Metingen van veranderingen in tactiele gevoeligheid in de achterpoot van muizen met behulp van een elektronisch von Frey-apparaat
19 december 2013
Elektronische von Frey metingen zijn een effectieve en verbeterde alternatief voor klassieke von Frey filamenten, omdat ze snelle en nauwkeurige meting van veranderingen in mechanische onttrekkingsdrempels bij knaagdieren mogelijk maken naar continu toegepaste drukstimulering vóór en na een ontstekingsgebeurtenis.
Het algemene doel van deze procedure is het meten van de afwezigheid van gevoelige reacties op mechanische druk in de achterpoot van muizen. Dit wordt bereikt door de dieren eerst op een rasterbodem van metaaldraad te plaatsen en hen de tijd te geven om te wennen. Een polypropyleen tip wordt tegen de onderkant van de achterpoot geplaatst, waarna de druk geleidelijk wordt verhoogd.
Zodra de passende gedragsreactie is waargenomen, wordt de stimulus weggetrokken. Nadat de baselinewaarden zijn verzameld, ondergaan de dieren een experimentele interventie voordat er verder wordt getest. Uiteindelijk worden veranderingen in de drempelwaarden voor het terugtrekken van de achterpoot vergeleken tussen de behandelingsgroepen om het effect van een specifieke behandeling op veranderingen in de tactiele gevoeligheid voor druk te bepalen.
Pijn is een essentieel onderdeel van ontsteking. Het is belangrijk om pijn in verschillende contexten te meten en te karakteriseren. Deze relatief eenvoudige methode voor pijnbeoordeling kan worden toegepast op veel verschillende ontstekingsmodellen.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Tiana, een onderzoekstechnicus in mijn laboratorium, Madison Mack, die als undergraduate student aan dit werk heeft meegewerkt, en Akila Sykes, momenteel een undergraduate student in mijn laboratorium. We beginnen met het opstellen van de testapparatuur voor gemakkelijke toegang tot de achterpoten.
Plaats individuele kamers op een gaasbodem. De gaasbodem moet zich op een comfortabele hoogte bevinden en op een stevig oppervlak staan. Plaats vervolgens het elektronische Von Frey-apparaat op het werkvlak.
Zorg ervoor dat de probe en de kabel correct zijn aangesloten op de display-eenheid en schakel het instrument in de setup-modus in. Stel de aflezing in op nul en plaats voorzichtig het meegeleverde testgewicht op de conus van de Von Frey-probe. Noteer de aflezing en herhaal deze procedure aan het einde van de test; als er een verschil is tussen de twee waarden, moet het apparaat mogelijk opnieuw worden gekalibreerd.
Selecteer een polypropyleen tip van de juiste maat voor het te testen weefsel. Starre tips werken goed voor het minder gevoelige, taaiere weefsel van de achterpoot. Plaats de tip voorzichtig op de conus van de probe.
Schakel vervolgens van de instellingsmodus naar de operationele modus. Dit toont de maximale uitgeoefende druk wanneer de probe wordt ingetrokken. Er zijn twee onderzoekers nodig om de drempelwaarden voor het terugtrekken van de achterpoot te meten.
Eén persoon om het apparaat te bedienen en de metingen uit te voeren, en een andere persoon om deze metingen te registreren om bias te verminderen. De onderzoeker die de anesthesiETER bedient, moet blind zijn voor zowel de behandelingen als de geregistreerde waarden van de ontsnappingsdrempel. Bovendien moet, om de consistentie tussen de metingen te waarborgen, dezelfde persoon alle baseline- en ontsnappingsdrempelwaarden registreren.
48 uur voor de behandeling worden de eerste nulmetingen geregistreerd. Plaats absorberend materiaal onder het statief om uitgescheiden afval op te vangen. Nadat de tip is gemonteerd en de probe is genulled, moet de experimentator die de metingen registreert de muizen in individuele kamers plaatsen.
Dek de kamers af met geperforeerde deksels en plaats een zwaar object erop. Om te voorkomen dat de muizen ontsnappen, laat u de muizen 15 minuten wennen aan de kamer voordat u verdergaat. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben met de geleidelijke toepassing van verhoogde druk en met het vaststellen van de interne consistentie van hun eigen metingen; oefening is essentieel voor het genereren van reproduceerbare resultaten.
