Anti-nucleaire antilichaam screening met HEp-2 cellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om een indirecte immunofluorescentie-assay te gebruiken voor het screenen op antinucleaire antilichamen. Dit wordt bereikt door patiëntenserum te incuberen met Hep-2 substraatplaatjes. Het ongebonden patiëntenserum wordt weggewassen, waarna de gebonden autoantilichamen worden geïncubeerd met een specifiek fluoresceïne-gelabelled conjugaat, waarna het ongebonden reagens wordt weggewassen.

Wanneer deze via een fluorescentiemicroscoop worden bekeken, vertonen auto-antilichaam-positieve monsters een appelgroene fluorescentie die correspondeert met gebieden van de cel of kernen waar het auto-antilichaam is gebonden in een fluorescentiepatroon dat indicatief is voor de aanwezigheid van het antigeen. Uiteindelijk kan de aanwezigheid van arna worden gebruikt om te helpen bij de diagnose van bindweefselziekten. Het belangrijkste voordeel van de indirecte immunofluorescentiemethode ten opzichte van andere methoden, zoals solid-phase Eliza, is dat het Hep-2-celsubstrate meer dan 100 antigenen bevat die in hun natuurlijke configuratie tot expressie komen.

Dit maakt de identificatie van bijna alle klinisch relevante O-antilichamen mogelijk, wat niet mogelijk is met technieken op vaste fase, aangezien de indirecte immunofluorescentiemethode een zeer gespecialiseerde techniek is. Personen die nieuw zijn met deze methode hebben tijd en oefening nodig om bekwaam te worden in de procedure van de preparaatverwerking. Het interpreteren van de microscopische beelden en het leren identificeren van relevante patronen is eveneens een vaardigheid die tijd kost om onder de knie te krijgen.

Met de juiste reagentia en instrumenten zijn de resultaten consistenter en eenvoudiger te interpreteren. De procedure wordt gedemonstreerd door Cassandra Bryant, een technoloog van het Immunofluorescent Assay Development Laboratory. Haal de reagentia uit de verpakking en laat elk item op kamertemperatuur komen; bereid de reagentia voor en verdun het serum van de patiënt volgens de bijsluiter; de objectglazen zijn voorzien van barcodes en kunnen eenvoudig worden geïntegreerd in geautomatiseerde systemen.

Deze procedure illustreert de handmatige verwerking van objectglazen. Laboratoria met een hoge doorvoercapaciteit kunnen echter kiezen voor geautomatiseerde apparatuur voor objectglasverwerking met barcode-scanfunctionaliteit. Inova-instrumenten zijn verbonden via een gecentraliseerd intelligent netwerk dat controle biedt over workflowresultaten en rapportage.

Voor IFA. Dit resulteert in een positieve patiëntidentificatie vanaf de verwerking en het elimineren van transcriptie- en aanverwante fouten. Breng één druppel positieve controle en één druppel negatieve controle aan op het juiste objectglas.

Pipetteer 20 tot 25 µL verdund patiënserum in de overige putjes. Verwerk één objectglas per keer. Plaats het objectglas in een kleuringsbakje met een vochtig papieren handdoekje op de bodem, sluit het bakje en incubeer het objectglas gedurende 30 minuten.

De vochtige omstandigheden voorkomen dat het substraat uitdroogt, wat zou kunnen leiden tot artefactuele kleuring. Tijdens deze incubatieperiode zullen de antinucleaire antilichamen in het serum van de patiënt binden aan antigenen van de cellen die in elke put zijn gefixeerd. Spoel na de incubatieperiode het serum weg met een zachte stroom wasbuffer om beschadiging van het substraat te voorkomen.

Houd het objectglas onder een lichte hoek, zodat de stroom niet direct op het substraat is gericht. Deze positionering van de objectglazen helpt ook om kruiscontaminatie van monsters tussen de wells te voorkomen. Tik het overtollige wasbuffer weg en plaats het objectglas in een Copeland-pot met wasbuffer.

