Name: Het beoordelen van de celcyclus van neurale stamcellen en stamcellen in de Mouse ontwikkeling van de hersenen na genotoxische stress (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-07T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Leer hoe je de celcyclus van neurale stamcellen beoordeelt in muizenhersenen na genotoxische stress met EdU en BrdU. Deze methode helpt onderzoekers om de effecten van ioniserende straling op de hersenontwikkeling te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het onderzoek dat leidt tot deze resultaten heeft financiering van de Europese Unie Zevende Kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder subsidieovereenkomst ontvangen n ° 323267, van Electricite de France (EDF) en van l&#39;Agence Nationale de la Recherche - Sante-Environnement et Sante-Travail (ANR-minst goed zichtbaar, Neurorad).

1. Animal Procedures Dit protocol is ontworpen in overeenstemming met de Richtlijn Europese Gemeenschappen van de Raad van 24 november 1986 (86/609/EEG) en is door onze institutionele commissie inzake dierenwelzijn (CETEA-CEA DSV IdF) goedgekeurd. <ol><li> Injecties met Edu / BrdU en bestraling van E14.5 zwangere muizen (Figuur 2A). <ol><li> Bereid een oplossing van EDU 1 mg / ml en BrdU bij 5 mg / ml in PBS. Voer een intra-peritoneale injectie (IP) van 100 ul van Edu oplossing om met een 25 G naald in zwangere muizen. 1,5 uur later bestralen de muizen (totale lichaamsbestraling) op 0 of 2 Gy Gy (0,6 Gy / min). Onmiddellijk na, injecteren (IP) 200 pl BrdU oplossing om met een 25 G naald in de zwangere muizen. </li></ol></li><li> Voorbereiding van de coronale plakjes embryonale hersenen. <ol><li> Op 1 uur of 4 uur na bestraling, euthanaseren de zwangere muizen door kooldioxide. </li><li> Open de buik Cavity meer dan drie centimeter met een schaar. Scheid de twee baarmoederhoorns van de rest van de baarmoeder door snijden beide uiteinden van de hoorns. Breng de baarmoederhoorns in een petrischaal met PBS 0,6% glucose. Open de baarmoederhoorns met de tang om de embryo&#39;s te isoleren. Verwijder de vruchtzak van elk embryo behulp van een tang. </li><li> Ontleden embryonale hoofden met een tang en zet ze vast door onderdompeling in 4% paraformaldehyde (PFA, pH = 7,4) O / N bij 4 ° C. </li><li> Spoel embryonale hoofden in PBS gedurende ten minste een nacht bij 4 ° C. Koppen in PBS bewaard gedurende enkele dagen. </li><li> Embed heads in paraffine met een vacuüm infiltratie processor zoals aangegeven in tabel 1. Heads inbedding kan worden onder een chemische kap uitgevoerd ethanol en xylen baden, en daarna in een 65 ° C oven gedurende de paraffinebaden. </li><li> Bereid 5-pm dikke coronale secties met een microtoom. </li><li> Monteren op-polylysine gecoate objectglaasjes. &lt;/ Li&gt; <li> Dia&#39;s kunnen bij kamertemperatuur (RT) bewaard gedurende enkele maanden. </li></ol></li></ol> 2. Edu / BrdU kleuring <ol><li> Deparaffineren en antigeen ontmaskering <ol><li> Deparaffinize de paraffine ingebedde hersencoupes door onderdompeling dia in 3 baden tolueen gedurende 5 minuten. </li><li> Hydrateren gedurende 3 min in 2 baden elk oplossingen afnemende ethanolconcentratie als volgt: ethanol 100%, 95% ethanol, 70% ethanol en 5 min in H2O Dia&#39;s kunnen in gedeïoniseerd water worden bewaard voor meerdere hr. </li><li> Kook de schijfjes gedurende 10 min in citraat-oplossing (10 mM, pH 6) en incubeer in gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten. </li></ol></li><li> EDU kleuring <ol><li> Voer Edu detectie volgens protocol van de fabrikant. Permeabilize cellen met 0,5% triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten. </li><li> Bereid 1X edu buffer additief door verdunning van de 10X oplossing in gedemineraliseerd water. Deze oplossing moet vers worden gemaakt en gebruikt op dezelfde day. </li><li> Bereid edu reactie cocktail, met inbegrip van Edu Alexa Fluor 488 azide. Het is belangrijk om de ingrediënten toe in de volgorde tabel 2, anders zal de reactie niet optimaal verlopen. Gebruik de EDU reactie cocktail binnen 15 minuten na de bereiding. </li><li> Verwijder de permeabilisatie buffer (stap 2.1.1), vervolgens tweemaal wassen met PBS. </li><li> Voeg 150 ul van edu reactiecoctail, zet een dekglaasje en incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de EDU reactie cocktail, vervolgens een keer wassen met PBS. </li></ol></li><li> BrdU kleuring <ol><li> Bereid verzadiging buffer met 7,5% geitenserum en 7,5% foetaal runderserum in PBS. Voeg 150 ul van verzadigingsbuffer op hersenenplakken, zet een dekglaasje en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om niet-specifiek antilichaam blokkeert binding. </li><li> Verwijder het dekglaasje. Voeg 150 ul van de muis anti-BrdU primair antilichaam verdund tot 1/300 in verzadiging buffer, zet een dekglaasje en incubeer O /N bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het dekglaasje, daarna wassen 3 keer in PBS. </li><li> Voeg 150 ul van geit anti-muis secundair antilichaam alexa594 verdund 1/400 in verzadigingsbuffer, zet een dekglaasje en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het dekglaasje, vervolgens een keer wassen in PBS. </li><li> Nucleaire kleuring: voeg 150 ul van 4 &#39;,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) en 1 ug / ml in PBS, zet een dekglaasje en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Monteer dia&#39;s in montage medium. </li></ol></li></ol> 3. Analyse <ol><li> Onderzoek hersenen secties onder een fluorescentiemicroscoop met een 20X objectief of een confocale microscoop en het verwerven van afbeeldingen in drie kanalen (488 nm, 594 nm en UV) als scheidt bestanden. </li><li> Stack beelden met Photoshop-software. </li><li> Analyseer hersenen secties in een standaard sector van de dorsomediale cerebrale muur. Deze sector is 100 micrometer op zijn mediale-laterale dimensie en is verdeeld in 18 bakken (of meer) van 10 μm lengte in de radiale afmeting met een raster gesuperponeerd op de beelden (fig. 1) zoals eerder beschreven 31. <ol><li> Breng het rooster zoals de eerste bak op de ventriculaire oppervlak met de lengteas evenwijdig aan de ventriculaire grens. Nummer dan de gelabelde Edu, BrdU en / of pyknotische kernen (overeenkomend met apoptotische kernen) in elke bak. Nummer een kern op de grens van twee containers in de bak waarin het grootste gedeelte, of het onderste vak, bevat als de kern inneemt gelijke oppervlakken binnen twee bakken. </li></ol></li><li> Statistische analyse. </li></ol> Analyseer tenminste twee corticale schijfjes per embryo. Herhaalde bepalingen ten minste 3 embryo&#39;s van verschillende nesten. Resultaten moeten worden opgegeven als gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM). Statistische analyses worden uitgevoerd met Graphpad Prism behulp van twee-weg ANOVA en Bonferroni meervoudige vergelijking posthoc testen.

