Name: Monitoring van de Assemblee van een afgescheiden virulentiewerd Factor behulp van Site-specifieke Crosslinking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Leer hoe je eiwit-eiwitinteracties in levende cellen bestudeert met behulp van site-specifieke fotokruisverbinding en pulse-chase-labeling in E. coli. Deze methode identificeert assemblage-intermediairen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van het Nationaal Instituut voor Diabetes en Spijsverterings- en Nierziekten.

1. Plasmid Construction
<ol>
	<li>Na het klonen van een gen dat codeert voor een eiwit van belang in een geschikte expressievector, introduceer amber mutaties op gewenste locaties met behulp van een site-directed mutagenese kit. 
	OPMERKING: Structurele informatie en voorspellingen van oppervlakte-expositie kunnen nuttige richtlijnen zijn om de posities van mutaties te bepalen. Omdat de efficiëntie van amber-suppressie en cross-linking aanzienlijk kan variëren, moeten amber mutaties op meerdere posities worden geïntroduceerd. Bovendien, omdat Bpa een analoog is van tyrosine en fenylalanine, probeer amber mutaties te introduceren op posities die normaal gesproken grote hydrofobe aminozuren coderen om veranderingen in eiwitstructuur en functie te minimaliseren. Ten slotte, houd er bij het kiezen van een expressievector rekening mee dat het overmatig produceren van een eiwit van belang op een zeer hoog niveau de efficiëntie van Bpa-incorporatie zou kunnen beperken.</li>
</ol>
2. Cultuurvoorbereiding
<ol>
	<li>Gebruik elektroporatie om een geschikte E. coli-stam te transformeren met een plasmide dat het amber-suppressiesysteem codeert (pDULE-pBpa; zie verwijzing4) en een compatibel plasmide dat het eiwit van belang met een amber-mutatie codeert.</li>
	<li>Plaat cellen op LB-agar bevattende geschikte antibiotica (gebruik 5 µg/ml tetracycline om te selecteren voor pDULE-pBpa). Bebroed de platen O/N bij 37 °C.</li>
	<li>De volgende dag start O/N-culturen van enkele kolonies in 3-5 ml M9-medium14 bevattend 0,2% glycerol, alle L-aminozuren behalve methionine en cysteïne (40 µg/ml) en antibiotica. Bebroed bij 37 °C.</li>
	<li>De volgende dag centrifugeer O/N-culturen bij 2.500 x g gedurende 5 min bij RT om cellen te pelletten. Resuspendeer de cellen in 5 ml vers M9-medium en herhaal de centrifugatie. 
	OPMERKING: Deze wasstap is cruciaal om plasmiden te behouden die ampicilline-resistentie coderen, omdat kleine hoeveelheden b-lactamase die aanwezig zijn in het medium van O/N-culturen vers gevoegd ampicilline degraderen voordat significante celgroei optreedt.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 2 ml vers medium en meet de celconcentratie in een spectrofotometer (OD550).</li>
	<li>Voeg cellen toe aan een 250 ml Erlenmeyer kolf bevattend 50 ml M9-medium en antibiotica bij OD550=0,03. Bebroed de culturen bij 37 °C in een schuddende waterbad.</li>
</ol>
3. Bpa-incorporatie en voorbereiding voor fotocrosslinking
OPMERKING: Het hieronder beschreven protocol is voor een monstertijdsverloop dat drie tijdstippen heeft (0, 1 en 5 min). Pas de volumes aan als een ander aantal tijdstippen gewenst is. Een overzicht van de procedure wordt geïllustreerd in Figuur 1.
<ol>
	<li>Terwijl de culturen groeien, bereid een verse 1 M (1.000x) oplossing van Bpa in 1 M NaOH (27 mg Bpa in 100 μl 1 M NaOH) voor. Gebruik een donkerwandige buis om de oplossing in het donker te houden.</li>
	<li>Wanneer de culturen een vroeg tot midden log-fase bereiken (OD550=0,2), voeg 50 μl 1 M Bpa toe aan elke cultuur. Voeg Bpa één druppel per keer toe terwijl je de kolf rond zwaait om precipitatie te voorkomen. Voeg vervolgens eventuele inductoren toe die nodig zijn om de expressie van de amber-mutant aan te drijven. Blijf de culturen gedurende 30 min bij 37 °C bebroeden.</li>
	<li>Tijdens de 30 min inductieperiode label zes wegwerpbare 15 ml centrifugeerbuisjes met het tijdstip (0 min, 1 min, 5 min) en hetzij "+ UV" of "- UV". Plaats de buisjes op ijs.</li>
	<li>Vul een tweede emmer met ijs en plaats een 6-well weefselkweekplaat op het ijs.</li>
	<li>Ontdooi hoog specifiek activiteit (1.000 mCi/mmol) 35S-methionine en 35S-cysteïne (of een vooraf gemaakte mix van de twee verbindingen) voor de pulslabeling en bereid (of ontdooi) een oplossing van niet-radioactieve L-cysteïne en L-methionine (100 mM elk) voor de chase.</li>
	<li>Zet de UV-lamp vijf min voor radiolabeling aan. 
	OPMERKING: De lamp moet instelbaar zijn zodat deze ongeveer 3-4 cm van de monsters in de multiwellplaat kan worden geplaatst.</li>
	<li>Voeg ijs toe (~2 ml) aan elke buis gelabeld "- UV" en aan twee van de putjes in de multiwellplaat. 
	OPMERKING: IJs moet aan een derde put worden toegevoegd onmiddellijk vóór het 5 min tijdstip. Het is essentieel om ijs direct in de buisjes en putjes te plaatsen om intracellulaire reacties onmiddellijk bij elk tijdstip te stoppen en daarmee nauwkeurige "snapshots" van een specifiek biochemisch pad te verkrijgen.</li>
	<li>Aan het einde van de 30 min inductieperiode breng 25 ml van de cultuur over in een voorverwarmde 125 ml wegwerp Erlenmeyer kolf. Plaats de kolf in het 37 °C schuddende waterbad.</li>
</ol>
4. Puls-chase labeling en UV-bestraling
OPMERKING: Het puls-chase labeling en UV-bestraling protocol heeft veel stappen die op tijd moeten worden uitgevoerd en die aanzienlijke organisatie en voorbereiding vereisen. Alle reagentia en buisjes moeten gemakkelijk toegankelijk zijn. Hieronder

