Efficiënte productie en zuivering van recombinant muizen Kindlin-3 uit Insect Cellen voor Biofysische Studies

Het algemene doel van de volgende experimenten is om efficiënt milligramhoeveelheden van Miran Kinlin drie te produceren in insectencelculturen, wat niet mogelijk is in andere expressie-hosts. Dit wordt bereikt door het transfecteren van een KINLIN drie transfervector samen met een gemodificeerde bao-virus backbone om een recombinant bao-virus te creëren dat het KINLIN drie-gen draagt. Als tweede stap wordt het virus geamplificeerd in insectencellen om een voldoende hoeveelheid virionen te produceren voor toekomstige stappen.

Vervolgens worden insectencellen geïnfecteerd om grote hoeveelheden Kinlin drie-eiwit te produceren, zodat zuivering via snelle vloeistofchromatografie mogelijk is. De resultaten tonen aan dat functioneel kinlin drie van hoge zuiverheid in milligramhoeveelheden kan worden geproduceerd, gebaseerd op SDS-PAGE-analyse en grootte-uitsluitingschromatografie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de expressie van kinlin drie in bacteriën, is dat expressie in met baculovirus geïnfecteerde insectencellen de opbrengst aan recombinant eiwit met een factor tien verhoogt.

De SF nine-cellen voor deze procedure worden in suspensie gekweekt en onderhouden in SF 902-medium aangevuld met 100 µg/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine. Voor de generatie van het baculovirus moeten de cellen worden gekweekt tot een dichtheid van 5 × 10⁵ tot 1 × 10⁶ cellen per milliliter. Om de SF nine-cellen voor transfectie voor te bereiden, zaai ongeveer 1 × 10⁶ cellen per well van een steriele zes-wells tissue culture plate uit in 2 mL SF 902-medium aangevuld met penicilline en streptomycine. Laat de SF nine-cellen ongeveer 20 minuten bij kamertemperatuur in de zuurkast staan om aan de bodem van de plastic wells te hechten en zo een monolaag te vormen. De generatie van recombinant baculovirus wordt bereikt door plasmid-DNA en BMid-DNA te cotransfecteren in een monolaag SF nine-cultuur.

De expressievector papine neuron firm T three bevat het muis-KINLIN three-gen firm T three. Onder controle van de P 10 BAO-virale promoter beschikt deze over flankerende bao-virale sequenties om recombinatie met de back mid mogelijk te maken en codeert deze voor een C-terminale hiss six-tag voor downstream zuivering. Meng voor elke transfectie 1 tot 2 µg gezuiverde MFI T three met 0,5 µg gezuiverde B mid en 100 µL SF 902 SFM zonder antibiotica. Dit is oplossing A. Verdun in een aparte buis 6 µL cell effect in two reagent in 100 µL SF 902 SFM zonder antibiotica.

Voor elke transfectiereactie kan hier een mastermix worden gemaakt om de vloeistofhandelingen te verminderen als er veel transfecties vereist zijn. Dit is oplossing B. Meng de twee oplossingen A en B door ongeveer 200 µL van elk per transfectie te gebruiken en incubeer dit 20 minuten bij kamertemperatuur om lipide-DNA-complexen te vormen. Verdun na 20 minuten de lipide-DNA-complexen met 800 µL per transfectie SF 902 SFM zonder antibiotica. Aspireer vervolgens voorzichtig het medium van de SF9-celmonolaag en pipetteer de AB-oplossing en het mediummengsel voorzichtig bovenop de SF9-monolaag.

Incubeer de getransfecteerde cellen overnight in een bevochtigde incubator bij 27 °C om een vochtige omgeving te creëren en te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Plaats de six-well plate in een plastic bak met deksel samen met een vochtig papieren handdoekje. Voeg de volgende dag aan elke monocultuur nog eens 1 mL SF 900 to SFM zonder antibiotica toe en incubeer de cellen nog vijf dagen bij 27 °C.

Oogst na vijf dagen het recombinante bao-virus direct uit het cultuurmedium en breng het over naar een schone centrifugebuis. Verwijder eventuele SF nine-celresten door centrifugatie bij 1000 Gs gedurende vijf minuten. Breng het virus, dat zich in de resulterende supernatant bevindt en wordt aangeduid als P1, bij kamertemperatuur over naar een schone buis. Er kan worden aangenomen dat de P1-virusgeneratie een verwachte virustiter heeft van 1 × 10⁷ PFU per milliliter.