De incubatietijd voor de wasstap moet ongeveer vijf minuten zijn. Verwijder de objectglaasjes uit de wasbuffer en klop ze voorzichtig af. Om de overtollige wasbuffer te verwijderen, brengt u één druppel fluorescent conjugaat aan in elke put.

Voor een NA-test wordt het gebruik van een IgG FC-specifiek conjugaat aanbevolen. Incubeer de objectglazen gedurende 30 minuten in de bevochtigde container en zorg ervoor dat de kleuringsafdekking wordt teruggeplaatst. Het conjugaat is lichtgevoelig en de afdekking beschermt de objectglazen tegen blootstelling aan licht.

Tijdens deze incubatieperiode zal het conjugaat binden aan de antinucleaire antilichamen van de patiënt die zijn gebonden aan de celantigenen. Deze binding van het conjugaat resulteert in de aanwezigheid van fluorescentie in de wells na incubatie. Was het objectglas met wasbuffer.

Plaats, zoals voorheen, een dekglas op een papieren handdoek en breng het monteermedium in een doorlopende lijn aan op de onderste rand van het dekglas. Haal elke objectglas uit de wasbuffer en tik voorzichtig tegen het objectglas. Om de overtollige wasbuffer te verwijderen, raakt u de onderste rand van het objectglas aan de rand van het dekglas.

Laat het objectglas voorzichtig op het dekglas zakken, zodanig dat het montage medium op het dekglas naar de bovenrand van het objectglas stroomt zonder luchtbellen te vormen; het aanbrengen van de optimale hoeveelheid montage medium is een techniek die oefening vereist om te perfectioneren. Bekijk de preparaten met een fluorescentiemicroscoop in een donkere kamer; het scannen van de gehele well dient te worden uitgevoerd met een 20 x of 25 x objectief. Schakel over naar een 40 x objectief om de celdistributie en de uniformiteit van de fluorescentie te beoordelen.

Om de definitieve interpretatie met betrekking tot positiviteit en patroon vast te stellen, dient u naar de positieve en negatieve controles te kijken. De negatieve controle is mogelijk niet volledig donker, maar vertoont vaak een laag niveau van aspecifieke fluorescentie. De positieve controle zal heldere appelgroene fluorescentie in de nucleus vertonen.

Positiviteit kan worden gegradeerd met behulp van een reactiviteitsschaal van één plus tot vier plus. Naast handmatige interpretatie kunnen coupes worden geladen en gescand door de automatische fluorescentiemicroscoop. Een donkere kamer is niet nodig.

Nadat een project is aangemaakt door het juiste dia-type te selecteren, legt het instrument digitale beelden met een hoge resolutie van de cellen in elke put vast en slaat deze op. Daarnaast meet Nova view de fluorescentie-intensiteit, categoriseert de resultaten als positief of negatief en biedt patroonherkenning voor positieve monsters. De beelden worden door de operator bekeken op een computermonitor met een hoge resolutie, wat de uiteindelijke interpretatie, herziening en bevestiging van Nova View mogelijk maakt.

Resultatenrapporten kunnen worden gegenereerd op basis van bevestigde resultaten. De binding van auto-antilichamen aan de bestanddelen van de eiwitstructuren in de kern resulteert in vijf belangrijke nucleaire patronen, waaronder homogeen, gespikkeld, centromeer, nucleolair en nucleaire stippen. Om een homogeen patroon te identificeren zoals hier getoond, identificeert u mitotische of delende cellen.

Mitotische cellen vertonen een solide, uniforme fluorescentie, die vaak meer uitgesproken is dan in rustende cellen. De kernen van de rustende cellen moeten uniform zijn met diffuse kleuring. Dit kenmerkende patroon is zeer waarschijnlijk het resultaat van auto-antilichamen tegen dubbelstrengs DNA.