<ol><li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+large-scale+data+sets+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions.</a> Nature. 417, 399-403 (2002).</li>
<li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli.</a> PNAS. 99, 11020-11024 (2002).</li>
<li>Farrell, I. S., Toroney, R., Hazen, J. L., Mehr, R. A., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-cross-linking+interacting+proteins+with+a+genetically+encoded+benzophenone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone.</a> Nat. Methods. 2 (5), 377-384 (2005).</li>
<li>Wittelsberger, A., Mierke, D. F., Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+ligand-receptor+interfaces%3A+approaching+the+resolution+limit+of+benzophenone-based+photaffinity+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Mapping ligand-receptor interfaces: approaching the resolution limit of benzophenone-based photaffinity scanning.</a> Chem. Biol. Drug Des. 71, 380-383 (2008).</li>
<li>Ieva, R., Tian, P., Peterson, J. H., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+and+spatially+restricted+interactions+of+assembly+factors+with+an+autotransporter+beta+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Sequential and spatially restricted interactions of assembly factors with an autotransporter beta domain.</a> PNAS. 108, 383-391 (2011).</li>
<li>Wang, F., Robbins, S., Guo, J., Shen, W., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Deiters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+amino+acids+with+novel+reactivity+to+the+genetic+code+of+Saccharyomycescerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharyomycescerevisiae.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 11782-11783 (2003).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+repertoire+of+the+methylotrophic+yeast+Pichiapastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichiapastoris.</a> Biochemistry. 48 (12), 2643-2653 (2009).</li>
<li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nat. Methods. 2 (3), 201-206 (2005).</li>
<li>Liu, W., Brock, A., Chen, S., Chen, S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 4 (3), 239-244 (2007).</li>
<li>Leyton, D. L., Rossiter, A. E., Henderson, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+self+sufficiency+to+dependence%3A+mechanisms+and+factors+important+for+autotransporter+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">From self sufficiency to dependence: mechanisms and factors important for autotransporter biogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 10 (3), 213-225 (2012).</li>
<li>Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+an+autotransporter+passenger+domain+with+BamA+during+its+translocation+across+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Interaction of an autotransporter passenger domain with BamA during its translocation across the bacterial outer membrane.</a> PNAS. 106, 19120-19125 (2009).</li>
<li>Pavlova, O., Peterson, J. H., Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+link+between+barrel+assembly+and+the+initiation+of+autotransporter+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mechanistic link between barrel assembly and the initiation of autotransporter secretion.</a> PNAS. 110, (2013).</li>
<li>Harlow, D., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+D+%22Using+antibodies%3A+a+laboratory+manual%22">Using antibodies: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laborator Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).</li>
<li>Barnard, T. J., Dautin, N., Lukacik, N., Bernstein, P., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autotransporter+structure+reveals+intra-barrel+cleavage+followed+by+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autotransporter structure reveals intra-barrel cleavage followed by conformational changes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (12), 1214-1220 (2007).</li>
<li>Akiyama, Y., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SecY+protein%2C+a+membrane-embedded+secretion+factor+of+E.+coli%2C+is+cleaved+by+the+ompT+protease+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">SecY protein, a membrane-embedded secretion factor of E. coli, is cleaved by the ompT protease in vitro.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 167 (2), 711-715 (1990).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit artikel beschrijft een methode die locatiespecifiek fotocrosslinking combineert met pulse-chase labeling om de dynamische interacties tussen een eiwit van belang en andere componenten van een levende cel te onderzoeken. De methode is vooral nuttig om meertrapsprocessen te bestuderen waarbij het eiwit opeenvolgend interactie heeft met andere factoren. In tegenstelling tot traditionele chemische crosslinking-benaderingen, biedt locatiespecifiek fotocrosslinking gedetailleerde informatie over de status van individuele s...

