Name: Cytotoxische werkzaamheid van fotodynamische therapie bij osteosarcoomcellen In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Leer fotodynamische therapie voor osteosarcoomcellen met M-T-H-P-C en laserlicht. Deze methode meet celopname en cytotoxiciteit via WST-1-assay voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag biolitec Research GmbH (Jena, Duitsland) bedanken voor het vriendelijk ons ​​met de liposomale mTHPC formulering, met speciale dank aan Susanna Gräfe en Arno Wiehe voor hun hulp en technische expertise. We willen ook graag Kerstin Reidy, die een groot deel van de gegenereerde resultaten en was medeverantwoordelijk voor de publicatie 11 bedanken. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Schweizerischer Verein Balgrist, de Universiteit van Zürich, de Krebsliga Zürich alsook door een subsidie ​​van de Walter L. en Johanna Wolf Foundation, Zürich, Zwitserland en een subsidie ​​van EuroNanoMed ERA-NET / SNF Zwitserse National Science Foundation 31NM30-131004/1. Dit werk werd ook ondersteund door de HSM (zeer gespecialiseerde Medicine) programma Musculoskeletale Oncologie van het Kanton Zürich.

1. Vergelijking van de opname van mTHPC in de respectieve lage en zeer gemetastaseerde HOS en 143B OS cellijnen <ol><li> Bereid celcultuur medium met DMEM, Ham F12, en warmte geïnactiveerd foetaal kalf serum in een verhouding 4.5:4.5:1. Opmerking: De liposomale formulering van de PS mTHPC werd opgelost in water bij een eindconcentratie van 1,5 mg / ml mTHPC. </li><li> Plaat 0,2 x 10 6 HOS en 143B cellen / putje in 6-well platen (drievoud voor elke conditie) en laat de cellen hechten overnachten. Opmerking: het aantal worden aangepast aan de individuele cellijnen. Een confluentie van 80-90% het meest geschikt ten tijde van het experiment. </li><li> Op de volgende dag, incubeer de cellen met een vaste concentratie van mTHPC voor verschillende perioden (tijdsafhankelijke opname), of met toenemende concentraties van mTHPC gedurende een vaste periode (dosis-afhankelijk opname). </li><li> Incubeer de cellen met mTHPC voor bepaalde tijd points of concentraties van mTHPC. Opmerking: In dit onderzoek, zowel de HOS en 143B cellijnen werden geïncubeerd met 0,6 ug / ml mTHPC voor 0, 2.5, 5, of 10 uur, of 0, 0,6, 2,5 en 10 ug / ml mTHPC 5 uur. De toegepaste perioden en doseringen kunnen variëren afhankelijk van de cellijn die wordt gebruikt. </li><li> Vergeet niet om altijd in het donker of in gedempt licht omstandigheden aan direct licht blootstelling van de cellen te voorkomen. </li><li> Na incubatie van de cellen bij de aangegeven omstandigheden, zuig het medium en was de cellen driemaal met PBS. Vervolgens maak de cellen met 0,5 ml trypsine / EDTA en tel de cellen. </li><li> Na losmaken, centrifuge de cellen bij 400 g gedurende 5 minuten, zuig het medium en resuspendeer de cellen in PBS tot een uiteindelijke dichtheid van 200.000 cellen / ml. </li><li> Pipetteer 100 ul van de verkregen celsuspensie (bijvoorbeeld 20.000 cellen) in een 96-wells plaat en meet de fluorescentie van deze cellen in een fluorescentie spectrofotometer. De instellings voor mTHPC fluorescentie metingen zijn: 417 nm voor de excitatie en 652 nm voor de emissie. </li><li> Om de hoeveelheid per cel geïnternaliseerd mTHPC berekening normaliseert de relatieve fluorescentie eenheid (RFU) voor het aantal cellen en celvolume als volgt: </li><li> Bereid een standaard curve met behulp van verschillende concentraties mTHPC in PBS 0-4 ug / ml (gebruik drievoud metingen). Pipetteer 100 ul van elke verdunning in een 96-wells plaat en meet de fluorescentie van de putten met de in stap 1.6 beschreven instellingen. </li><li> Verdeel de RFU (verkregen 20.000 cellen) door de helling van