<ol><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+cerebral+cortical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specification of cerebral cortical areas.</a> Science. 241, 170-176 (1988).</li>
<li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+he+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitosis in he neural tube.</a> J Comp Neurol. , 377-399 (1935).</li>
<li>Taverna, E., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+nuclei+IN+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor nuclei IN motion.</a> Neuron. 67, 906-914 (2010).</li>
<li>Committee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+vertebrate+central+nervous+system%3A+revised+terminology%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology.</a> Anat Rec. 166, 257-261 (1970).</li>
<li>Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+cerebral+cortex%3A+Boulder+Committee+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).</li>
<li>Miyata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+production+of+surface-dividing+and+non-surface-dividing+cortical+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells.</a> Development. 131, 3133-3145 (2004).</li>
<li>Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+arise+in+the+basal+neuroepithelium+of+the+early+mammalian+telencephalon%3A+a+major+site+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).</li>
<li>Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+projection+neuron+production+and+maturation+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).</li>
<li>Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+neuronal+migration+in+the+embryonic+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex.</a> Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).</li>
<li>Salomoni, P., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+of+mammalian+neural+stem+cells%3A+putting+a+speed+limit+on+G1%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1.</a> Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).</li>
<li>Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+lengthening+of+the+cell+cycle+in+the+neurogenic+subpopulation+of+neural+progenitor+cells+during+mouse+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development.</a> J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).</li>
<li>Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+effects+on+neural+precursor+cells+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus.</a> Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).</li>
<li>Semont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+p53+and+Fas%2FCD95+in+murine+neural+progenitor+cell+response+to+ionizing+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation.</a> Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).</li>
<li>Nowak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+H2AX+phosphorylation+and+neural+precursor+apoptosis+in+the+developing+brain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice.</a> Radiat Res. 165, 155-164 (2006).</li>
<li>Gatz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+DNA+ligase+IV+during+embryonic+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development.</a> J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).</li>
<li>Denekamp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+kinetics+and+radiation+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology+and+Related+Studies+in+Physics%2C+Chemistry%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell kinetics and radiation biology.</a> International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).</li>
<li>Hartwell, L. H., Weinert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints%3A+controls+that+ensure+the+order+of+cell+cycle+events%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events.</a> Science. 246, 629-634 (1989).</li>
<li>Weinert, T. A., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RAD9+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+evidence+that+its+function+acts+posttranslationally+in+cell+cycle+arrest+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).</li>
<li>Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+of+caffeine+on+X-irradiated+HeLa+cells.+I.+Delayed+inhibition+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis.</a> Radiat Res. 71, 653-665 (1977).</li>
<li>Painter, R. B., Young, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitivity+in+ataxia-telangiectasia%3A+a+new+explanation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).</li>
<li>Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+radiation-sensitivity+of+neural+stem+and+progenitor+cell+populations+within+the+developing+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain.</a> Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).</li>
<li>Roque, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+a+p21waf1%2Fcip+-dependent+G1%2FS+checkpoint+in+neural+stem+and+progenitor+cells+after+DNA+damage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo.</a> Stem Cells. 30, 537-547 (2012).</li>
<li>Rousseau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+importance+of+homologous+recombination+DNA+repair+for+mouse+neural+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells.</a> PLoS One. 7, 12(2012).</li>
<li>Bradford, J. A., Clarke, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-pulse+labeling+using+5-ethynyl-2%27-deoxyuridine+%28EdU%29+and+5-bromo-2%27-deoxyuridine+%28BrdU%29+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry.</a> Curr Protoc Cytom. , (2011).</li>
<li>Deckbar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limitations+of+the+G1-S+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The limitations of the G1-S checkpoint.</a> Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).</li>
<li>Manual, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-iT+EdU+Imaging+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Click-iT EdU Imaging Kit.</a> , http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp10338.pdf (2011).</li>
<li>Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+centromeric+heterochromatin+in+mouse+fibroblasts+takes+place+in+early%2C+middle%2C+and+late+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase.</a> Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).</li>
<li>Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subnuclear+localization+and+replication+timing+of+histone+H3+lysine+9+methylation+states%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states.</a> Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).</li>
<li>Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+global+and+fine-tuning+replication+timing+determinants+for+mouse+pericentric+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin.</a> J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).</li>
<li>Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+of+the+pseudostratified+ventricular+epithelium+of+the+embryonic+murine+cerebral+wall%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall.</a> J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).</li>
<li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+%28CldU+and+IdU%29+in+primary+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