Het is vaak essentieel om interacties tussen een eiwit van belang en andere cellulaire componenten te identificeren en te karakteriseren om zijn rol in een biologische route te definiëren, zijn samenstelling te begrijpen of zijn werkingsmechanisme te verduidelijken. Er worden vaak verschillende benaderingen gebruikt om eiwit-eiwit interacties te bestuderen, maar ze hebben allemaal hun beperkingen. De eenvoudigste onbevooroordeelde methode om eiwitten die aan een eiwit van belang binden te identificeren, is copurificatie (of co-immunoprecipitatie), maar deze benadering vereist dat een eiwitcomplex intact blijft tijdens de zuiveringsprocedure. Zwakke of tijdelijke eiwitinteracties kunnen worden gestabiliseerd door chemische cross-linking, maar deze methode vereist meestal het gebruik van verbindingen die eiwitten koppelen via primaire aminen die wijd verspreid zijn in de eiwitsequentie. Er kunnen ingewikkelde cross-linking patronen ontstaan die moeilijk te interpreteren zijn, vooral wanneer eiwitten van belang componenten zijn van multi-eiwit complexen. Bovendien, omdat de ruimteramen van chemische cross-linkers meestal langer zijn dan 10 Å, kunnen covalente bindingen worden gevormd met eiwitten die zich in de nabijheid bevinden, maar niet direct interageren met het eiwit van belang. Methoden zoals affiniteitschromatografie en two-hybrid screens zijn ook vaak nuttig om eiwit-eiwit interacties te identificeren. De eerste benadering vereist echter het reproduceren van omstandigheden die fysiologisch significante interacties bevorderen en kan niet worden gebruikt om zwakke interacties te detecteren. De tweede benadering vereist dat bindingsinteracties kunnen worden gerepliceerd in het gastheereiwit en worden gehandhaafd wanneer een eiwit van belang en zijn bindingspartners in de context van een fusie-eiwit worden geplaatst. Two-hybrid methoden hebben ook de neiging om vals-positieve resultaten te genereren2. Zodra een eiwit-eiwit interactie is vastgesteld, is er vaak aanzienlijk werk vereist om de interactieplaats in kaart te brengen. Misschien is het grootste nadeel van traditionele benaderingen dat ze geen informatie geven over de tijdelijke volgorde van intermoleculaire interacties of de kinetiek van binding.
Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode die enkele van de beperkingen van andere benaderingen overwint die worden gebruikt om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Aanvankelijk wordt een enkele amber mutatie geïntroduceerd in het gen dat codeert voor een eiwit van belang. De amber mutant wordt vervolgens geco-expresseerd met een amber suppressor tRNA en een aminoacyl-tRNA synthetase afgeleid van Methanococcus jannaschii die zijn ontworpen om het fotoactiveerbare aminozuur analoog p-benzoylfenylalanine (Bpa) alleen bij amber codons in te bouwen3. Bestraling van cellen met langgolf ultraviolet (UV) licht (~365 nm) vergemakkelijkt vervolgens de vorming van een covalente binding tussen Bpa en eiwitten die zich binnen ~3-8 Å bevinden4,5. In sommige experimentele contexten kunnen cross-links ook worden gevormd tussen geactiveerde Bpa en niet-eiwitcomponenten van cellen zoals lipiden en nucleïnezuren6. Moleculen die worden beëindigd bij het amber codon moeten over het algemeen gemakkelijk onderscheidbaar zijn van