier suggereren ee juiste vouwing van een eiwit van belang, zoals verkeerd gevouwen eiwitten leidt tot een hoge fluorescentie due blootgestelde hydrofobe residuen. De kindlin familie van eiwitten is de focus van veel aandacht sinds hun onverwachte rol als essentiële coactivatoren van integrines in vivo werd ontdekt. Dit heeft veel moeite om ze op recombinante uiten en op te lossen hun structuren geactiveerd. Tot op heden beperkt succes gemeld in expressie milligram hoeveelheden van volledige lengte recombinant eiwit maar we hebben beschreven het gebruik van een baculovirus systeem dat grootschalige expressie maakt in zodanige hoeveelheden dat structurele studies worden overgegaan. Door het genereren van grote hoeveelheden recombinant kindlin-3 verwachten we dat deze verdere studies van dit eiwit zal helpen. De baculovirus-gedreven weg en zuivering workflow beschreven voor recombinant muizen kindlin-3 kan ook worden gebruikt om de andere kindlin isovormen tot expressie en zuiveren, Die ook moeilijk uit te drukken en ook beschikken polylysine stukken en kan verder worden aangepast voor andere cytoplasmatische eiwitten, zoals nucleïnezuur-bindende eiwitten, die niet tot expressie in bacteriële stammen.

Eiwitten van de kindlin familie zijn een cruciaal onderdeel van focale adhesie assemblage, en dus essentieel voor complexe levensvormen. Kindlins, waarvan er 3 isovormen bij zoogdieren (kindlin-1, kindlin-2 en kindlin-3), beschouwd coactivatoren van de extracellulaire receptoren integrinen naast talin 1. Integrine gemedieerde celadhesie verbindt het celoppervlak aan de extracellulaire matrix (ECM) in hogere eukaryoten. Het is een kritische en gemeenschappelijk proces in een overvloed van fysiologische verschijnselen die weefsel integriteit, embryogenese, botmetabolisme, hemostase en immuniteit omvatten. Integrine-gemedieerde cel adhesie wordt geactiveerd via inside-out signaaltransductie via de binding van talin en kindlin de integrine β-subunit cytoplasmatische staart (CT) bij hun geconserveerde NPxY motieven. De biomedisch belang van kindlin eiwitten strekt echter tot aan de kern, waar kindlin-2 is aangetoond in verscheidene recente verslagen worden betrokken bij transcriptieal. controleren 2,3. Kindlins zijn multidomein eiwit van ongeveer 75 kDa, gemerkt door het bezit van een tweedelige C-terminale FERM (4.1 band, Ezrin, radixin, Moesin) domein, dat wordt onderbroken door een pleckstrine homologie (PH) domein in het midden van de F2 subdomein 4,5. Studies van de kindlin-2 en kindlin-3 PH domeinen aangetoond dat het bindt aan de lipide second messengers fosfatidylinositol-(3,4,5)-trifosfaat en fosfatidylinositol-(4,5)-bisfosfaat 6-8. Echter, studies van de kindlin-1 PH domein blijkt dat het bindt aan Ptdlns (3,4,5) P3 met een veel lagere affiniteit, die kindlin-1 kan worden verklaard door een isoform-specifieke zoutbrug voorkomen lipiden binden 9. Daarnaast is er een ~ 100 aminozuur lus ingebracht in de F1 domein van de kindlins die voorspeld worden uitgevouwen maar bindt aan fosfatidylserine in de binnenste leaflet van de plasmamembraan 10,11. De kindlin FERMdomein wordt beschouwd homoloog is met de talin FERM domein, hoewel de talin FERM domein geen pleckstrin homologie domein bezitten. Zowel kindlins en talin interactie met NPxY motieven op de integrine β-staarten via de F3 regio hun FERM domein, maar kindlin bindt aan het membraan distale motief, terwijl talin richt zich op de membraan proximale een 12-16. Kindlins en talin zowel bovendien beschikken over een N-terminale domein F0 met een ubiquitine-achtige factor die niet wordt gevonden in andere FERM eiwitten 11,17. Studies over de F0 domein van kindlin-2 hebben aangetoond dat het onafhankelijk bindt aan fosfatidylinositol-(4,5)-bisfosfaat verrijkte membranen 17. De kindlins vertonen paraloog-specifiek weefsel expressie patronen en niet-redundante fysiologische functies. Kindlin-1 wordt hoofdzakelijk uitgedrukt in de epidermis, maar in mindere mate de dikke darm, maag en nieren kindlin-2 alomtegenwoordig uitgedrukt, maar is geconcentreerd in gestreepte gladspier en is het enige kindlin uitgedrukt in embryonale ontwikkeling 4, en kindlin-3 wordt uitgedrukt in de hematopoietische weefsels met de hoogste concentratie van kindlin-3 in megakaryocyten 18. Echter, meer recente studies gesuggereerd dat functioneel eiwit wordt uitgedrukt in endotheliale weefsels en 19. Kindlin-3 is van acute medisch belang vanwege de belangrijke fysiologische rol in het bloed. Het is van cruciaal belang voor de aggregatie van bloedplaatjes en verspreiden tijdens trombusvorming 20, leukocyten rollen in reactie op infecties en ontstekingen 21,22 en osteoclasten podocyte formatie in botresorptie 23. Bovendien, uitputting van kindlin-3 bij de mens leidt tot leukocytadhesie deficiëntie type III - een ziekte die wordt gekenmerkt door levensbedreigende bloeden stoornissen en terugkerende bacteriële infecties 20,24,25. Kindlin-3 knock-out studies bij muizen lieten de cruciale functie van het eiwit incel adhesie KIND3 -. / - muizen tonen verschillende fenotypes, zoals ernstige bloeden als gevolg van inactieve bloedplaatjes integrines, ernstige osteopetrosis, en verminderde leukocytenadhesie 20,22, lijkt op de symptomen bij de mens ontbreekt kindlin-3. Structurele gegevens met een hoge resolutie op de kindlins, tot op heden, is beperkt tot individuele subdomeinen zoals de pleckstrine homologie (PH) domein van kindlin-1 9 en kindlin-2 26,27 en de F0 domein van kindlin-1 11 en kindlin -2 17. De meeste subdomeinen van elke kindlin polypeptide hebben echter tegengegaan klonering en structuuranalyse (Yates en Gilbert, ongepubliceerde waarnemingen), en studies van de volledige lengte eiwitten zijn gehinderd door de moeilijkheid expressie en zuiveren voldoende hoeveelheden met E. coli (ongepubliceerde observaties en Harburger et al.. 14). Er is een grote medische belangstelling kindlin-3 en de functies, samen met de twee andere familieleden, en recent bekomen we milligram hoeveelheden door recombinante expressie in Spodopterafrugiperda cellen gedreven door baculovirus infectie 12. Daarom hier beschreven werkwijzen voor de productie van milligram hoeveelheden recombinant muis kindlin-3 in insecten celkweek, voor uitgebreide structurele studies en biochemische analyse. In dit protocol maken we gebruik van een aangelegde knockout bacmide (BAC10 KO: 1629) dat is, alleen, niet levensvatbare virions 28 produceren. Het virale DNA wordt dus gered door recombinatie met een transfer vector die in dit geval ook de kindlin-3 gen (FERMT3) en resulteert in de FERMT3 gen vervangt het virus zeer laat gen, die sterk tot expressie maar overbodig, waardoor een recombinant virus die muis kindlin-3 tot expressie als deel van de viruslevenscyclus 28. Wij deze geïdentificeerdWerkwijze voor de productie van kindlin-3 na pogingen te drukken en te zuiveren in andere expressiegastheren bleek bijzonder ingewikkeld (ongepubliceerde waarnemingen), maar ook door de veelzijdigheid van de Popin vector suite, die we gebruikten voor het kloneren en die geïmplementeerd in vele expressie hosts 29.