de lineaire standaardkromme van mTHPC, waarin de concentratie van mTHPC (in ug / ml) in de put geeft. </li><li> Verdeel deze mTHPC concentratie 10 aan de totale hoeveelheid mTHPC in een putje (in mg, die 100 gl celsuspensie) krijgen en verdeel deze waarde door de hoeveelheid van 20.000 cellen. </li><li> Bereken het volume met de formule voor een bol: (4/3 x π) xr 3. Haal de straal r van de diameter van 20 getrypsiniseerd cellen onder een microscoop en deze waarde te delen door 2. </li><li> Tenslotte normaliseren alle waarden die verkregen HOS-cellen na 10 uur incubatie (dosisafhankelijk opname) of behandeld met 10 ug / ml mTHPC (tijdsafhankelijke opname), die zijn ingesteld op 100%. </li></ol> 2. Meting van de fototoxiciteit van PS in vitro <ol><li> Seed 3000 cellen / putje in een 96-well plaat (drievoud voor elke concentratie van mTHPC gebruikt) en laat ze zich &#39;s nachts. Evenzo bereidt een extra 96-well plaat en behandelen cellen zoals hierna beschreven, maar zet ze opzij voor fasecontrast. Opmerking: het aantal worden aangepast voor elke cellijn. Een confluentie van 50-60% op het moment van het experiment is ideaal. <ol><li> Houd in gedachten de corresponderende donkere toxiciteit controle cellen, voor elke van de mTHPC concentraties. Dese cellen die in de afwezigheid of aanwezigheid van bepaalde concentraties mTHPC worden geïncubeerd, maar niet verlicht. </li></ol></li><li> De volgende dag, incubeer de cellen met verschillende concentraties mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0.03, 0.075, 0.15, 0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5, en 10 ug / ml) afhankelijk van de cellijnen en houden in het donker gedurende 5 uur. <ol><li> Zie sectie 1.3.2 Opmerking: De incubatietijd voor verlichting afhankelijk van de cellijn en de PS gebruikt, daarom is het raadzaam om verschillende concentraties en verschillende tijdstippen testen afzonderlijke experimenten. </li></ol></li><li> Na incubatie gedurende de vermelde periode, was de cellen tweemaal met PBS en voeg nieuwe vers medium zonder mTHPC. </li><li> Verlicht de cellen met een 652 nm diodelaser, specifiek voor de mTHPC absorptiespectrum (zie Figuur 1). <ol><li> Stel de laser 21,88 mW / cm 2 vermogen op een hoogte van 13,5 cm distance van de cellen teneinde een energie dosis van 5 J / cm 2 krijgen. Verlichten de cellen voor 230 sec. Niet verlichten de donkere toxiciteit controle cellen (met en zonder mTHPC). Opmerking: Draag altijd een bril om de ogen te beschermen tegen het laserlicht gebruikt voor excitatie van de PS. </li></ol></li><li> Na belichting, houden de cellen in het donker bij 37 ° C gedurende 24 uur. Vervolgens voeg water oplosbare tetrazolium (WST-1) reagens (10 μl/100 ul medium). </li><li> Drie uur na de toevoeging van de WST-1 reagens, meet de absorptie van de afzonderlijke putjes van de 96-well plaat bij 415 nm. </li><li> Om het percentage overlevende cellen berekenen set het gemiddelde van de verkregen resultaten voor de niet mTHPC behandelde cellen voor elke conditie 100% (dwz verlicht zonder mTHPC en nonilluminated zonder mTHPC) waarden. </li></ol> 3. Schatting van het aantal cellen door Celtelling <ol><li> Seed 20.000 cellen / well in een 24-well plaat en laat ze zich &#39;s nachts. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 5 uur met mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6 en 1,25 ug / ml) en verlichten ze als hierboven beschreven. </li><li> Verzamel het medium, was de cellen eenmaal met PBS, trypsinize ze en verzamel door centrifugatie bij 400 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Na centrifugatie zuig het medium en resuspendeer de cellen in 200 pl vers medium. </li><li> Tel de cellen in een Neubauer kamer. </li></ol>