Hoewel een plaque-assay kan worden uitgevoerd indien nodig, dient de P1-virusvoorraad in het donker bij vier graden Celsius te worden bewaard tot gebruik. De SF9-cellen die worden gebruikt voor de amplificatie van recombinant balo-virus in suspensie moeten een dichtheid hebben van 1,4 × 10⁶ cellen per milliliter en de cultuur moet een twintigste van het totale kolfvolume beslaan. Bijvoorbeeld 50 milliliter in een kolf van twee liter. Over het algemeen moeten de SF9-cellen voor een optimale vao-virusamplificatie en eiwitproductie uniform van grootte en sferisch zijn.

Infecteer de SF nine-celcultuur met de P one-virale stock met een multiplicity of infection of MOI van 0.1 met behulp van de volgende formule. Incubeer de met P one geïnfecteerde insectencultuur bij 27 °C met schudden op 100 RPM gedurende 72 uur. Oogst drie dagen later het virus door de cellen van het medium te scheiden via centrifugatie bij 1000 ×g gedurende vijf minuten.

Breng bij kamertemperatuur het geklaarde virus-verrijkte medium over naar een schone buis. Deze virusvoorraad wordt aangeduid als P2 en de verwachte virustiter is 2 × 10⁸ PFU per milliliter. Bewaar deze virusvoorraad bij 4 °C in het donker tot gebruik, en bewaar de resulterende celpellets bij -20 °C voor latere bevestiging van de productie van het recombinante virus.

Om deze procedure te starten, kweek een adequaat volume SF nine celculturen in suspensie in SF 902 s fm, aangevuld met 100 µg/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine. De verhouding tussen het totale cultuurvolume en het flesvolume moet één op vijf zijn.

Incubeer de suspensieculturen bij 27 °C met schudden op 100 RPM totdat ze een celdichtheid van 2 × 10⁶ cellen per milliliter bereiken. Wanneer de Sf9-culturen een dichtheid van 2 × 10⁶ cellen per milliliter hebben, zijn ze klaar voor infectie met het baculovirus. Vul de culturen aan tot een eindconcentratie van 1% foetaal runderserum, gevolgd door de P2-virusstock.

Om een MOI van één te verkrijgen, worden de geïnfecteerde culturen 72 uur na infectie geïncubeerd bij 27 °C met schudden op 100 RPM; oogst de recombinante polyhistidine-getagde lin three-expresserende SF nine-cellen door centrifugatie bij 1000 ×g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Bewaar de resulterende celpellet bij -20 °C tot gebruik of bij -80 °C voor langdurige bewaring. Deze procedure begint met het ontdooien op ijs.

De bevroren pellets van vao-virus geïnfecteerde SF nine die recombinant kinlin drie en Resus tot expressie brengen, worden gesuspendeerd met lysisbuffer. Na het incuberen van de geresuspendeerde cellen met de lysisbuffer gedurende 5 tot 10 minuten, wordt het mengsel gevortext tot een homogene resus-suspensie is bereikt voor verdere celdisruptie. Sonicate het monster in een ijsbad.

Klaar het lysaat op door centrifugatie bij 48, 000 GS gedurende één uur bij vier graden Celsius. Laad de resulterende supernatant op een hist trap-kolom van vijf milliliter volume, vooraf geëquilibreerd met lysisbuffer bij vier graden Celsius, met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. De daaropvolgende stappen voor proteïne-elutie, bufferuitwisseling en proteïneconcentratie worden hier niet gedemonstreerd, maar zijn gedetailleerd beschreven in het bijbehorende manuscript.

Zodra de eiwitoplossing na bufferuitwisseling is verkregen, wordt deze met een ACTA FPLC met een stroomsnelheid van 0,5 milliliters per minuut aangebracht op een vooraf geëquilibreerde HiTrap Heparin HP-kolom van vijf milliliter. Het gebonden KINLIN three wordt geëlueerd met een lineaire natriumchloridegradiënt in dezelfde buffer, die toeneemt met een snelheid van 10 millimolar per milliliter recombinante histidinetags. KINLIN three wordt verwacht te elueren bij ongeveer 0,6 molar natriumchloride. Na het concentreren van het eiwit is de laatste stap het uitvoeren van een bufferuitwisseling van het eiwit middels size-exclusion chromatografie; breng het gezuiverde eiwit aan op een Superdex 200 10/300 GL-kolom en zuiver de eiwitten op basis van grootte door de buffer met een stroomsnelheid van 0,5 milliliters per minuut op de kolom aan te brengen.