<table><tbody><tr><td>Sf-900 II serum free media (SFM) 1x liquid</td><td>Life Technologies</td><td>10902-096</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C en verwarm tot RT voor gebruik</td></tr><tr><td>Cellfectin II Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Alternatief kan GeneJuice transfectie (EMD) reagens worden gebruikt</td></tr><tr><td>Streptomycinesulfaat (solid)</td><td>Melford</td><td>S0148</td><td>Steriseer filter (0.22 &mu;m filter) voor gebruik</td></tr><tr><td>Penicilline G, kaliumzout (solid)</td><td>Melford</td><td>P0580</td><td>Steriseer filter (0.22 &mu;m filter) voor gebruik</td></tr><tr><td>CELLSTAR Sterile 6-well Cultuurplaat</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10100-147</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8849</td><td>Let op: Protease remmers zijn opgelost in DMSO</td></tr><tr><td>Bovine pancreas deoxyribonuclease (Dnase) I&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap FF (5 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5286-01</td><td>Vereist een &Auml;kta FPLC machine</td></tr><tr><td>HiTrap Heparine (5 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0407-01</td><td>Vereist een &Auml;kta FPLC machine</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugaal Filter Units (met Ultracel-50 membraan)</td><td>Millipore</td><td>UFC905024</td><td>15 ml capaciteit en een MWCO van 50 kDa eiwit concentrator</td></tr></tbody></table>

efficiënte productie en zuivering van recombinant muizen kindlin-3 uit insect cellen voor biofysische studies