<ol><li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li>
<li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+cancer%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li>
<li>D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appraising+the+current+role+of+chemotherapy+for+the+treatment+of+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma.</a> Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).</li>
<li>Allison, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meta-analysis+of+osteosarcoma+outcomes+in+the+modern+medical+era%5BTitle%5D)+AND+%22Sarcoma%22%5BJournal%5D)">A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era.</a> Sarcoma. , (2012).</li>
<li>Anninga, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapeutic+adjuvant+treatment+for+osteosarcoma%3A+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand.</a> Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).</li>
<li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+relapse+in+patients+with+osteosarcoma+of+the+extremities+treated+with+neoadjuvant+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy.</a> Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).</li>
<li>Briccoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resection+of+recurrent+pulmonary+metastases+in+patients+with+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma.</a> Cancer. 104, 1721-1725 (2005).</li>
<li>Milla Sanabria, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+photodynamic+therapy+effects+on+the+cellular+and+molecular+components+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).</li>
<li>Mitra, S., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysical+parameters%2C+photosensitizer+retention+and+tissue+optical+properties+completely+account+for+the+higher+photodynamic+efficacy+of+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin+vs+Photofrin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin.</a> Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).</li>
<li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+photosensitizer%2C+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin%2C+for+use+in+photodynamic+therapy%3A+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li>
<li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li>
<li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells%2C+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li>
<li>Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy in oncology.</a> Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).</li>
<li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of belangenconflicten.

Om optimale cytotoxiciteit in reactie op PDT bereiken, is het cruciaal om de juiste laserlicht instellingen en incubatietijden kiezen. De hier beschreven procedures zijn consistent en efficiënt naar PS opname te bepalen en PDT geïnduceerde cytotoxiciteit kwantificeren in vitro. De specifieke absorptie golflengten van de PS mTHPC, kan de cellulaire PS opname worden bepaald in een directe wijze en het PS kan worden geactiveerd om cytotoxische reactieve zuurstof species genereren. Met ...