Een kenmerkend aspect van het gespikkelde patroon is het uiterlijk van de metafase-mitotische cellen, dat doet denken aan een muntgleuf. Het chromosomale gebied van deze cellen is negatief. De rustende cellen vertonen een gespikkelde structuur door de gehele kern.

De spikkeltjespatronen kunnen worden gedefinieerd als grof of fijn. Een grof spikkeltjespatroon is het resultaat van auto-antilichamen tegen SM en RNP. Een fijn spikkeltjespatroon kan worden veroorzaakt door auto-antilichamen tegen S-S-A-S-S-B, maar ook door RNA-polymerase.

Het DFS-patroon wordt aangeduid als dens, fijn gespikkeld en is indicatief voor auto-antilichamen tegen DFS 70. Mitotische cellen vertonen een gespikkelde kleuring, terwijl rustende cellen uniform verdeelde fijne spikkels door de hele kern vertonen. In deze gevallen moeten bevestigingstesten worden uitgevoerd, aangezien DFS 70 auto-antilichamen veel voorkomen bij gezonde personen vergeleken met patiënten met een bindweefselziekte.

Om het centromeerpatroon te identificeren, scant u de wells en identificeert u mitotische of delende cellen. De delende cellen vertonen talrijke afzonderlijke spikkels die nauw met elkaar geassocieerd zijn, vaak aangeduid als de metafaseplaat. De rustende cellen vertonen ongeveer 40 tot 60 afzonderlijke spikkels die over de hele kern verspreid zijn.

Het centromeerpatroon is geassocieerd met autoantilichamen tegen centromeerproteïnen, evenals het nucleolaire patroon. De kleuring van het chromosomale gebied in mitotische cellen is variabel. Het nucleolaire patroon is geassocieerd met homogene of gespikkelde kleuring van de kernen, samen met zwakke, gespikkelde of homogene kleuring van het nucleoplasma van de rustende celkernen.

Dit patroon is geassocieerd met autoantilichamen tegen RNA-polymerase III, fibrilline en PM-SCL-antilichamen. Het nucleaire stipjespatroon is geassocieerd met negatieve metafase, mitotische cellen en enkele discrete stipjes in de rustende celkernen. Dit kenmerkende patroon is vaak het resultaat van autoantilichamen tegen SP 100, PML of P 80 colan.

Deze antilichamen zijn geassocieerd met primaire galwegcirrose en auto-immuunhepatitis. In de getoonde afbeelding vertoont het nucleaire stipjespatroon cytoplasmatische kleuring als gevolg van auto-antilichamen tegen mitochondriële antigenen. De detectie van antinucleaire antilichamen en patroonherkenning dienen als een belangrijk hulpmiddel bij de diagnose van patiënten.

Inzicht in het belang van verschillende patronen stelt clinici en laboratoriumpersoneel in staat om de juiste vervolgonderzoeken uit te voeren. De belangrijkste factoren voor een correcte identificatie van antinucleaire antilichaampatronen zijn de selectie van een hoogwaardig cellensubstraat en het verwerken van de coupes met een consistent goede techniek. Het beoordelen van de coupes gebeurt traditioneel via fluorescentiemicroscopie in donkere kamers en wordt uitgevoerd door getrainde technologen die bekend zijn met de verschillende patronen in de context van de celcyclus en celmorfologie.

In de afgelopen jaren zijn digitale beeldsystemen ontwikkeld voor het geautomatiseerd aflezen van coupes; dergelijke instrumenten automatiseren de workflow en verhogen de consistentie van het aflezen en de interpretatie. Bovendien elimineert het gebruik van gebarcodeerde coupes, waardoor monsters gedurende het hele proces traceerbaar zijn, potentiële transcriptiefouten en verhoogt het de dataintegriteit en patiëntveiligheid. Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u elke stap van de indirecte immunofluorescentieprocedure uitvoert en hoe u klinisch relevante antinucleaire antilichaampatronen identificeert.