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins essentieel coactivatoren met talin van het celoppervlak receptoren integrinen ook deelnemen aan integrine buiten in signalering en controle van gentranscriptie in de celkern. De kindlins zijn ~ 75 kDa multidomein eiwitten en binden aan een NPxY motief en upstream T / S cluster van de integrine β-subunit cytoplasmastaart. De hematopoietically allerbelangrijkste kindlin isovorm, kindlin-3, is van cruciaal belang voor de aggregatie van bloedplaatjes bij thrombusvorming, leukocyten rollen in reactie op infecties en ontstekingen en osteoclasten podocyte formatie in botresorptie. Rol Kindlin-3 in deze processen heeft geresulteerd in een uitgebreide cellulaire en fysiologische studies. Er is echter behoefte aan een efficiënte werkwijze van het verwerven van hoge kwaliteit milligram hoeveelheden van het eiwit voor verdere studies. Wij hebben een protocol ontwikkeld, hier beschreven voor de efficiënte expressie en zuivering van recombinant murine kindlin-3 door gebruik van een baculovirus-dverscheurd expressiesysteem in Sf9-cellen waarbij voldoende hoeveelheden zeer zuiver eiwit met volledige lengte zijn biofysische karakterisering mogelijk. Dezelfde benadering is mogelijk in de studie van andere zoogdieren kindlin isovormen.