Staat vandaag of the art behandeling van osteosarcoom (OS), een primaire bottumor, omvat een combinatie van neo adjuvante chemotherapie en chirurgie. Deze behandeling regime onthulde een verhoging van de overleving van patiënten met gelokaliseerde ziekte van ongeveer 20% voor het gebruik van chemotherapie, om nog 60-70% 3, 4. Echter, in de laatste twee decennia, de algehele overleving van OS patiënten met plaatselijke ziekte is plateaued 4, 5. Bovendien 30-40% van de patiënten een recidief binnen 3 jaar na diagnose en patiënten met metastasen steeds een slechte overleving van 20-30% 4, 6, 7 hebben. De uitkomst van deze patiënten te verbeteren, moeten nieuwe therapeutische strategieën worden ontwikkeld. Fotodynamische therapie (PDT), een vrij nieuwe therapie tegen kanker, maakt gebruik van licht van een specifieke golflengte voor excitatie van een photosensiTizer (PS), dat zich ophoopt in de tumorcellen na injectie in de bloedbaan. Laserlicht excitatie van de PS genereert zuurstofradicalen in aanwezigheid van zuurstof cytotoxische reactie in tumorcellen en celdood induceren. Naast deze primaire mechanisme, twee extra PDT opgeroepen biologische processen bijdragen aan verminderde tumorgroei: PDT veroorzaakt vasoconstrictie en bloedpropvorming van de tumor microvasculature en bijgevolg lokale hypoxie en anoxie in de tumor, wat leidt tot tumor infarct. Tenslotte PDT gewond en stervende tumorcellen leiden tot een lokale immuunreactie, een vrij unieke eigenschap van PDT. Dit houdt het complementsysteem en de activering van antigeen-presenterende dendritische cellen 8. Zo worden voorwaarden geschapen voor de presentatie van tumorantigenen met daaropvolgende activatie van lymfoïde cellen, leidend tot tumorspecifieke immuniteit. Tot dusver is PDT gebruikt om verschillende soorten wekedelentumoren en hyperpl behandelenazië, zoals actinische keratose, Barrett-slokdarm, endobronchiale tumoren, blaaskanker, basaalcelcarcinoom en palliatieve behandeling van hoofd-halskanker 2. De behandeling is bekend dat lokale, grootschalige necrose met weinig bijwerkingen, en heeft dus de potentie om tumorweefsel selectief roeien. Ondanks deze voordelen, de toepassing van PDT blijft technisch veeleisender dan de toediening van chemotherapeutische geneesmiddelen. Met het oog op maximale efficiëntie, de PS concentratie, blootstelling aan licht en de totale licht energie-overdracht te realiseren moeten worden geoptimaliseerd. Dit kan in vivo experimenten, maar vanwege het relatief grote aantal parameters die moeten worden geoptimaliseerd, is het efficiënter om eerst te bepalen optimale omstandigheden in vitro. In de hieronder beschreven experimenten hebben we de in vitro werkzaamheid van PDT getest met PS 5,10,15,20-tetrakis (meta-hydroxyfenyl) chlOrin, afgekort mTHPC (Figuur 1A). mTHPC is de werkzame stof in het geneesmiddel foscan, die momenteel wordt gebruikt in de kliniek voor palliatieve behandeling van hoofd-en halskanker. Het is een van de meest potente PS, induceren massieve celbeschadiging reeds bij lage concentraties, en werd aangetoond superieur aan andere PS zijn in termen van weefselpenetratie 9, 10. Het licht absorptiespectrum (figuur 1B) toont twee prominente pieken, een bij 417 nm en een tweede bij 652 nm, die worden gebruikt voor weefsellokalisatie van het verzamelen PS en PDT inductie, respectievelijk. Momenteel is een liposomale formulering voor mTHPC is in ontwikkeling. Hier beschrijven we de procedures om de opname van deze liposomale formulering te kwantificeren, en PDT presteren in twee menselijke OS cellijnen, de lage metastatische HOS en de hoge metastatische 143B cellen. Sommige van de hier gepresenteerde gegevens zijn eerder 11 vermeld. The hier beschreven aanpak stelt ons in staat om het effect van een metastatische fenotype op PDT effectiviteit te bestuderen. 