het volledige eiwit op SDS-PAGE en kunnen niet worden gekruist met andere eiwitten. Door cellen te onderwerpen aan pulse-chase radiolabeling voorafgaand aan cross-linking en vervolgens cross-linking producten immunoprecipiteren of affiniteitszuiveren, kunnen de sequentie en duur van eiwit-eiwit interacties worden vastgesteld. Het vermogen om tijdelijke informatie te genereren over intermoleculaire interacties is vooral waardevol om de progressie van een eiwit van belang door een geordende multi-staps assemblage, transport of signaalroute te bestuderen en pad-intermediaten te identificeren. Net als chemische cross-linking detecteert locatie-specifiek cross-linking eiwit-eiwit interacties die plaatsvinden onder fysiologische omstandigheden, maar de introductie van een cross-linker op een enkele positie vergemakkelijkt de analyse van interacties tussen individuele segmenten van een eiwit en andere factoren. Deze unieke eigenschap van locatie-specifiek cross-linking is vooral voordelig wanneer het eiwit van belang meerdere segmenten of domeinen heeft die het potentieel hebben om met verschillende bindingspartners te interageren. Bovendien kan locatie-specifiek cross-linking in combinatie met methoden zoals massaspectrometrie worden gebruikt om de residuen die eiwit-eiwit interacties met precisie mediëren in kaart te brengen. Hoewel deze methode is geoptimaliseerd voor gebruik in E. coli, is de incorporatie van fotoactiveerbare aminozuur analogen in eiwitten door amber suppressie gerapporteerd in Mycobacterium, gist en zoogdiercellen7-11. Dus in principe kan onze methode in andere systemen worden gebruikt.
We hebben deze methode uitgebreid gebruikt om intermoleculaire interacties te identificeren die de biogenese van EspP, een E. coli O157:H7 virulentiefactor, vergemakkelijken. EspP is een lid van een superfamilie van eiwitten die bekend staan als "autotransporters" en die een grote N-terminale extracellulaire domein ("passagiersdomein") en een C-terminaal domein ("b domein") bevatten dat zich opvouwt in een cilindrische b-vatstructuur en het eiwit aan het buitenmembraan (OM) verankert12. Het mechanisme waarmee het passagiersdomein over het OM wordt getransporteerd, is een langstaande mysterie. Net als alle bacteriële celoppervlakte-eiwitten, moet EspP worden getransporteerd over het binnenmembraan, over het periplasma (de ruimte tussen het binnen- en buitenmembraan) worden getransporteerd en gericht op het OM in een reeks geordende gebeurtenissen. Na zijn translocatie over het OM wordt het EspP passagiersdomein ook gescheiden van het b-domein door een proteolytische splitsing en vrijgegeven van het celoppervlak. Door site-specifiek cross-linking te combineren met pulse-chase radiolabeling, hebben we aangetoond dat beide domeinen van het eiwit aanvankelijk interageren met de moleculaire chaperon Skp in het periplasma6. Vervolgens interageren discrete segmenten van het b-domein op een stereospecifieke manier met componenten van een hetero-oligomeer genaamd het Bam-complex, dat de integratie van b-vat-eiwitten in het bacteriële OM door een onbekend mechanisme katalyseert. Misschien het meest interessant is dat we hebben gevonden dat het passagiersdomein in contact is met een van de Bam-complex subeenheden (BamA) terwijl het het OM passeert13</