De grootschalige expressie van recombinant muizen kindlin-3 met baculovirus geïnfecteerde Sf9 cellen minder dan twee weken te milligram hoeveelheden bereiken, zoals geïllustreerd in het schematische figuur 1A en vereist slechts een kleine hoeveelheid plasmide DNA van een QIAprep Miniprep kit voor voorbeeld. Het genereren van recombinant baculovirus wordt verkregen door cotransfectie van Sf9 cellen met muis kindlin-3 (FERMT3) bevattende plasmide met een aangelegde gelineariseerd bacmide (BAC10: KO 1629) en oogsten van de nieuw gevormde virions na 5-7 dagen, zie figuur 1A. Deze methode van baculovirus generatie resulteert in 100% recombinante virussen en wezen verdeelt de noodzaak van plaquezuivering 28,30. Een representatieve kleinschalige (2 ml monolaag) cultuur dan ook een recombinant-virus bevattende oplossing met een verwachte virale titer van 1 x 10 7 plaque-vormende eenheden (PFU) per ml genererencultuur. Men kan een plaque assay het werkelijke virale titer te bepalen, maar dit is misschien te arbeidsintensief wanneer een groot aantal constructen getest voor structurele studies. Het succes van de virusproductie stap kan worden beoordeeld door toepassing van een eGFP-bevattend plasmide in parallel, of deze kindlin 3-construct kan het Sf9 monolaag worden geresuspendeerd in PBS en beoordeeld door SDS-PAGE en Western blotting, die typisch aantoont een duidelijke band die overeenkomt met een 75 kDa His-gelabeld eiwit, zoals weergegeven in figuur 1B. Virus vervolgens geamplificeerd voldoende hoeveelheden grootschalige (liter volumes) insectencel infectie recombinant eiwit isolation generate. De tweede doorgang virus (P2) wordt opgewekt door het infecteren suspensiekweken voor een MOI van 0,1 (zie protocol). Het is essentieel dat de versterking Sf9 suspensiecultuur neemt slechts een twintigste van de totale kolfvolume. Deze extra beluchting zodat de resulterende virus-bevattende media, geoogst na 3 dagen (72 uur) na infectie voldoende hoeveelheden kindlin-3 te genereren in de daaropvolgende expressie cultuur. De geamplificeerde virusvoorraad (P2) wordt aangenomen dat een verwachte virale titer van 2 x 10 8 pfu / ml gebaseerd op een conservatieve schatting van 100 pfu / cel met een celdichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml tijdens de amplificatie 31 bezitten. In het algemeen, voor optimale baculovirus amplificatie en eiwitproductie, de Sf9 cellen moet uniform zijn in grootte en sferische, zoals weergegeven in figuur 1C. Bovendien virale amplificatie en eiwitexpressie is maximaal bij 72 uur na infectie, en beide aanzienlijk gereduceerd bij 96 uur na infectie. Wanneer virus is geamplificeerd en gebruikt om Sf9-cellen te infecteren in grootschalige experimenten recombinant kindlin-3 wordt gedeeltelijk gezuiverd door zijn gemodificeerde C-terminale His 6-tag met geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie, zoals weergegeven in figuur 2. Het is belangrijk om de zuivering uit te voeren bij 4 ° C en voldoende proteaseremmers toegevoegd om proteolyse te voorkomen. De gedeeltelijk gezuiverde kindlin-3 wordt verder gezuiverd tot bijna homogeen door ionenuitwisselingschromatografie (IEC) met een heparine-kolom, zoals getoond in figuur 3. We gebruikten het gebruik van een heparine-kolom in plaats van een conventionele ionische uitwisselende kolom, zoals we voorspelden dat het grote aantal basische residuen, waaronder een poly-lysine rek in de kindlin-3 F1 domein, zou sterk interageren met de negatief geladen sulfaatgroepen van de kolom. Deze strategie is bijzonder nuttig voor DNA-en RNA-bindende eiwitten met basisch nucleïnezuur-bindende pleisters, bijvoorbeeld de RNA-bindende terminal uridylyltransferase Cid1 32. Tenslotte kindlin-3 zuiverheid &quot;gepolijst&quot; door size exclusion chromatografie om aggregaten te verwijderen en homogeniteit, zoals weergegeven inFiguur 4. De in de protocollen buffers standaard buffers veelvuldig bij eiwitzuivering voor structurele analyse. In het algemeen worden fosfaathoudende buffers vermeden voor het zuiveren van eiwitten voor structurele studies, vooral kristallisatie screening door de vorming van fosfaat kristallen in de kristallisatie druppels (met name voor experimenten bij 4 ° C). Echter, hebben we een Thermofluor gebaseerde thermische shift assay te bepalen welke buffers stabiliserende voor kindlin-3, zoals getoond in figuur 5. In het kort wordt een gezuiverde eiwitoplossing verdund in buffer die een bereik van pH en natriumchloride concentraties omvatten derhalve de vorming van een 2-dimensionaal scherm. Het smelten van het eiwit wordt gemeten door het observeren van de fluorescentie van Sypro oranje kleurstof (Molecular Probes), dat bindt aan hydrofobe resten in het gevouwen eiwit kern, het temperatuurbereik 20-95 ° C (293-368 K). De temperatuur midden-punt waarbij ee eiwit ontvouwt (transitie temperatuur, T m) werd berekend met de Opticon Monitor-software en wordt elders 33 