143B cellen, orthotopically geïnjecteerd in de achterste ledematen van immuun deficiënte SCID muizen veroorzaken intratibial metastasizing primaire tumoren, een model nauw nabootsen van de menselijke uitzaaiingen ziekte. Dus de voorgestelde in vitro experimenten zijn uitermate geschikt om te beoordelen de optimale instellingen PDT later gebruik in in vivo experimenten.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>PAA GmbH, Freiburg, Duitsland</td><td>E15-883</td><td></td></tr><tr><td>HAM F12</td><td>PAA GmbH, Freiburg, Duitsland</td><td>E15-817</td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactivated foetaal runderserum</td><td>GIBCO, Basel, Zwitserland</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>mTHPC</td><td>biolitec Research GmbH, Jena, Duitsland</td><td></td><td>Aangezien deze liposomale formulering afkomstig is van R&amp;D is er op dit moment geen catalogusnummer beschikbaar. Voorraad: 1,5 mg/ml; geleverd in een 9:1-mengsel van dipalmitoylfosfatidylcholine (DPPC) en dipalmitoylfosfatidylglycerol (DPPG; >99% zuiverheid)</td></tr><tr><td>Spectramax Gemini XS plate reader</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>ID# 861</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Zeiss Observer.Z1</td><td>Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceralas PDT 652 nm Laser</td><td>biolitec AG, Jena, Duitsland</td><td>LD652nm2W400u</td><td></td></tr><tr><td>Wateroplosbaar tetrazolium (WST) reagens</td><td>Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Zwitserland</td><td>1644807</td><td></td></tr></tbody></table>

cytotoxische werkzaamheid van fotodynamische therapie bij osteosarcoomcellen<em&gt; in vitro</em

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

De laatste jaren is het moeilijk een efficiëntere therapie tegen kanker met minder systemische bijwerkingen geweest. Daarom fotodynamische therapie is een nieuwe benadering voor een tumor selectieve behandeling. Fotodynamische therapie (PDT) die gebruik maakt van een niet-toxisch fotosensibilisator (PS), dat na activering met licht van een bepaalde golflengte in aanwezigheid van zuurstof, genereert zuurstof radicalen die een cytotoxische reactie 1 wekken. Ondanks de goedkeuring van bijna twintig jaar geleden door de FDA, is PDT tegenwoordig alleen gebruikt voor een beperkt aantal soorten kanker (huid, blaas) en nononcological aandoeningen (psoriasis, actinische keratose) 2 te behandelen. Het grote voordeel van het gebruik van PDT is de mogelijkheid om een ​​lokale behandeling, die systemische bijwerkingen voorkomt voeren. Bovendien kan de behandeling van tumoren bij gevoelige locaties (bijvoorbeeld rond zenuwen of bloedvaten). Hier, een intraoperative toepassing van PDT wordt beschouwd in osteosarcoom (OS), een tumor van het bot, om de primaire tumor satellieten richten achtergelaten in tumor omliggende weefsel na chirurgische resectie van de tumor. De behandeling is gericht op het verminderen van het aantal herhalingen en op het verminderen van het risico van (postoperatieve) metastase. In de huidige studie geven we in vitro PDT procedures om de optimale PDT instellingen voor effectieve behandeling van veel gebruikte OS cellijnen die worden gebruikt om de menselijke ziekte reproduceren gevestigde intratibial OS muismodellen stellen. De opname van de PS mTHPC werd onderzocht met een spectrofotometer en fototoxiciteit werd uitgelokt met laserlicht excitatie van mTHPC bij 652 nm tot celdood beoordeeld met een WST-1 test en door het tellen van de overlevende cellen induceren. De gevestigde technieken stellen ons in staat om de optimale PDT instellingen voor toekomstige studies in diermodellen definiëren. Ze zijn gemakkelijk en snel hulpmiddel voor de evaluatie van de werkzaamheid van PDT <em&gt; In vitro voordat een aanvraag in vivo.