<table><tbody><tr><td>QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>BPA (H-p-Bz-Phe-OH)</td><td>Bachem</td><td>F-2800</td><td></td></tr><tr><td>TRAN35S-LABEL, Metabolic Labeling Reagent (35S-L-methionine en 35S-L-cysteïne, >1.000 Ci/mmol)</td><td>MP Biomedicals</td><td>51006</td><td></td></tr><tr><td>Spectroline SB-100P Super-High-Intensity UV-lamp, 365 nm</td><td>Spectronics Corporation</td><td>SB-110P</td><td></td></tr><tr><td>Spectroline Vervangingslamp 100S</td><td>Spectronics Corporation</td><td>11-992-15</td><td></td></tr><tr><td>Falcon weefselkweekplaat, 6-well</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Beker met opzetstuk 125 ml Erlenmeyer</td><td>Corning</td><td>430421</td><td></td></tr><tr><td>Innova 3100 schudkweekincubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring van de assemblee van een afgescheiden virulentiewerd factor behulp van site-specifieke crosslinking

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

Dit artikel beschrijft een methode om dynamische interacties tussen een eiwit van belang en andere factoren in vivo te detecteren en te analyseren. Onze methode is gebaseerd op de amber-suppressietechnologie die oorspronkelijk werd ontwikkeld door Peter Schultz en collega's1. Een ambermutatie wordt eerst geïntroduceerd op een specifiek codon van het gen dat codeert voor het eiwit van belang. De amber mutant wordt vervolgens tot expressie gebracht in E. coli samen met genen die coderen voor een amber suppressor tRNA en een amino acyl-tRNA synthetase afgeleid van Methanococcus jannaschii. Met behulp van dit systeem wordt het foto-activeerbare aminozuur analoog p-benzoylfenylalanine (Bpa) opgenomen op het ambercodon. Cellen worden vervolgens bestraald met ultraviolet licht om de Bpa-rest te covalent verbinden met eiwitten die zich binnen 3-8 Å bevinden. Fotocrosslinking wordt uitgevoerd in combinatie met pulse-chase labeling en immunoprecipitatie van het eiwit van belang om veranderingen in eiwit-eiwitinteracties die zich voordoen over een tijdschaal van seconden tot minuten te monitoren. We hebben de procedure geoptimaliseerd om de assemblage van een bacteriële virulentiefactor te bestuderen die bestaat uit twee onafhankelijke domeinen, een domein dat is geïntegreerd in de buitenste membraan en een domein dat wordt getransloceerd naar de extracellulaire ruimte, maar de methode kan worden gebruikt om vele verschillende assemblageprocessen en biologische paden in zowel prokaryotische als eukaryotische cellen te bestuderen. In principe kunnen interacterende factoren en zelfs specifieke residuen van interacterende factoren die binden aan een eiwit van belang worden geïdentificeerd door massaspectrometrie.

We hebben site-specifieke fotocrosslinking gebruikt om eiwitten te identificeren die interageren met EspP tijdens het transport naar het OM. In de hier getoonde experimenten werden fenylalanine-codons op residuen 1113 en 1214 vervangen door amber-codons. Beide posities bevinden zich in het b-domein, dat integreert in het OM en dient als membraankerker. De kristalstructuur van het EspPβ-domein16 laat zien dat de twee residuen zich aan de periplasmatische zijde van het b-vat bevinden, maar gescheiden zijn door ~...

Dit artikel illustreert het gebruik van puls-chase radio-labeling in combinatie met plaatsspecifiek fotocrosslinking om interacties te monitoren tussen een eiwit van belang en andere factoren in E. coli. In tegenstelling tot traditionele chemische cross-linking methoden, genereert deze aanpak hoge resolutie “momentopnamen” van een geordende assemblageroute in een levende cel.