beschreven. Kindlin-3 waargenomen stabiel bij hoge concentraties natriumchloride (500 mM) in het pH-traject 7,0-9,0, met een constante temperatuur (Tm) van 55 ° C. Er werd ook waargenomen dat de Tm van Kindlin-3 ongeveer 55 ° C binnen het pH-bereik 7,0-7,5 ongeacht natriumchloride concentratie. We vonden dat er beperkte proteolyse van kindlin-3 tijdens de zuivering, maar SDS-PAGE-analyse van sterk geconcentreerde eiwit (~ 15 mg / ml) vertoonde weinig verontreiniging met twee extra polypeptiden van gelijke intensiteit. Vreemd, maar er is geen indicatie van aanvullende soorten van gelpermeatiechromatografie, zoals weergegeven in figuur 4. Derhalve wordt gedacht dat het eiwit inkepingen door proteasen maar gevouwen blijft en hydrodynamically onderscheiden van eiwit van volledige lengte. Interessant Calpaïne is een protease dat bekend splitst kindlin-3 in Tyrosine373, die in de β1 β2-lus van het pleckstrine homologie (PH) domein 34 en kunnen onze waarnemingen verklaren. Bovendien western blotting blijkt dat een van de polypeptide doubletten bezit een C-terminale His-tag en het schijnbare molecuulgewicht van het doublet, wanneer opgeteld, evenaart 75 kDa, hetzelfde molecuulgewicht als het natieve eiwit. De opbrengst aan gezuiverd recombinant kindlin-3 per liter Sf9-cellen (~ 2 g celgewicht) is hooguit 5 mg. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1.jpg" /> Figuur 1. Overzicht van baculovirus-geïnfecteerde insectencel heterologe eiwitexpressie. (A) een schematisch overzicht van baculovirus generation en expressie van kindlin-3 in Sf9 cellen. In de DNA-vector schema, wordt 5&#39;UTR / ORF603 gekleurd in rood, de ORF1629 is gekleurd in groen en het gen van het eiwit van interesse (POI) is blauw gekleurd. (B) Western blot, gebruik van een anti-His 6 antilichaam, van zes kleinschalige (2 ml monolaag) culturen (lanen geëtiketteerd volgens de cultuur) van Sf9 cellen die recombinant baculovirus en recombinant muizen kindlin-3. (C) Lichtmicroscopie beeld van gezonde Sf9-cellen gekweekt in suspensie in Sf-900 II SFM aangevuld met antibiotica en overgebracht naar een 35 mm well weefselkweek schaal (zie protocol). Afbeelding is 20x vergroting. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2.jpg" /> Figuur 2. VERTEGEntative zuivering van kindlin-3 door geïmmobiliseerde metaal affiniteitschromatografie (IMAC). SDS-PAGE nikkel affiniteit gezuiverd recombinant murine kindlin-3 expressie in met baculovirus geïnfecteerde Sf9-cellen (~ 2 g celgewicht). Geadsorbeerde eiwit werd geëlueerd met een gradiënt imidazool (boven de gel getoond). Lanen zijn als volgt gemerkt; MW, molecuulgewichtmerker, Lys, geheel cellysaat, FT, stromen door (ongebonden), WI, wassen 1, WII, wassen 2. Western blot analyse (onder) werd ook uitgevoerd met behulp van de elutiefracties om de aanwezigheid van de kunstmatige His-tag op het recombinante eiwit te bevestigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3.jpg" /> Figuur 3. Vertegenwoordiger zuivering van kindlin-3 door Heparine Affinity Chromatography. (A) Elutieprofiel waargenomen bij 280 nm (blauw) het weergeven van een enkele symmetrische piek eluting onder een lineaire natriumchloridegradiënt (groen) met behulp van de NaCl-concentratie bereik van 0,05-1,0 M. ( B) SDS-PAGE-analyse van de gefractioneerde elutie het aantonen van de aanwezigheid van de 75 kDa eiwit, kindlin-3 (gelabeld K3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4.jpg" /> Figuur 4. Representatieve gelfiltratiechromatografie en geconcentreerd kindlin-3. (A) Gel filtratie elutieprofiel gezuiverd kindlin-3 meteen Superdex S200 (16/60) in Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl en 1 mM DTT bij 20 ° C. Gebaseerd op het elutievolume, kindlin-3 migreert als verwacht voor een 75 kDa eiwit, wat suggereert dat het overwegend monomeer. (B) SDS-PAGE van hooggeconcentreerde gezuiverd recombinant kindlin-3 op 14.5 mg / ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5.jpg" /> Figuur 5. Thermofluor gebaseerde thermische Shift Assay Buffer voor screening. Kindlin-3 werd verdund in verschillende buffers omvattende een tweedimensionaal scherm pH versus natriumchloride concentratie. Overgangstemperatuur (temperatuur middens) waargenomen door fluorescentie van dehydrofoob gebonden kleurstof, Sypro oranje (Molecular Probes) en berekend met de Opticon Monitor software. (A) Een 3D histogram van de transitie temperaturen uitgezet samen met (B) een verandering overgangstemperatuur van het berekende gemiddelde van 50.4 ° ​​C. Voor de duidelijkheid de bars zijn gekleurd volgens het bereik van temperaturen waaraan zij corresponderen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Kindlins fundamenteel celadhesie door integrines maar studies ervan werden gehinderd door de moeilijkheid erin recombinante expressie in bacteriële gastheren. We beschrijven hier werkwijzen voor de efficiënte productie in baculovirus-geïnfecteerde insectencellen.