Met de hier gerapporteerde technieken onderzochten we mTHPC-gebaseerde PDT in menselijke OS cellen. Ten eerste, de tijd en dosis afhankelijke opname van mTHPC onderzocht in lage metastatische HOS en in de zeer metastatische 143B OS cellijnen. mTHPC opname kan worden beoordeeld door het meten van de fluorescentie van mTHPC met een fluorescentie spectrofotometer (figuur 2, weergegeven met toestemming van Reidy et al.. 11). Figuur 2A illustreert de opname van mTHPC op e...

Het protocol hier vermeld kan de evaluatie van de effectiviteit van fotodynamische therapie (PDT) in cellijnen en de optimalisering van de PDT instellingen alvorens de therapie diermodellen.

Cytotoxische werkzaamheid van fotodynamische therapie bij osteosarcoomcellen<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de cytotoxische effectiviteit van fotodynamische therapie bij osteosarcoomcellen te tonen. Dit wordt bereikt door eerst de intracellulaire opname van de fotosensibilisator M-T-H-P-C door osteosarcoomcellen te meten. In de tweede stap wordt laserlicht op de cellen aangebracht om de M-T-H-P-C te activeren en cytotoxische zuurstofradicalen te produceren.Ten slotte worden het celmetabolisme en het aantal cellen gemeten door middel van een wateroplosbare tetra oleum een of WST-een assay. Uiteindelijk kan de WST-een assay, evenals directe celtelling, worden gebruikt om de cytotoxiciteit van de fotodynamische therapie op de osteosarcoomcellen te meten. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de therapie van osteosarcoom, omdat het de meting van de effectiviteit van fotodynamische therapie in vitro mogelijk maakt en lijkt op de techniek die momenteel bij patiënten wordt gebruikt.Om de M-T-H-P-C-opname tussen osteosarcoomcellijnen te vergelijken, begint u met het aanleggen van 0,2 keer 10 tot de zesde Hoss en 143 B cellen per putje. In drievoud in zes putjes platen laat de cellen een nacht lang hechten tot een co-fluentie van 80 tot 90% en bekijk ze de volgende dag. Behandel de cellen vervolgens met een vaste concentratie M-T-H-P-C gedurende verschillende tijdsperioden in het donker om de tijdsafhankelijke opname van de fotosensibilisator door de cellen te evalueren. Na de incubatie aspireer je het medium en was je de cellen drie keer met PBS, en los je de cellen vervolgens op met 0,5 milliliter tripsine EDTA en tel je ze.Slinger de cellen vervolgens vijf minuten bij 400 keer G en kamertemperatuur. Aspireer het medium en suspendeer het pellet opnieuw in PBS tot een eindconcentratie van twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter. Pipetteer 100 microliter van de celsuspensie in elke put van een 96.Putjesplaat en meet de fluorescentie van de cellen in een fluorescentiespectrofotometer ingesteld op 417 nanometer excitatie en 652 nanometer emissie. Bereid vervolgens een standaardcurve voor door 100 microliter van nul tot vier milligram per milliliter concentraties van M-T-H-P-C in drievoud aan te leggen. In een 96-putjesplaat en meet de fluorescentie zoals zojuist gedemonstreerd om een standaardcurve te genereren voor het berekenen van de relatieve fluorescentie-eenheid van elke celbevattende put van de eerder gemeten plaat.Om de fototoxiciteit van de fotosensibilisator te meten, zaait u eerst 3000 cellen per putje in drievoud per elke M-T-H-P-C-concentratie in een 96-putjesplaat, inclusief duistere toxiciteitscontrolecellen voor elke FOTOSENSIBILISATOR-concentratie. Laat de cellen een nacht lang hechten tot een co-fluentie van 50 tot 60% de volgende dag. Behandel de cellen met een reeks M-T-H-P-C-concentraties in het donker gedurende vijf uur na de incubatie.Aspireer het medium en was de cellen twee keer met PBS en voeg vers medium toe zonder M-T-H-P-C, specifiek voor het absorptiespectrum van M-T-H-P-C, terwijl je de juiste oogbescherming draagt. Zet een 652 nanometer diodelaser in op een vermogen van 21,88 milliwatt per vierkante centimeter op een hoogte van 13,5 centimeter. Afstand van de cellen om een energiedosis van vijf joule per vierkante centimeter te krijgen.Belicht vervolgens de cellen behalve de duistere toxiciteitscontrolecellen gedurende 230 seconden na de belichting. Houd de cellen 24 uur in het donker bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 10 microliter wst, één reagens toe per 100 microliter medium drie uur na toevoeging van de wst een reagens meet de absorptie van de afzonderlijke putjes bij 415 nanometer.Bereken ten slotte het aantal overlevende cellen naast de WST een assay. Direct tellen van de cellen is een tweede methode voor het meten van celtoxiciteit. Om het percentage levensvatbare cellen te berekenen, zaait u twee keer 10 tot de vierde cellen per putje in 2 24-putjes platen en laat ze een nacht lang hechten.De volgende dag behandel je de cellen vijf uur in het donker met M-T-H-P-C en belicht je ze zoals zojuist gedemonstreerd. Houd duistere controlecellen 24 uur in het donker, verzamel het supernatant, was de cellen eenmaal met PBS en trypsineer ze, en slinger ze ten slotte naar beneden en suspendeer het pellet in 200 microliter vers medium voor het tellen. De resultaten geïllustreerd in deze grafiek tonen in het bovenste paneel de opname van M-T-H-P-C op een tijdsafhankelijke manier met een fluorescentie-intensiteit van de celsuspensie die de intracellulaire niveaus van de M-T-H-P-C vertegenwoordigt.In het onderste paneel. De dosisafhankelijke M-T-H-P-C opname kan worden beoordeeld door de fluorescentie van M-T-H-P-C te meten met een fluorescentiespectrofotometer. Deze grafiek illustreert de opname van een vaste concentratie van M-T-H-P-C op een tijdsafhankelijke manier met de fluorescentie-intensiteit van de celsuspensie die de intracellulaire niveaus van de M-T-H-P-C vertegenwoordigt.In deze grafiek wordt de dosisafhankelijke M-T-H-P-C opname in Haass en 143 B cellen na een vijf uur durende incubatie gedemonstreerd. De opname in de hoog metastaserende cellijn 143 B was significant hoger dan in de laag metastaserende oudergastcellijn. De dosisafhankelijke duistere toxiciteit van de osteosarcoomcellen wordt gedemonstreerd.143 B cellen werden behandeld met verschillende M-T-H-P-C doseringen en vergeleken met onbehandelde cellen en een dosisafhankelijke afname van de metabole activiteit en het aantal cellen gemeten door WST een assay werd waargenomen. Verminderde celviabiliteit werd herkend bij een M-T-H-P-C concentratie gelijk aan en hoger dan 2,5 microgram per milliliter. In de onderste grafiek wordt de dosisafhankelijke toxiciteit van M-T-H-P-C geïllustreerd.De cellen werden behandel

cytotoxic-efficacy-photodynamic-therapy-osteosarcoma-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method for lung cancer treatment. Photosensitizers selectively accumulate in tumor tissue and lead to tumor cell death in the presence of oxygen and the proper wavelength of light. In this protocol video, PDT-based method is used to evaluate the phototoxic potential of a potential photosensitizer in lung cancer cells.