Monitoring van de Assemblee van een afgescheiden virulentiewerd Factor behulp van Site-specifieke Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de dynamiek van eiwit-eiwitinteracties binnen een levende cel te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst een eiwit van belang tot expressie te brengen in e coli, het aminozuuranaloog benzoylfenylalanine op een specifieke locatie in het eiwit in te bouwen en pulse-chase radiolabeling uit te voeren om een kleine populatie synchroon gesynthetiseerde eiwitmoleculen te markeren. Als tweede stap.Aliquots van cellen die op verschillende tijdstippen tijdens de chase zijn verzameld, worden bestraald om de vorming van covalente bindingen tussen het eiwit van belang en eventuele factoren waarmee het interacteert te triggeren. Vervolgens worden eiwitten geïmmunoprecipiteerd met specifieke antilichamen en gescheiden via SDS-polyacrylamidegelelektroforese om interagerende factoren te identificeren; de resultaten tonen veranderingen in de interacties tussen het eiwit van belang en andere intracellulaire factoren in de loop van de tijd, gebaseerd op veranderingen in de elektroforetische mobiliteit van de cross-linkingproducten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals co-immunoprecipitatie of chemische cross-linking, is het vermogen om temporele informatie te genereren over interacties die plaatsvinden tussen een specifiek residu in een eiwit van belang en andere moleculen.Dergelijke gegevens zijn bijzonder waardevol bij het bestuderen van de progressie van een eiwit via een meerstaps assemblagepad en voor het identificeren van assemblage-intermediairen. Hoewel deze methode is geoptimaliseerd voor gebruik in E. coli, kan deze ook worden toegepast in andere systemen, waaronder andere bacteriën, gist en zoogdiercellen. Details voor de bereiding van de cultuur zijn te vinden in het tekstprotocol.Bereid kort vijf milliliter M9-medium voor dat 0,2% glycerol bevat, alle aminozuren behalve methionine en cystine, en antibiotica. Start overnachtculturen door E. coli toe te voegen die getransformeerd is met een plasmide dat codeert voor het eiwit van belang met een amber-mutatie en het plasmide dat codeert voor het amber-suppressiesysteem. Incubeer bij 37 °C. Voeg op de dag van het experiment een passende hoeveelheid cellen uit de overnachtcultuur toe aan een Erlenmeyer-kolf van 250 milliliter met 50 milliliter M9-medium en antibiotica om een optische dichtheid van 0,03 bij 550 nanometer te verkrijgen. Incubeer de culturen bij 37 °C in een schuddend waterbad.Wanneer de culturen de vroege tot midden logfase bereiken, voegt u 50 µL van één molair benzoylfenylalanine of BPA toe aan elke cultuur. Voeg BPA druppelsgewijs toe terwijl u de kolf ronddraait om precipitatie te voorkomen. Voeg vervolgens alle benodigde induceerders toe om de expressie van de amber-mutant aan te sturen.Incubeer de culturen gedurende de inductieperiode van 30 minuten nog 30 minuten langer bij 37 °C. Label zes wegwerpcentsrifugebuisjes van 15 ml met het tijdstip en respectievelijk plus UV of minus UV. Plaats de gelabelde buisjes op ijs.Plaats een zes-wells weefselkweekplaat bovenop een tweede ijsbak gevuld met ijs. Zet de UV-lamp vijf minuten vóór de radiomerking aan. Voeg vervolgens ongeveer twee milliliters ijs toe aan elke buis met het label minus UV en aan twee van de wells in de multi-well plaat.Het is essentieel om de buisjes en wells direct op ijs te plaatsen om intracellulaire reacties bij elk tijdstip onmiddellijk te stoppen en zo een nauwkeurig beeld van de biochemische route aan het einde van de inductieperiode van 30 minuten te verkrijgen. Overbreng 25 milliliters van de cultuur naar een voorverwarmde disposable erlenmeyer van 125 milliliter. Plaats de erlenmeyer in het schudwaterbad van 37 degrees Celsius.De stappen voor pulse-chase labeling en UV-bestraling moeten tijdig worden uitgevoerd en vereisen een aanzienlijke organisatie en geavanceerde voorbereiding. Voeg op tijdstip één minuut nul seconden 30 micro curies per milliliter S 35 gelabelde methionine en cysteïne toe aan de cultuur en draai deze kort om te mengen.Voeg 250 µL van een niet-radioactieve 100 mM methionine-cysteïne-oplossing toe en draai het mengsel snel rond. Om direct te mengen, pipetteer vier ml van de cultuur in een van de wells van de gekoelde multi-well plaat die op ijs staat; pipetteer vervolgens een tweede aliquot van vier ml in de 15 ml