Efficiënte productie en zuivering van recombinant muizen Kindlin-3 uit Insect Cellen voor Biofysische Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Het algemene doel van de volgende experimenten is om efficiënt milligramhoeveelheden van Miran Kinlin drie te produceren in insectencelculturen, wat niet mogelijk is in andere expressie-hosts. Dit wordt bereikt door het transfecteren van een KINLIN drie transfervector samen met een gemodificeerde bao-virus backbone om een recombinant bao-virus te creëren dat het KINLIN drie-gen draagt. Als tweede stap wordt het virus geamplificeerd in insectencellen om een voldoende hoeveelheid virionen te produceren voor toekomstige stappen.Vervolgens worden insectencellen geïnfecteerd om grote hoeveelheden Kinlin drie-eiwit te produceren, zodat zuivering via snelle vloeistofchromatografie mogelijk is. De resultaten tonen aan dat functioneel kinlin drie van hoge zuiverheid in milligramhoeveelheden kan worden geproduceerd, gebaseerd op SDS-PAGE-analyse en grootte-uitsluitingschromatografie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de expressie van kinlin drie in bacteriën, is dat expressie in met baculovirus geïnfecteerde insectencellen de opbrengst aan recombinant eiwit met een factor tien verhoogt.De SF nine-cellen voor deze procedure worden in suspensie gekweekt en onderhouden in SF 902-medium aangevuld met 100 µg/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine. Voor de generatie van het baculovirus moeten de cellen worden gekweekt tot een dichtheid van 5 × 10⁵ tot 1 × 10⁶ cellen per milliliter. Om de SF nine-cellen voor transfectie voor te bereiden, zaai ongeveer 1 × 10⁶ cellen per well van een steriele zes-wells tissue culture plate uit in 2 mL SF 902-medium aangevuld met penicilline en streptomycine. Laat de SF nine-cellen ongeveer 20 minuten bij kamertemperatuur in de zuurkast staan om aan de bodem van de plastic wells te hechten en zo een monolaag te vormen. De generatie van recombinant baculovirus wordt bereikt door plasmid-DNA en BMid-DNA te cotransfecteren in een monolaag SF nine-cultuur.De expressievector papine neuron firm T three bevat het muis-KINLIN three-gen firm T three. Onder controle van de P 10 BAO-virale promoter beschikt deze over flankerende bao-virale sequenties om recombinatie met de back mid mogelijk te maken en codeert deze voor een C-terminale hiss six-tag voor downstream zuivering. Meng voor elke transfectie 1 tot 2 µg gezuiverde MFI T three met 0,5 µg gezuiverde B mid en 100 µL SF 902 SFM zonder antibiotica. Dit is oplossing A. Verdun in een aparte buis 6 µL cell effect in two reagent in 100 µL SF 902 SFM zonder antibiotica.Voor elke transfectiereactie kan hier een mastermix worden gemaakt om de vloeistofhandelingen te verminderen als er veel transfecties vereist zijn. Dit is oplossing B. Meng de twee oplossingen A en B door ongeveer 200 µL van elk per transfectie te gebruiken en incubeer dit 20 minuten bij kamertemperatuur om lipide-DNA-complexen te vormen. Verdun na 20 minuten de lipide-DNA-complexen met 800 µL per transfectie SF 902 SFM zonder antibiotica. Aspireer vervolgens voorzichtig het medium van de SF9-celmonolaag en pipetteer de AB-oplossing en het mediummengsel voorzichtig bovenop de SF9-monolaag.Incubeer de getransfecteerde cellen overnight in een bevochtigde incubator bij 27 °C om een vochtige omgeving te creëren en te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Plaats de six-well plate in een plastic bak met deksel samen met een vochtig papieren handdoekje. Voeg de volgende dag aan elke monocultuur nog eens 1 mL SF 900 to SFM zonder antibiotica toe en incubeer de cellen nog vijf dagen bij 27 °C.Oogst na vijf dagen het recombinante bao-virus direct uit het cultuurmedium en breng het over naar een schone centrifugebuis. Verwijder eventuele SF nine-celresten door centrifugatie bij 1000 Gs gedurende vijf minuten. Breng het virus, dat zich in de resulterende supernatant bevindt en wordt aangeduid als P1, bij kamertemperatuur over naar een schone buis. Er kan worden aangenomen dat de P1-virusgeneratie een verwachte virustiter heeft van 1 × 10⁷ PFU per milliliter.Hoewel een plaque-assay kan worden uitgevoerd indien nodig, dient de P1-virusvoorraad in het donker bij vier graden Celsius te worden bewaard tot gebruik. De SF9-cellen die worden gebruikt voor de amplificatie van recombinant balo-virus in suspensie moeten een dichtheid hebben van 1,4 × 10⁶ cellen per milliliter en de cultuur moet een twintigste van het totale kolfvolume beslaan. Bijvoorbeeld 50 milliliter in een kolf van twee liter. Over het algemeen moeten de SF9-cellen voor een optimale vao-virusamplificatie en eiwitproductie uniform van grootte en sferisch zijn.Infecteer de SF nine-celcultuur met de P one-virale stock met een multiplicity of infection of MOI van 0.1 met behulp van de volgende formule. Incubeer de met P one geïnfecteerde insectencultuur bij 27 °C met schudden op 100 RPM gedurende 72 uur. Oogst drie dagen later het virus door de cellen van het medium te scheiden via centrifugatie bij 1000 ×g gedurende vijf minuten.Breng bij kamertemperatuur het geklaarde virus-verrijkte medium over naar een schone buis. Deze virusvoorraad wordt aangeduid als P2 en de verwachte virustiter is 2 × 10⁸ PFU per milliliter. Bewaar deze virusvoorraad bij 4 °C in het donker tot gebruik, en bewaar de resulterende celpellets bij -20 °C voor latere bevestiging van de productie van het recombinante virus.Om deze procedure te starten, kweek een adequaat volume SF nine celculturen in suspensie in SF 902 s fm, aangevuld met 100 µg/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine. De verhouding tussen het totale cultuurvolume en het flesvolume moet één op vijf zijn.Incubeer de suspensieculturen bij 27 °C met schudden op 100 RPM totdat ze een celdichtheid van 2 × 10⁶ cellen per milliliter bereiken. Wanneer de Sf9-culturen een dichtheid van 2 × 10⁶ cellen per milliliter hebben, zijn ze klaar voor infectie met het baculovirus. Vul de culturen aan tot een eindconcentratie van 1% foetaal runderserum, gevolgd door de P2-virusstock.Om een MOI van één te verkrijgen, worden de geïnfecteerde culturen 72 uur na infectie geïncubeerd bij 