In Vitro Phototoxicity Assay: A PDT-based Method to Evaluate the Phototoxic Potential of a Photosensitizer in Lung Cancer Cells

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method for lung cancer treatment. Photosensitizers selectively accumulate in tumor tissue and lead to tumor cell death in the presence of oxygen and the proper wavelength of light. This video describes the in vivo anti-tumor efficacy analysis using photosensitizer containing nanoparticles in a tumor-bearing mouse, to determine the phototoxic potential of the photosensitizer.

In Vivo Antitumor Efficacy Analysis of PDT: A Technique to Determine the Phototoxic Potential of a Photosensitizer in Tumor Bearing Mice

Hier wordt real-time monitoring van het metabolisme van tumorcellen, gecombineerd met een in vivo kippenembryo chorio-allantoïsche membraan (CAM) model van metastase, gebruikt om nieuwe anti-kanker doelen/middelen te evalueren op hun vermogen om tumorcellen te sensitiviseren voor DNA-beschadigende chemotherapeutica.

Het evalueren van de effectiviteit van Cancer Drug Overgevoeligheid<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Fotodynamische therapie (PDT) is een alternatieve keuze voor de behandeling van longkanker. Om het therapeutische effect van PDT te verhogen, werden op longkanker gerichte nanodeeltjes in combinatie met chemotherapie ontwikkeld. Zowel in vitro als in vivo werden de antikankereffectiviteiten van PDT met bereide nanodeeltjes geëvalueerd.

Antikanker werkzaamheid van Photo Dynamische Therapie met longkanker-Gerichte Nanodeeltjes

Directe inspuiting van kanker afkomstige extracellulaire blaasjes (EVs) leidt tot een herprogrammering van beenmerg, ter ondersteuning van de progressie van de tumor; het is echter onduidelijk welke cellen bemiddelen dit effect. Hierin beschrijven we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken EV-gemedieerde tumor-mesenchymale stamcellen (MSC) interacties in vivo, onthullen een cruciale rol voor EV-opgeleide MSCs in metastase.

Een preklinische muismodel van osteosarcoom definiëren de extracellulaire vesikel-gemedieerde communicatie tussen Tumor en mesenchymale stamcellen

Fotodynamische therapie (PDT) is een medische procedure waarbij de broedtijd van een exogenously toegepaste fotosensitizer (PS) gevolgd door zichtbaar licht photoactivation te induceren van apoptose. We presenteren een in vitro PDT protocol ontworpen om te simuleren van PDT die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de verschillen in PS incubatie en licht behandeling parameters.

Een benadering In Vitro Fotodynamische therapie

Het huidige protocol beschrijft intratibia osteosarcoom celinjectie om muismodellen te genereren met orthotopisch osteosarcoom en pulmonale metastase laesies.

Intratibiale osteosarcoomcelinjectie om orthotopisch osteosarcoom en longmetastase muismodellen te genereren

Hier beschrijven we een nieuw, eenvoudig en goedkoop apparaat om met succes in vitro fotodynamische therapie (PDT) -testen uit te voeren met behulp van tweedimensionale HeLa-celcultuur en verteporfine als een fotosensitizer.

Een in-house gebouwd en licht-emitting-diode-gebaseerd fotodynamisch therapie-apparaat voor het verbeteren van verteporfine cytotoxiciteit in een 2D-celcultuurmodel

Dit protocol presenteert een reeks experimenten die zijn aangenomen voor de evaluatie van fotoschakelbare antikankerpeptiden, die kunnen worden gebruikt bij de preklinische screening van dergelijke verbindingen. Dit omvat cytotoxiciteitsbeoordeling in 2D- en 3D-celculturen, de evaluatie van  ex vivo (modelweefsel) foto-isomerisatie-efficiëntie en in vivo werkzaamheid.

In vitro en in vivo evaluatie van fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen - potentiële kandidaat-geneesmiddelen voor fotofarmacologie van kanker

Het huidige protocol beschrijft de methode voor het opstellen van een patiënt-afgeleid xenotransplantaat (PDX) muismodel met behulp van humaan osteosarcoomweefsel.

Oprichting van een van de patiënt afgeleid xenotransplantaatmuismodel met humaan osteosarcoomweefsel

Leer fotodynamische therapie voor osteosarcoomcellen met M-T-H-P-C en laserlicht. Deze methode meet celopname en cytotoxiciteit via WST-1-assay voor kankeronderzoek.

Cytotoxische werkzaamheid van fotodynamische therapie bij osteosarcoomcellen

Meer video's verkennen