buis met het label "nul minuten minus UV" op tijdstip twee minuten nul seconden.Pipetteer vier milliliter van de cultuur in een tweede putje van de gekoelde multi-well plaat die ijs bevat. Pipetteer vervolgens een tweede aliquot van vier milliliter in de 15 milliliter buis met het label één minuut minus UV vlak voor het tijdstip van vijf minuten, bij ongeveer twee milliliter ijs in een derde putje van de multi-well plaat op tijdstip zes minuten nul seconden. Pipetteer vier milliliter van de cultuur in het derde putje van de gekoelde multi-well plaat die ijs bevat.Voeg een andere aliquot van 4 mL toe aan de 15 mL buis met het label vijf minuten minus uv. Plaats de ijsbak met de multi-well plaat onder de voorverwarmde UV-lamp en bestraal elk monster afzonderlijk gedurende vier minuten. Draag de cellen over naar de gekoelde 15 mL buizen met de labels nul minuten plus uv, één minuut plus UV enzovoort.Centrifugeer de cellen vervolgens bij 2.500 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Resuspendeer elk monster in 300 µL M9-medium of PBS en 33 µL 100% koude trichloorazijnzuur (TCA) om de eiwitten te precipiteren. Centrifugeer de TCA-precipitaten in een microcentrifuge op maximale snelheid gedurende 10 minuten. Voeg vóór het verwijderen van het supernatant 50 µL solubilisatiebuffer toe aan elk monster en verhit dit onder agitatie bij 95 °C gedurende vijf minuten om het geprecipiteerde eiwit te solubiliseren.Voeg één milliliter radio-immunoprecipitatie-assaybuffer toe en voer standaard immunoprecipitaties uit met een vijfde tot de helft van elk monster. Scheid de geïmmunoprecipiteerde eiwitten via natriumlaurylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese of SDS-PAGE. Stel de gekleurde en gedroogde gels tenslotte gedurende de nacht bloot aan een phosphoscreen en detecteer radioactieve eiwitten, inclusief crosslinking-producten, met een phospho-imager. Site-specifieke fotocrosslinking werd gebruikt om eiwitten te identificeren die interageren met ESPP tijdens het transport naar het buitenmembraan.Voor dit experiment werden de alanine-codons op residuen 1113 en 1214 van het ESPP bèta-domein vervangen door Amber-codons. De kristalstructuur van het ESPP bèta-domein laat zien dat beide residuen zich aan de periplasmatische zijde van het bèta-vat bevinden, gescheiden door ongeveer 120 graden. Twee verschillende polypeptiden werden geïmmunoprecipiteerd uit zowel bestraalde als controlecellen met behulp van C-terminaal anti-ESPP en serum.Aanvankelijk overheerste op latere tijdstippen een precursorvorm van het eiwit van ongeveer 135 kilodalton, bestaande uit covalent gekoppelde passenger- en bèta-domeinen. Het niveau van PRO ESPP nam af en het vrije bèta-domein begon te overheersen naarmate het passenger-domein door het buitenmembraan werd getransloceerd en door een proteolytische splitsing werd gescheiden van het bèta-domein. De met UV I bestraalde monsters vertoonden echter duidelijk banden met een hoger molecuulgewicht die niet aanwezig waren in de controlemonsters.Deze banden zijn het resultaat van de cross-linking van PRO ESPP aan interagerende eiwitten. Op basis van de mobiliteit van deze polypeptiden werd de grootte van de interagerende eiwitten geschat om te testen of deze overeenkwamen met bekende assemblagefactoren van outer-membraaneiwitten. Er werden aanvullende immunoprecipitaties uitgevoerd met anti-cera die waren gegenereerd tegen de vermeende interagerende partners. Een polypeptide van ongeveer 150 kilodalton, dat werd waargenomen wanneer BPA was ingebouwd op zowel residu 1113 als 1214, kon worden geïmmunoprecipiteerd met een antiserum tegen de 17 kilodalton periplasmatische chaperone skip.Bovendien stelden we vast dat grotere polypeptiden, die werden waargenomen wanneer BPA op slechts één van de twee posities was ingebouwd, immunoprecipiteerd konden worden met anti-cera tegen de subeenheden van het BAM-complex, respectievelijk BAM B en BAM D. Na het uitvoeren van deze procedure kunnen de cross-linkingproducten worden gezuiverd en kunnen andere methoden, waaronder massaspectrometrie, worden toegepast om te helpen bij het identificeren van factoren die interageren met een eiwit van belang. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u pulse-chase-labeling succesvol kunt combineren met site-specifieke fotocross-linking om de interactiedynamiek van uw eiwit van belang met andere moleculen in de levende cel te bestuderen.