27 °C met schudden op 100 RPM; oogst de recombinante polyhistidine-getagde lin three-expresserende SF nine-cellen door centrifugatie bij 1000 ×g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Bewaar de resulterende celpellet bij -20 °C tot gebruik of bij -80 °C voor langdurige bewaring. Deze procedure begint met het ontdooien op ijs.De bevroren pellets van vao-virus geïnfecteerde SF nine die recombinant kinlin drie en Resus tot expressie brengen, worden gesuspendeerd met lysisbuffer. Na het incuberen van de geresuspendeerde cellen met de lysisbuffer gedurende 5 tot 10 minuten, wordt het mengsel gevortext tot een homogene resus-suspensie is bereikt voor verdere celdisruptie. Sonicate het monster in een ijsbad.Klaar het lysaat op door centrifugatie bij 48, 000 GS gedurende één uur bij vier graden Celsius. Laad de resulterende supernatant op een hist trap-kolom van vijf milliliter volume, vooraf geëquilibreerd met lysisbuffer bij vier graden Celsius, met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. De daaropvolgende stappen voor proteïne-elutie, bufferuitwisseling en proteïneconcentratie worden hier niet gedemonstreerd, maar zijn gedetailleerd beschreven in het bijbehorende manuscript.Zodra de eiwitoplossing na bufferuitwisseling is verkregen, wordt deze met een ACTA FPLC met een stroomsnelheid van 0,5 milliliters per minuut aangebracht op een vooraf geëquilibreerde HiTrap Heparin HP-kolom van vijf milliliter. Het gebonden KINLIN three wordt geëlueerd met een lineaire natriumchloridegradiënt in dezelfde buffer, die toeneemt met een snelheid van 10 millimolar per milliliter recombinante histidinetags. KINLIN three wordt verwacht te elueren bij ongeveer 0,6 molar natriumchloride. Na het concentreren van het eiwit is de laatste stap het uitvoeren van een bufferuitwisseling van het eiwit middels size-exclusion chromatografie; breng het gezuiverde eiwit aan op een Superdex 200 10/300 GL-kolom en zuiver de eiwitten op basis van grootte door de buffer met een stroomsnelheid van 0,5 milliliters per minuut op de kolom aan te brengen.Het eiwit dat uit de kolom elueert, wordt gefractioneerd en gemonitord met behulp van absorptie bij 280 nanometers. Het succes van de generatie van het recombinante virus werd geverifieerd door de aanwezigheid van recombinant Kinlin drie in de COT-getransfecteerde SF nine-cellen te beoordelen via SDS-PAGE en Western-analyse, zoals te zien is in deze representatieve Western blot van zes kleinschalige SF nine-culturen met gebruik van een anti-hiss zes-antilichaam. Een duidelijke band die overeenkomt met een 75 kilodalton hiss-getagd eiwit was zichtbaar in elk monster nadat het virus was geamplificeerd en was gebruikt om SF nine-cellen te infecteren in grootschalige experimenten. Recombinant KINLIN drie werd gedeeltelijk gezuiverd door middel van geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie.De belangrijkste gelafbeelding in deze figuur toont een SDS-page van nikkel-affiniteitsgezuiverd recombinant muis kinlin drie, tot expressie gebracht in BAO-virus geïnfecteerde SF nine cellen; het geabsorbeerde eiwit werd geëlueerd met een ole-gradiënt, zoals boven de gelafbeelding weergegeven. MW geeft de moleculaire gewichtsmarker aan, LYS is het hele celluysaat, FT is de flow-through, WI is wasbeurt één en WII is wasbeurt twee. Er werd ook een Western blot-analyse uitgevoerd met de elutiefracties om de aanwezigheid van de engineered his-tag op het recombinante eiwit te bevestigen.Vervolgens werd het gedeeltelijk gezuiverde KINLIN three verder gezuiverd tot bijna homogeniteit door middel van ionenwisselingschromatografie met gebruik van een heparinekolom. Dit paneel toont het elutieprofiel waargenomen bij 280 nanometer in het blauw, waarbij een enkele symmetrische piek zichtbaar is die elueert onder een lineaire natriumchloridegradiënt aangegeven in het groen, met een natriumchlorideconcentratiebereik van 0,05 molar tot 1,0 molar. Het onderste paneel toont de resultaten van de SDS-PAGE-analyse van de gefractioneerde elutie, wat de aanwezigheid van het 75 kilodalton eiwit Kinlin three aantoont.Als laatste stap werd de zuiverheid van KINLIN drie gepolijst door middel van grootte-uitsluitingschromatografie om aggregaten te verwijderen en homogeniteit te bereiken. Dit representatieve gelfiltratie-elutieprofiel is van gezuiverd Kinlin drie met gebruik van een SUEx S 200 in Tris HCL pH 7.5 150 millimolar natriumchloride en één millimolar DTT bij 20 °C. Op basis van het elutievolume migreert KINLIN drie zoals verwacht voor een eiwit van 75 kilodalton, wat suggereert dat het hoofdzakelijk monomerisch is.De volgende figuur toont de resultaten van een SDS-page van sterk geconcentreerd gezuiverd recombinant kinlin 3, aangeduid als K3, bij 14,5 mg/mL. De productie van milligramhoeveelheden van hoogzuiver, full-length muis-kinlin 3 in insectenceltuctuur maakt uitgebreide structurele studies en biochemische analyse van het eiwit mogelijk. In deze studie is ook een op ThermoFluor gebaseerde thermo shift assay uitgevoerd om te bepalen welke buffers stabiliserend werkten voor KINLIN 3.KINLIN three werd verdund in verschillende buffers, bestaande uit een tweedimensionale screening van pH versus natriumchlorideconcentratie. Het bovenste paneel is een 3D-histogram van de transitietemperaturen en het onderste paneel toont de verandering in transitietemperatuur ten opzichte van het berekende gemiddelde van 50,4 °C. De staven zijn gekleurd volgens het temperatuurbereik waaraan ze overeenkomen.Er werd waargenomen dat KINLIN drie stabiel was bij hoge natriumchlorideconcentraties binnen het PA-bereik van 7,0 tot 9,0, met een consistente overgangstemperatuur van 55 °C. Tevens werd waargenomen dat de overgangstemperatuur van Kinlin drie ongeveer 55 °C was binnen het PA-bereik van 7,0 tot 7,5, ongeacht de natriumchlorideconcentratie.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u zeer zuivere functionele recombinante kindling produceert voor diepgaande biofysische karakterisering en verder onderzoek. Vergelijkbare benaderingen kunnen worden gebruikt voor andere proteïnemonsters die moeilijk te prepareren zijn, en we bevelen de toepassing ervan in dergelijke gevallen aan.