Til de probe zodra u er klaar voor bent met beide handen langzaam op en stimuleer het voetzoolkussentje van zowel de linker- als de rechterachterpoot. Verhoog de druk geleidelijk totdat er een nociceptief gedrag wordt waargenomen. Dit wordt gekenmerkt door het intrekken van de achterpoot, het likken van de achterpoot of door het springen met de poot.
Instrueer de andere onderzoeker om de druk vast te leggen die het waargenomen gedrag uitlokte. Tijdens de meting is het nuttig om de muis aan te moedigen stil te blijven zitten door een voedselpalet net buiten de kamer te plaatsen of door een zacht geluid te maken, zoals een lichte tik, voordat de meting wordt uitgevoerd. Ga door naar de volgende muis totdat elke muis één keer is getest en herhaal deze procedure nog vier keer.
Nadat vijf basiswaarden zijn verzameld, wordt voor elke muis een gemiddelde bepaald. Herhaal de basismetingen na 24 uur en gebruik deze waarden om een nieuw gemiddelde te berekenen. Om te waarborgen dat alle muizen consistente basisresponsen vertonen, worden dieren uitgesloten met een gemiddelde basisdrempel voor terugtrekking lager dan 3,5 gram of met basistrempels die twee gram of meer verschillen.
Wijs tot slot de muizen toe aan afzonderlijke behandelingsgroepen, zodat de gemiddelde baseline voor onttrekking van elke groep zo vergelijkbaar mogelijk is. Hier werden de onttrekkingsdrempels gemeten na toediening van het gif aan de achterpoot, ROS raca. Controlemuizen die met zoutoplossing waren behandeld, vertoonden op alle tijdstippen weinig verandering ten opzichte van de baseline.
De geteste nociceptieve responsen bij de behandelde muizen bleven duidelijk behouden tot zes uur na injectie. Daarnaast was weefseloedeem, kenmerkend voor inflammatie, zichtbaar in de met gif behandelde achterpoten, maar niet in de met saline behandelde poten. De door gif geïnduceerde veranderingen in de tactiele gevoeligheid gingen gepaard met een neutrofieleninstroom van bijna 1000-voudige sterkte.
In vergelijking met zoutoplossing-behandelde achterpoten, waren de plantaire mestcellen in het weefsel van de achterpoot grotendeels intact of vertoonden zij milde degranulatie. Daarentegen vertoonden gepaarde achterpoten 15 tot 20% matige en uitgebreide degranulatie van mestcellen. Deze techniek kan worden aangepast om de mechanische of tactiele gevoeligheid in een breed scala aan andere weefsels dan de achterpoot te beoordelen.
Daarom kan deze techniek worden geïntegreerd in veel verschillende knaagdiermodellen voor ontsteking en pijn.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het meten van nociceptieve reacties op mechanische druk in de achterpoot van muizen met behulp van elektronische von Frey-metingen. Deze techniek maakt een snelle en nauwkeurige beoordeling mogelijk van veranderingen in mechanische terugtrekkingen drempels vóór en na inflammatoire interventies.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsevaluatie
- Ontstekingsmodellen
Achtergrond
- Het meten van pijn is cruciaal voor het begrijpen van ontsteking.
- Een elektronisch von Frey-apparaat biedt voordelen ten opzichte van klassieke methoden.
- Nauwkeurige meting van terugtrekdrempels is essentieel voor reproduceerbaarheid.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende knaagdiermodellen.
Doel van de studie
- Om de mechanische gevoeligheid in reactie op drukstimuli te beoordelen.
- Om de effecten van behandelingen op nociceptief gedrag te evalueren.
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor pijnpijnbeoordeling in onderzoek.
Gebruikte methoden
- Habituatie van muizen op een gaasbodem.
- Geleidelijke toepassing van druk met behulp van een polypropyleentip.
- Registratie van drempelwaarden voor terugtrekking door twee geblindeerde onderzoekers.
- Vergelijking van baseline- en post-behandelingsmetingen.
Belangrijkste resultaten
- Er werden significante veranderingen in de terugtrekdrempels waargenomen na de behandeling.
- De ontsteking werd gekenmerkt door weefseloedeem en neutrofieleninflux.
- De mestceldegranulatie varieerde tussen de behandelingsgroepen.
- De methode bleek aanpasbaar voor diverse weefsels.
