Monitoring van de Assemblee van een afgescheiden virulentiewerd Factor behulp van Site-specifieke Crosslinking

Het algemene doel van het volgende experiment is om de dynamica van eiwit-eiwitinteracties binnen een levende cel te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst een eiwit van belang in e coli tot expressie te brengen, de aminozuur-analogon benzoylfenylalanine op een specifieke locatie in het eiwit in te bouwen en puls-chase radio-labeling uit te voeren om een kleine populatie gelijktijdig gesynthetiseerde eiwitmoleculen te markeren. Als tweede stap.

Deeltjes van cellen die op verschillende tijdstippen tijdens de chase zijn verzameld, worden bestraald om de vorming van covalente bindingen tussen het eiwit van belang en eventuele factoren waarmee het interactie heeft, te activeren. Vervolgens worden de eiwitten geïmmunoprecipiteerd met specifieke antilichamen en gescheiden door SDS-polyacrylamidegelelektroforese om interacterende factoren te identificeren. De resultaten tonen veranderingen in de interacties tussen het eiwit van belang en andere intracellulaire factoren in de loop van de tijd, gebaseerd op veranderingen in de elektroforetische mobiliteit van cross-linking-producten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals co-immunoprecipitatie of chemische cross-linking, is het vermogen om temporele informatie te genereren over interacties die plaatsvinden tussen een specifiek residu in een eiwit van belang en andere moleculen.

Dergelijke gegevens zijn vooral waardevol bij het bestuderen van een progressie van een eiwit door een meertraps-assemblageroute en om assemblage-intermediaten te identificeren. Hoewel deze methode is geoptimaliseerd voor gebruik in e coli, kan deze ook worden gebruikt in andere systemen, inclusief andere bacteriën, gisten en zoogdiercellen. Details voor cultuurvoorbereiding zijn te vinden in het tekstprotocol.

Bereid kortweg vijf milliliter M-negen medium met 0,2% glycerol, alle el-aminozuren behalve methionine en cystine en antibiotica. Begin overnachtcultures door e coli toe te voegen dat is getransformeerd met een plasmide dat codeert voor het eiwit van belang met een ambermutatie en het plasmide dat codeert voor het ambersuppressiesysteem. Incubeer bij 37 graden Celsius. Op de dag van het experiment, voeg een geschikte hoeveelheid cellen van de overnachtcultuur toe aan een 250 milliliter erlenmeyerkolf met 50 milliliter M-negen medium en antibiotica om een optische dichtheid bij 550 nanometer van 0,03 te verkrijgen. Incubeer de culturen bij 37 graden Celsius in een schudwaterbad.

Wanneer de culturen de vroege tot middelste logfase bereiken, voeg 50 microliter van een molaar benzoylfenylalanine of BPA toe aan elke cultuur. Voeg BPA een druppel per keer toe terwijl je de kolf rondzwaait om precipitatie te voorkomen. Voeg vervolgens alle inductoren toe die nodig zijn om de expressie van de ambermutant aan te drijven.

Ga door met het incuberen van de culturen bij 37 graden Celsius gedurende nog eens 30 minuten tijdens de 30 minuten durende inductieperiode. Label zes wegwerpbare 15 milliliter centrifugeerbuisjes met het tijdstip en ofwel plus UV of minuus uv. Plaats de gelabelde buisjes op ijs.

Plaats een zes-wells weefselcultuurplaat bovenop een tweede ijsemmer gevuld met ijs. Zet de UV-lamp vijf minuten voorafgaand aan radio-labeling aan. Voeg vervolgens ongeveer twee milliliter ijs toe aan elke buis gelabeld met minuus UV en aan twee van de putjes in de multi-wellplaat.

Het is essentieel om direct ijs in de buisjes en putjes te blazen om de intracellulaire reacties onmiddellijk bij elk tijdstip te stoppen en zo een nauwkeurige momentopname van de biochemische route te verkrijgen. Aan het einde van de 30 minuten durende inductieperiode. Breng 25 milliliter van de cultuur over naar een voorverwarmde wegwerpbare 125 milliliter erlenmeyerkolf. Plaats de kolf in het schudwaterbad van 37 graden Celsius.

De stappen in puls-chase labeling en UV-bestraling moeten tijdig worden uitgevoerd en vereisen aanzienlijke organisatie en voorafgaande voorbereiding. Voeg 30 microcurie per milliliter van S 35 gelabeld methionine en cysteïne toe aan de cultuur en schuif snel om te mengen op tijdstip nul minuten nul seconden.

Voeg 250 microliter van een niet-radioactieve 100 millimolar methionine cysteïne oplossing toe en schuif snel om te mengen. Pipet onmiddellijk vier milliliter van de cultuur in een van de putjes van de gekoelde multi-wellplaat die ijs bevat, pipet een tweede vier milliliter aliquot in de 15 milliliter buis gelabeld nul minuten minuus UV op tijdstip twee minuten nul seconden.

Pipet vier milliliter van de cultuur in een tweede putje van de gekoelde multi-wellplaat die ijs bevat. Pipet vervolgens nog eens vier milliliter aliquot in de 15 milliliter buis gelabeld een minuus minuus UV onmiddellijk vóór het tijdstip van vijf minuten op ongeveer twee milliliter ijs in een derde putje in de multi-wellplaat op tijdstip zes minuten nul seconden. Pipet vier milliliter van de cultuur in de derde put van de gekoelde multi-wellplaat die ijs bevat, pipet.

Had nog eens vier milliliter aliquot in de 15 milliliter buis gelabeld vijf minuten minuus uv. Plaats de ijsemmer met de multi-wellplaat onder de voorverwarmde UV-lamp en bestraal elk monster individueel gedurende vier minuten. Breng de cellen over in de gekoelde 15 milliliter buisjes gelabeld nul minuten plus uv, een minuut plus UV enzovoort.

Centrifugeer vervolgens de cellen bij 2.500 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer elk monster in 300 microliter M-negen medium of PBS en 33 microliter van 100% koude trichloroazijnzuur of TCA om de eiwitten te precipiteren. Centrifugeer de TCA-precipitaten in een microfuge op topsnelheid gedurende 10 minuten. Voeg voordat je het sediment verwijdert, 50 microliter solubilisatiebuffer toe aan elk monster en verwarm met agitatie bij 95 graden Celsius gedurende vijf minuten om het geprecipiteerde eiwit te solubiliseren.

Na het toevoegen van één milliliter radio-immunoprecipitatiebuffer, voer standaard immunoprecipitaties uit met één vijfde tot de helft van elk monster. Scheid de geïmmunoprecipiteerde eiwitten door middel van natrium-ESAL-sulfaat, polyacrylamidegelelektroforese of SDS-PAGE. Stel ten slotte de gekleurde en gedroog