De proefopzet hier beschreven gebaseerd op integratie van Edu 1,5 uur voor de bestraling en incorporatie van BrdU onmiddellijk na bestraling toegestaan ​​de demonstratie die NSPCs kunnen S en G2 / M checkpoints te activeren, maar niet de G1 / S checkpoint tijdens de 1 e uur na een genotoxische stress in de foetale hersenen van muizen. We voerden andere experimenten waarin Edu is geïnjecteerd op verschillende tijdstippen na bestraling en BrdU, op slechts 1 uur voor muizen offers, waardoor we specifiek waardere...

Tijdens de embryonale ontwikkeling van de hersenen, zijn projectie neuronen van de cerebrale cortex opgewekt in de ventriculaire zone, een pseudo-epitheel uit verschillende soorten neurale stamcellen en progenitorcellen (NSPC) lijnen die de laterale ventrikels. Onder NSPC de radiale gliacellen (RGC), die als neurale stamcellen ondergaan interkinetic nucleaire migratie (INM) die mitose treden op het oppervlak van het ventrikel en S-fase bij de basale grens van de ventriculaire zone (VZ) 1, 2,3. Ze kunnen ofwel symmetrisch verdelen twee RGC genereren of asymmetrisch een RGC en een neuron of een tussenproduct progenitor cel (IPC) 4, 5 genereren. IPC migreren naar een bovenliggende uitdijende laag genaamd subventriculaire zone (SVZ), waarna een laatste symmetrische verdeling genereren ze twee onvolwassen projectie neuronen 6-8. In tegenstelling tot RGC, hoeft IPC ondergaan INM (beoordeeld 9). Nieuw gegenereerde neuronen migraten radiaal langs de radiale vezels via de tussenliggende zone (IZ) naar hun eindbestemming te bereiken in de corticale plaat (CP) 10, 8. De perfecte timing van al deze gebeurtenissen is essentieel voor een goede ontwikkeling van de hersenschors. Bijvoorbeeld de overgang van proliferatie differentiatie van neurale populaties wordt geregeld door de G1 faseduur 11, 12. De verlenging van de G1 fase correleert dus met celdifferentiatie. Genotoxische stress, zoals ioniserende straling, ernstige aantasting hersenontwikkeling (besproken in 13). Wij en anderen hebben aangetoond dat NSPC zijn zeer gevoelig voor straling geïnduceerde apoptose 14, 15,16. Ioniserende straling veroorzaken DNA dubbelstrengs breuken die het meest ernstige schade aan delende cellen. Een essentieel onderdeel van DNA-schade Response (DDR) in delende cellen is de activering van de celcyclus checkpoints op de G1 / S of G2 / M overgangen of tijdens Sfase (intra-S checkpoint) 17-21. Ze blokkeren de voortgang van de celcyclus te tijd te geven voor DNA-schadeherstel of eliminatie van te beschadigde cellen. Bijgevolg kan celdood en vertraagde celcyclusprogressie hersenontwikkeling veranderen in reactie op ioniserende straling 22-24. Het was dus interessant om een ​​werkwijze voor de activering van celcyclus in NSPC in de bestraalde muis embryonale hersenen beoordelen. De progressie van de celcyclus wordt routinematig gevolgd met de opname van een thymidine analoog, 5-broom-2&#39;-deoxyuridine (BrdU). BrdU opgenomen in de S-fase van de celcyclus, bij DNA replicatie. Het gebruik van een antilichaam tegen BrdU kan daarna de detectie van cellen die gedurende de puls van BrdU in S-fase waren. Een nieuw thymidine analoog, 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EDU) wordt gedetecteerd door een fluorescerende azide. De verschillende manieren om te detecteren EDU en B<html> RDU geen kruisreactie 25, die gelijktijdige detectie van thymidine analogen, die nuttig is voor de studie van de celcyclus. Meestal cellen worden eerst gepulst met Edu en vervolgens gepulseerd met BrdU, waarbij het ​​tijdsverloop tussen beide oprichtingen duurt paar uur 25, 26. Toevoeging van BrdU in kweekmedia die edu leidt voorkeur opname van BrdU in het DNA met uitzondering van EDE, terwijl gelijktijdige toevoeging van edu 25 met equimolaire of halve equimolaire BrdU de media resultaten slechts BrdU incorporatie 27. Dit vereenvoudigt de dubbele labeling protocol door eliminatie van de wasstappen die normaal nodig zijn om het eerste label van het kweekmedium voorafgaand aan de toevoeging van het tweede label te verwijderen. Dit is ook van bijzonder belang zijn voor in vivo onderzoek, waar de was-niet mogelijk zijn, om de precieze timing van de S-fase-of uitreis van de cel bevolking te bepalen. t &quot;&gt; Onlangs, een werkwijze dual-pulse labeling embryonale muizenhersenen met edu en BrdU 23, 24,22 is ontwikkeld om celcyclusprogressie en INM van NSPC onderzoeken na de bestraling in utero. Bovendien is aangetoond dat bij S-fase, muis cellen repliceren eerst de euchromatin regio en vervolgens de pericentric heterochromatin 28,29,30. Interessant pericentric heterochromatin van verschillende chromosomen geclusterd in interfase kernen te heterochromatic brandpunten ook wel bekend als chromocenters en gemakkelijk door DAPI kleuring zo helder brandpunten vormen. Daarom is de differentiële Edu en BrdU kleuringen van euchromatine en chromocenters ons geholpen om meer precies S-fase progressie van NSPC analyseren. Deze methode kon de demonstratie van het schijnbare gebrek aan G1 / S checkpoint in NSCP 22-24, dat is heel verrassend aangezien dit ijkpunt zou van cruciaal belang voor stabiliteit van het genoom te zijn. Verschillende experimental ontwerpen op basis van verschillende combinaties van onderwijs en BrdU pulsen gebruikt om celcyclusprogressie te analyseren in de ventrale en dorsale telencephalon. Hier geven we een voorbeeld van protocollen waardoor de studie van de acute DNA schade NSPC binnen de eerste 4 uur na bestraling in utero van E14.5 muizenembryo&#39;s.

```html
<table><tbody><tr><td>EdU</td><td>Life Technologies</td><td>A10044</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Life Technologies</td><td>B5002</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>IBL 637</td><td>CIS BIO International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissu Tek VIP</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM 2125 RT</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit</td><td>Life Technologies</td><td>C10083</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN202</td><td>1/300</td></tr><tr><td>Goat anti mouse-Alex594</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>1/400</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Polysine slide</td><td>Thermo scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>20012-068</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Microscope BX51</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope SPE</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism software</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Versie 5.0c</td></tr><tr><td>Photoshop software</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
```

