Cytotoxische werkzaamheid van fotodynamische therapie bij osteosarcoomcellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de cytotoxische effectiviteit van fotodynamische therapie bij osteosarcoomcellen te tonen. Dit wordt bereikt door eerst de intracellulaire opname van de fotosensibilisator M-T-H-P-C door osteosarcoomcellen te meten. In de tweede stap wordt laserlicht op de cellen aangebracht om de M-T-H-P-C te activeren en cytotoxische zuurstofradicalen te produceren.

Ten slotte worden het celmetabolisme en het aantal cellen gemeten door middel van een wateroplosbare tetra oleum een of WST-een assay. Uiteindelijk kan de WST-een assay, evenals directe celtelling, worden gebruikt om de cytotoxiciteit van de fotodynamische therapie op de osteosarcoomcellen te meten. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de therapie van osteosarcoom, omdat het de meting van de effectiviteit van fotodynamische therapie in vitro mogelijk maakt en lijkt op de techniek die momenteel bij patiënten wordt gebruikt.

Om de M-T-H-P-C-opname tussen osteosarcoomcellijnen te vergelijken, begint u met het aanleggen van 0,2 keer 10 tot de zesde Hoss en 143 B cellen per putje. In drievoud in zes putjes platen laat de cellen een nacht lang hechten tot een co-fluentie van 80 tot 90% en bekijk ze de volgende dag. Behandel de cellen vervolgens met een vaste concentratie M-T-H-P-C gedurende verschillende tijdsperioden in het donker om de tijdsafhankelijke opname van de fotosensibilisator door de cellen te evalueren. Na de incubatie aspireer je het medium en was je de cellen drie keer met PBS, en los je de cellen vervolgens op met 0,5 milliliter tripsine EDTA en tel je ze.

Slinger de cellen vervolgens vijf minuten bij 400 keer G en kamertemperatuur. Aspireer het medium en suspendeer het pellet opnieuw in PBS tot een eindconcentratie van twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter. Pipetteer 100 microliter van de celsuspensie in elke put van een 96.

Putjesplaat en meet de fluorescentie van de cellen in een fluorescentiespectrofotometer ingesteld op 417 nanometer excitatie en 652 nanometer emissie. Bereid vervolgens een standaardcurve voor door 100 microliter van nul tot vier milligram per milliliter concentraties van M-T-H-P-C in drievoud aan te leggen. In een 96-putjesplaat en meet de fluorescentie zoals zojuist gedemonstreerd om een standaardcurve te genereren voor het berekenen van de relatieve fluorescentie-eenheid van elke celbevattende put van de eerder gemeten plaat.

Om de fototoxiciteit van de fotosensibilisator te meten, zaait u eerst 3000 cellen per putje in drievoud per elke M-T-H-P-C-concentratie in een 96-putjesplaat, inclusief duistere toxiciteitscontrolecellen voor elke FOTOSENSIBILISATOR-concentratie. Laat de cellen een nacht lang hechten tot een co-fluentie van 50 tot 60% de volgende dag. Behandel de cellen met een reeks M-T-H-P-C-concentraties in het donker gedurende vijf uur na de incubatie.

Aspireer het medium en was de cellen twee keer met PBS en voeg vers medium toe zonder M-T-H-P-C, specifiek voor het absorptiespectrum van M-T-H-P-C, terwijl je de juiste oogbescherming draagt. Zet een 652 nanometer diodelaser in op een vermogen van 21,88 milliwatt per vierkante centimeter op een hoogte van 13,5 centimeter. Afstand van de cellen om een energiedosis van vijf joule per vierkante centimeter te krijgen.

Belicht vervolgens de cellen behalve de duistere toxiciteitscontrolecellen gedurende 230 seconden na de belichting. Houd de cellen 24 uur in het donker bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 10 microliter wst, één reagens toe per 100 microliter medium drie uur na toevoeging van de wst een reagens meet de absorptie van de afzonderlijke putjes bij 415 nanometer.

Bereken ten slotte het aantal overlevende cellen naast de WST een assay. Direct tellen van de cellen is een tweede methode voor het meten van celtoxiciteit. Om het percentage levensvatbare cellen te berekenen, zaait u twee keer 10 tot de vierde cellen per putje in 2 24-putjes platen en laat ze een nacht lang hechten.

De volgende dag behandel je de cellen vijf uur in het donker met M-T-H-P-C en belicht je ze zoals zojuist gedemonstreerd. Houd duistere controlecellen 24 uur in het donker, verzamel het supernatant, was de cellen eenmaal met PBS en trypsineer ze, en slinger ze ten slotte naar beneden en suspendeer het pellet in 200 microliter vers medium voor het tellen. De resultaten geïllustreerd in deze grafiek tonen in het bovenste paneel de opname van M-T-H-P-C op een tijdsafhankelijke manier met een fluorescentie-intensiteit van de celsuspensie die de intracellulaire niveaus van de M-T-H-P-C vertegenwoordigt.

In het onderste paneel. De dosisafhankelijke M-T-H-P-C opname kan worden beoordeeld door de fluorescentie van M-T-H-P-C te meten met een fluorescentiespectrofotometer. Deze grafiek illustreert de opname van een vaste concentratie van M-T-H-P-C op een tijdsafhankelijke manier met de fluorescentie-intensiteit van de celsuspensie die de intracellulaire niveaus van de M-T-H-P-C vertegenwoordigt.

In deze grafiek wordt de dosisafhankelijke M-T-H-P-C opname in Haass en 143 B cellen na een vijf uur durende incubatie gedemonstreerd. De opname in de hoog metastaserende cellijn 143 B was significant hoger dan in de laag metastaserende oudergastcellijn. De dosisafhankelijke duistere toxiciteit van de osteosarcoomcellen wordt gedemonstreerd.

143 B cellen werden behandeld met verschillende M-T-H-P-C doseringen en vergeleken met onbehandelde cellen en een dosisafhankelijke afname van de metabole activiteit en het aantal cellen gemeten door WST een assay werd waargenomen. Verminderde celviabiliteit werd herkend bij een M-T-H-P-C concentratie gelijk aan en hoger dan 2,5 microgram per milliliter. In de onderste grafiek wordt de dosisafhankelijke toxiciteit van M-T-H-P-C geïllustreerd.

De cellen werden behandel