Conclusies
- De elektronische von Frey-methode is effectief voor het beoordelen van pijn bij knaagdieren.
- Deze techniek kan het begrip van de mechanismen van inflammatoire pijn vergroten.
- Het biedt een basis voor toekomstige studies naar pijn en de effectiviteit van behandelingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het beoordelen van veranderingen in de tactiele gevoeligheid in knaagdiermodellen verschaft cruciale gegevens in de vroege fase voor de validatie van analgesie-doelwitten en het mechanistisch beperken van risico's bij de ontwikkeling van pijntherapieën. De elektronische von Frey-methode maakt een snelle, kwantitatieve meting van mechanische terugtrekdrempels mogelijk, wat een reproduceerbare preklinische evaluatie van inflammatoire en neuropathische pijnmodellen ondersteunt. Deze aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in de doelwitinteractie en de therapeutische effectiviteit voordat verbindingen naar latere studiefasen worden overgegaan.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen met betrekking tot nociceptieve paden en mechanismen van pijnmodulatie mogelijk.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door kwantificeerbare, intern gecontroleerde metingen van de tactiele gevoeligheid over verschillende behandelgroepen te leveren.
- Voorspellende waarde: Faciliteert de triage van portfolio's door objectieve vergelijking van baseline- en post-interventie-tergdrempels om doelwitmodulatie te beoordelen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door gestandaardiseerde basismetingen van de tactiele gevoeligheid vast te stellen.
- Reproduceerbaarheid: Maakt consistente, herhaalde metingen binnen korte tijdsbestekken mogelijk, wat bijdraagt aan de standaardisatie van de assay en de vergelijkbaarheid tussen groepen.
- Schaalbaarheid: Maakt meerdere metingen per subject mogelijk, waardoor de doorvoer en betrouwbaarheid voor compound-screeningcampagnes worden verhoogd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert door ontsteking geïnduceerde mechanische allodynie, wat overeenkomt met klinische pijnfenotypes bij inflammatoire en neuropathische aandoeningen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen discovery- en preklinische workflows door mechanistisch relevante, kwantificeerbare resultaten van pijnsensitiviteit te verschaffen.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen op basis van reproduceerbare veranderingen in onttrekkingsdrempels na experimentele interventies.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De elektronische von Frey-methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische effectiviteitsonderzoeken, in het bijzonder voor pijnmodulerende verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypotheseoverdracht en het verduidelijken van signaalpaden door nociceptieve reacties op mechanische druk te meten als functionele read-out van target-interactie.
- Screening: Levert assay-ready, reproduceerbare kwantitatieve resultaten die essentieel zijn voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen in pijnmodellen.
- Analytics: Biedt nauwkeurige metingen van de terugtrekdrempel en statistische vergelijkbaarheid tussen baseline- en behandelcondities.
- Translationeel Onderzoek: Maakt de koppeling naar preklinische validatie via ziekterelevante resultaten van mechanische gevoeligheid in inflammatiemodellen.
- Enterprise Hergebruik: Fungeert als een herbruikbare platformcapaciteit voor meerdere inflammatoire en neuropathische pijnmodellen, waardoor redundante assayontwikkeling wordt verminderd.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in target-validatie door mechanistische ambiguïteit in de modulatie van pijnpaden te verminderen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare metingen van de tactiele gevoeligheid met minimale technische variabiliteit.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen, waardoor de kapitaalefficiëntie wordt vergroot en uitval in een laat stadium door een gebrek aan target-gemedieerde effectiviteit wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritisering van verbindingen mogelijk op basis van kwantificeerbare effecten op mechanische terugtrek-drempelwaarden.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist training in gedragsobservatie en het identificeren van nociceptieve reacties om meetconsistentie te waarborgen.
- Afhankelijk van een gekalibreerd elektronisch von Frey-apparaat en de juiste selectie van polypropyleen tips voor het weefsel van de achterpoot.
- Vereist blindering van operators en registratoren voor de behandelcondities om bias bij de registratie van de drempelwaarde te minimaliseren.
- Omvat exclusiecriteria op basis van variabiliteit in de baselinestrempelwaarde om groepshomogeniteit en dataintegriteit te waarborgen.
- Beperkt tot meetbare gedragsreacties; vereist duidelijke nociceptieve eindpunten zoals het terugtrekken van de poot, likken of springen.