efficient-production-purification-recombinant-murine-kindlin-3-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een methode om Insectencellen voor te bereiden en te infecteren ze met baculovirus voor het doel van de productie van recombinante mCD1d proteinand het genereren van mCD1d tetrameren.

Een methode voor de productie van recombinante eiwitten mCD1d in insectencellen.

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

The video explains the process of producing antibodies in mammalian host cells, from gene expression to secretion. It involves transcription, translation, signal recognition, correct folding, and eventual release into the extracellular medium via secretory vesicles.

Production and Purification of Recombinant Antibodies from Mammalian Cells

De expressie van recombinante eiwitten door zoogdiersystemen wordt een aantrekkelijke methode voor het produceren van eiwitcomplexen voor structurele biologie. Hier presenteren we een eenvoudig maar zeer efficiënt expressiesysteem dat gebruik maakt van in suspensie gekweekte zoogdiercellen om eiwitcomplexen te zuiveren voor structurele studies.

Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

Dit is een snel, kosteneffectief protocol voor de productie van uitgescheiden, geglycoseerde zoogdier-eiwitten en daaropvolgende eenstapszuivering met voldoende opbrengsten van homogeen eiwit voor röntgenkristallografie en andere biofysische studies.

Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie

IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) is een Ser/Thr proteïne kinase dat in een horde van cellulaire activiteiten voornamelijk via activering van NF-recombination transcriptiefactoren betrokken is. Hier beschrijven we de belangrijkste stappen die nodig zijn voor de productie en de crystal structuurbepaling van dit eiwit.

Een gids voor productie, kristallisatie en structuurbepaling van menselijke IKK1/α

Hier presenteren we een protocol om de massa van gen-zwijgen lymfkliertest NK cellen met behulp van een systeem van differentiatie feeder-gratis voor mechanistisch onderzoek in vitro en in vivo.

Een nieuwe Feeder-vrij systeem voor massaproductie van lymfkliertest Natural Killer cellen In Vitro

Recombinant BDNF met een Avi sequentie (BDNFAvi) wordt op een kosteneffectieve manier geproduceerd in HEK293 cellen en wordt gezuiverd door affiniteitschromatografie. BDNFavi wordt dan direct mono-biotinylated met het enzym BirA in een buis. BDNFavi en mono-biotinylated BDNFavi behouden hun biologische activiteit in vergelijking met commercieel verkrijgbaar BDNF.

Een verbeterd protocol om te zuiveren en direct Mono-Biotinylaat Recombinant BDNF in een tube voor cellulaire trafficking studies in neuronen

His-tag zuivering, dialyse en activering worden gebruikt om de opbrengst van oplosbare, actieve matrix metalloproteinase-3 katalytische domein eiwitexpressie in bacteriën te verhogen. Eiwitfracties worden geanalyseerd via SDS-PAGE gels.

Bacteriële expressie en zuivering van humane matrix metalloproteinase-3 met behulp van affiniteitschromatografie

Dit protocol beschrijft de productie van recombinante humane SLFN14-ribonuclease en de stoichiometrische analyse daarvan door massafotometrie.<br...

Snelle productie van recombinante menselijke SLFN14-ribonuclease en stoichiometrische analyse door massafotometrie

Leer de efficiënte productie en zuivering van recombinant muizen Kindlin-3 uit insectcellen voor biofysische studies. Deze methode levert tien keer hogere opbrengst dan bacteriële expressiesystemen.

Efficiënte productie en zuivering van recombinant muizen Kindlin-3 uit Insect Cellen voor Biofysische Studies

Meer video's verkennen