het beoordelen van de celcyclus van neurale stamcellen en stamcellen in de mouse ontwikkeling van de hersenen na genotoxische stress

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Neuronen van de cerebrale cortex ontstaan ​​tijdens hersenontwikkeling van verschillende soorten neurale stamcellen en progenitorcellen (NSPC), die een pseudo-epitheel langs de laterale ventrikels van de embryonale hersenen vormen. Genotoxisch benadrukt, zoals ioniserende straling, hebben zeer schadelijke effecten op de ontwikkelende hersenen verband met de hoge gevoeligheid van NSPC. Opheldering van de cellulaire en moleculaire mechanismen afhankelijk van de karakterisering van de DNA schade respons van deze specifieke soorten cellen, die een nauwkeurige methode vereist NSPC progressie bepalen door de celcyclus in het beschadigde weefsel. Hier wordt een methode waarbij opeenvolgende intraperitoneale injecties van Edu en BrdU bij zwangere muizen en verdere detectie van deze twee thymidine analogen coronale secties van de embryonale hersenen. Edu en BrdU zijn beide opgenomen in DNA van replicerende cellen in S-fase en worden gedetecteerd door twee verschillende technieken (azide ofeen specifiek antilichaam, respectievelijk), die de gelijktijdige detectie vergemakkelijken. Edu en BrdU kleuring worden vervolgens voor elk NSPC kern als functie van de afstand van de ventriculaire marge in een standaard deel van de dorsale telencephalon. Dus deze dubbele labeling techniek kan onderscheiden cellen die doorliep de celcyclus van degenen die een celcyclus leidt tot celcyclus geactiveerd in respons op DNA beschadiging. Een voorbeeld van een experiment wordt gepresenteerd, waarin Edu voor de bestraling en BrdU werd geïnjecteerd onmiddellijk na en analyses uitgevoerd binnen de 4 uur na bestraling. Dit protocol geeft een nauwkeurige analyse van de acute DNA schade respons van NSPC in functie van de fase van de celcyclus waarin zij zijn bestraald. Deze methode gemakkelijk worden toegepast op vele andere systemen om het effect van een bepaalde behandeling op celcyclusprogressie in levende weefsels te bepalen.

In de in figuur 2 beschreven proef werd edu toegediend 1,5 uur voor bestraling en BrdU net na bestraling. Vier typen cellen werden vervolgens onderscheiden in de corticale schijfjes bereid bij 1 en 4 uur na bestraling volgens de incorporatie van zowel edu of BrdU, beide of geen (figuren 2A en 2B). Belangrijk, geen EDU of BrdU incorporatie veranderde de mate van door straling geïnduceerde apoptose (data niet getoond). Bovendien, de kleuringen staan ​​alleen de detectie v...

Toediening van twee analogen van thymidine, Edu en BrdU, bij zwangere muizen maakt de analyse van de celcyclus en in neurale voorlopercellen in de embryonale hersenen van muizen. Deze werkwijze is nuttig om de effecten van genotoxische stress, zoals ioniserende straling, tijdens de hersenontwikkeling bepalen.