monitoring-assembly-secreted-bacterial-virulence-factor-using-site

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Een biochemische benadering wordt beschreven in vivo eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten identificeren. De methode combineert eiwit verknoping, affiniteitszuivering en massaspectrometrie, en is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel of organisme. Met deze benadering ook de identificatie van voorbijgaande PPI mogelijk.

Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer In Vivo

De hier beschreven methode wordt gebruikt om de apoptotische signaleringskaskade te induceren in gedefinieerde stappen om de activiteit van een anti-apoptotisch bacterieel effector-eiwit te onderzoeken. Deze methode kan ook worden gebruikt voor inductieve expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten, of voor het onderzoeken van interferentie met andere signaalwegen.

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

Effectortranslocatie naar gastcellen via een type III secretiesysteem is een veelvoorkomende virulentiestrategie bij gramnegatieve bacteriën. Een op beta-lactamase gebaseerde effectorfusie-assay voor kwantitatieve analyse van translocatie werd toegepast. In Yersinia geïnfecteerde cellen wordt de conversie van een FRET-reporter door de beta-lactamase gemonitord met behulp van laserscanemicroscopie.

Analyse van<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translocatie in gastheercellen met behulp van beta-lactamase Effector Fusions

Onderzoek naar de interactie tussen bacteriële pathogenen en hun gastheren is een belangrijk gebied van biologisch onderzoek. Hier beschrijven we de noodzakelijke technieken om effector translocatie door Coxiella burnetii tijdens siRNA gene silencing behulp blam substraat te meten.

Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Tijdens siRNA Silencing

De architectuur van eiwitcomplexen is essentieel voor hun functie. Diverse massaspectrometrische technieken combineren bewezen krachtige te bestuderen van hun vergadering. Wij bieden protocollen voor chemische dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie en laten zien hoe deze complementaire technieken helpen ophelderen van de architectuur van multi subeenheid eiwit assemblages.

Chemische dwarsbinding en massaspectrometrie van Intact eiwitcomplexen te bestuderen de architectuur van multi subeenheid eiwit assembly's combineren

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Cognate J-Domain eiwitten werken samen met de Hsp70 chaperonne om te helpen bij een groot aantal biologische processen, variërend van eiwit vouwen tot afbraak. Hier beschrijven we een in-situ proximity ligatie test, die het mogelijk maakt om deze transitieve gevormde chaperonne machinerie in bacteriële, gist en menselijke cellen te monitoren.

In situ monitoring van transitieve gevormde moleculaire Chaperone-assemblages in bacteriën, gist en menselijke cellen

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Dit artikel biedt een eenvoudig en duidelijk protocol om Salmonella-uitgescheiden effectoren te labelen met behulp van genetische code-uitbreiding (GCE) site-specifiek en de subcellulaire lokalisatie van uitgescheiden eiwitten in HeLa-cellen in beeld te brengen met behulp van directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM)...

Superresolutiebeeldvorming van bacteriële uitgescheiden eiwitten met behulp van genetische code-uitbreiding

Leer hoe je eiwit-eiwitinteracties in levende cellen bestudeert met behulp van site-specifieke fotokruisverbinding en pulse-chase-labeling in E. coli. Deze methode identificeert assemblage-intermediairen.

Monitoring van de Assemblee van een afgescheiden virulentiewerd Factor behulp van Site-specifieke Crosslinking

Meer video's verkennen