Het eiwit dat uit de kolom elueert, wordt gefractioneerd en gemonitord met behulp van absorptie bij 280 nanometers. Het succes van de generatie van het recombinante virus werd geverifieerd door de aanwezigheid van recombinant Kinlin drie in de COT-getransfecteerde SF nine-cellen te beoordelen via SDS-PAGE en Western-analyse, zoals te zien is in deze representatieve Western blot van zes kleinschalige SF nine-culturen met gebruik van een anti-hiss zes-antilichaam. Een duidelijke band die overeenkomt met een 75 kilodalton hiss-getagd eiwit was zichtbaar in elk monster nadat het virus was geamplificeerd en was gebruikt om SF nine-cellen te infecteren in grootschalige experimenten. Recombinant KINLIN drie werd gedeeltelijk gezuiverd door middel van geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie.

De belangrijkste gelafbeelding in deze figuur toont een SDS-page van nikkel-affiniteitsgezuiverd recombinant muis kinlin drie, tot expressie gebracht in BAO-virus geïnfecteerde SF nine cellen; het geabsorbeerde eiwit werd geëlueerd met een ole-gradiënt, zoals boven de gelafbeelding weergegeven. MW geeft de moleculaire gewichtsmarker aan, LYS is het hele celluysaat, FT is de flow-through, WI is wasbeurt één en WII is wasbeurt twee. Er werd ook een Western blot-analyse uitgevoerd met de elutiefracties om de aanwezigheid van de engineered his-tag op het recombinante eiwit te bevestigen.

Vervolgens werd het gedeeltelijk gezuiverde KINLIN three verder gezuiverd tot bijna homogeniteit door middel van ionenwisselingschromatografie met gebruik van een heparinekolom. Dit paneel toont het elutieprofiel waargenomen bij 280 nanometer in het blauw, waarbij een enkele symmetrische piek zichtbaar is die elueert onder een lineaire natriumchloridegradiënt aangegeven in het groen, met een natriumchlorideconcentratiebereik van 0,05 molar tot 1,0 molar. Het onderste paneel toont de resultaten van de SDS-PAGE-analyse van de gefractioneerde elutie, wat de aanwezigheid van het 75 kilodalton eiwit Kinlin three aantoont.

Als laatste stap werd de zuiverheid van KINLIN drie gepolijst door middel van grootte-uitsluitingschromatografie om aggregaten te verwijderen en homogeniteit te bereiken. Dit representatieve gelfiltratie-elutieprofiel is van gezuiverd Kinlin drie met gebruik van een SUEx S 200 in Tris HCL pH 7.5 150 millimolar natriumchloride en één millimolar DTT bij 20 °C. Op basis van het elutievolume migreert KINLIN drie zoals verwacht voor een eiwit van 75 kilodalton, wat suggereert dat het hoofdzakelijk monomerisch is.

De volgende figuur toont de resultaten van een SDS-page van sterk geconcentreerd gezuiverd recombinant kinlin 3, aangeduid als K3, bij 14,5 mg/mL. De productie van milligramhoeveelheden van hoogzuiver, full-length muis-kinlin 3 in insectenceltuctuur maakt uitgebreide structurele studies en biochemische analyse van het eiwit mogelijk. In deze studie is ook een op ThermoFluor gebaseerde thermo shift assay uitgevoerd om te bepalen welke buffers stabiliserend werkten voor KINLIN 3.

KINLIN three werd verdund in verschillende buffers, bestaande uit een tweedimensionale screening van pH versus natriumchlorideconcentratie. Het bovenste paneel is een 3D-histogram van de transitietemperaturen en het onderste paneel toont de verandering in transitietemperatuur ten opzichte van het berekende gemiddelde van 50,4 °C. De staven zijn gekleurd volgens het temperatuurbereik waaraan ze overeenkomen.

Er werd waargenomen dat KINLIN drie stabiel was bij hoge natriumchlorideconcentraties binnen het PA-bereik van 7,0 tot 9,0, met een consistente overgangstemperatuur van 55 °C. Tevens werd waargenomen dat de overgangstemperatuur van Kinlin drie ongeveer 55 °C was binnen het PA-bereik van 7,0 tot 7,5, ongeacht de natriumchlorideconcentratie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u zeer zuivere functionele recombinante kindling produceert voor diepgaande biofysische karakterisering en verder onderzoek. Vergelijkbare benaderingen kunnen worden gebruikt voor andere proteïnemonsters die moeilijk te prepareren zijn, en we bevelen de toepassing ervan in dergelijke gevallen aan.