Het beoordelen van de celcyclus van neurale stamcellen en stamcellen in de Mouse ontwikkeling van de hersenen na genotoxische stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

assessing-cell-cycle-progression-neural-stem-progenitor-cells-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video protocol geeft blijk van een nieuwe methode voor het genereren en daaropvolgende zuivering van neuronale stamcellen uit een hernieuwbare bron van neurale stamcellen (NSC) op basis van hun fysieke (grootte en interne granulariteit) en fluorescerende eigenschappen met behulp van flowcytometrie-technologie.

De Neuroblast test: een test voor de generatie en de verrijking van Neuronale stamcellen uit Onderscheidende factor voor neurale stamcellen Nakomelingen met behulp van flowcytometrie

We rapporteren een op Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) gebaseerde methode om neurale stamcellen (NSC's) en hun nakomelingen te isoleren uit de subventriculaire zone (SVZ) van de volwassen muizenhersenen. Toegepast op Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgene muizen, maakt het de studie van celcyclusprogressie mogelijk door live beeldvorming.

Celsortering van neurale stamcellen en stamcellen uit de Adult Mouse subventriculaire zone en Live-beeldvorming van de celcyclus Dynamics

Hier beschrijven we een procedure gebaseerd op het gebruik van lentivirale deeltjes voor de langetermijn genetische modificatie van neurale stamcellen en/of hun aangrenzende ependymale cellen in de volwassen ventriculair-subventriculaire neurogene niche, wat de aparte analyse mogelijk maakt van cel-autonome en niet-autonome, niche-afhankelijke effecten op neurale stamcellen.

Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

Een robuust protocol controleren neurale populaties time-lapse video-microscopie gevolgd door softwarematige nabewerking is beschreven. Deze methode geeft een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van biologische gebeurtenissen in een geselecteerde populatie tijdens live imaging experimenten.

Live Imaging gevolgd door eencellige bijhouden van de biologie van de cel van de Monitor en de progressie van de bloedlijn van meerdere neurale populaties

Neurologische processen zoals proliferatie, migratie en neurite uitvloeisel zijn vaak verstoord in neuropsychiatrische ziekten. Dus presenteren we protocollen om te snel en reproducibly beoordelen deze neurologische processen in menselijke iPSC afkomstige NPC's. Deze protocollen toestaan ook de beoordeling van de gevolgen van relevante factoren die de groei en therapeutics NPC ontwikkelingssamenwerking.

Snelle detectie van neurologische fenotypen in menselijke neurale voorlopercellen (NPC)

Hier tonen we de prestaties van een minimale ruggenmerg letsel model in een volwassen muis die de centrale kanaal niche huisvesting endogene neurale stamcellen (NSCs spaart). Laten we zien hoe de bepaling van de neurosphere kan worden gebruikt voor het kwantificeren van activering en migratie van definitieve en primitieve NSCs na verwonding.

Een test van de Neurosphere voor de evaluatie van de activering van de endogene neurale stamcellen in een muismodel van minimale dwarslaesie

Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.

Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen

De gepresenteerde methode combineert de kwantitatieve analyse van DNA Double-strand Breaks (DSBs), celcyclus verdeling en apoptosis om de celcycluspecifieke evaluatie van de inductie en reparatie van DSB mogelijk te maken, evenals de gevolgen van herstel fouten.

Celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptosis na genotoxische stress door flow Cytometrie

We beschrijven de procedure voor de in vitro differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in neuronale cellen met behulp van de hanging drop-methode. Verder voeren we een uitgebreide fenotypische analyse uit via RT-qPCR, immunofluorescentie, RNA-seq en flowcytometrie.

Differentiatie en karakterisering van neurale voorlopercellen en neuronen uit embryonale stamcellen van muizen

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Leer hoe je de celcyclus van neurale stamcellen beoordeelt in muizenhersenen na genotoxische stress met EdU en BrdU. Deze methode helpt onderzoekers om de effecten van ioniserende straling op de hersenontwikkeling te analyseren.

Het beoordelen van de celcyclus van neurale stamcellen en stamcellen in de Mouse ontwikkeling van de hersenen na genotoxische stress (Video) | JoVE Journal

Het beoordelen van de celcyclus van neurale stamcellen en stamcellen in de Mouse ontwikkeling van de hersenen na genotoxische stress

Meer video's verkennen