Name: Een cGMP-toepassing Uitbreiding Methode voor Aggregaten van menselijke neurale stamcellen en stamcellen afgeleid uit pluripotente stamcellen of foetaal hersenweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Leer een mechanische hakmethode voor het expanderen van menselijke neurale stamcelaggregaten zonder dissociatie tot enkele cellen. Deze techniek behoudt cel-celcontact en ondersteunt stabiele groei gedurende meer dan 40 passages.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken dr. Soshana Svendsen voor kritisch en bewerken van dit rapport. Dit werk werd bijgedragen door de NIH / NINDS 1U24NS078370-01 en CIRM DR2a-05320.

De auteurs hebben niets te onthullen.

<img alt="Figuur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig6highres.jpg" width="500" /> Figuur 6. Hakken Schematische. Uitbreidende spheroïde stam / voorlopercellen cellen in kweek met behulp van de mechanische hakken methode. Kritische stappen Een overzicht van de hakken expansie paradigma wordt getoond in figuur 6. HNPC bol grootte is een van de belangrijke criteri...

A correction was made to <a href="/video/51219">A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue</a>. The corresponding author was changed from:
Brandon C. Shelley 
to:
Clive Svendsen

A correction was made to <a href="/video/51219">A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue</a>. The corresponding author was changed.

Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Er is een lange geschiedenis van het uitbreiden van knaagdieren neurale stamcellen in een kweek als ofwel een monolaag 1-3 of geaggregeerde neurosferen 4-7. Bovendien zijn humane neurale stamcellen (hNPCs) geïsoleerd uit verschillende regio&#39;s van de ontwikkeling van centrale zenuwstelsel 8-17 uitgebreid in vitro. Deze cellen zijn bi-potente, kunnen differentiëren in zowel astrocyten en neuronen en een zeer nuttig hulpmiddel bestuderen neurale ontwikkeling en ziektemechanisme 18,19 20,21 hebben. hNPCs zijn ook getransplanteerd in vele verschillende diermodellen van het centrale zenuwstelsel ziekte met verschillende niveaus van integratie, overleving en functionele effecten 22-24. Traditioneel, knaagdier of foetale-afgeleide NPC blootgesteld aan groeifactoren - vaak epidermale groeifactor (EGF) en / of fibroblastgroeifactor-2 (FGF-2) 25-28 - en beide hechtende 29 en drie-Dimensionale bolvormige systemen zijn meestal gepasseerd met behulp van enzymatische dissociatie in een single-cell suspensie 30-34. De standaard methode om cellen voor onderzoek of klinisch gebruik uit te breiden is als een aanhanger monolaag dankzij eenvoudige manipulatie. Wij hebben echter aangetoond dat de passage monolaag en neurosphere hNPCs met enzymatische of chemische oplossingen resulteerde begin senescentie 35. Bovendien kan enzymatische dissociatie resulteren in verhoogde niveaus van differentiatie en karyotypische afwijkingen gebaseerd op gegevens toonden embryonale stamcellen 36-38. Hoewel de standaard methode van passage hNPCs huidige good manufacturing practice (cGMP) grade producten die 1 klinische studies (Stem Cells Inc, Neuralstem Inc) in fase zijn gegaan heeft geproduceerd, de methode is alleen toegestaan ​​met een paar rondes van cel versterking, het beperken van de bancaire potentieel. Het spreekt vanzelf dat grote onderzoeksexperimenten en toekomstige klinische proeven profiteren van de mogelijkheid ompropageren cellen in bulk en vertraagde veroudering grootschalige groei en celbankwezen mogelijk. Om aan deze behoefte, ontwikkelden we een nieuwe en geautomatiseerde manier van mechanisch passage intact neurosferen door &quot;hakken&quot; ze in kleine clusters naar cel-naar-cel contact onderhouden. Deze werkwijze aanzienlijk verhoogden hun levensduur 39 en suspensiekweek maakt een efficiënter incubatorruimte opzichte monolaagkweken, gezien een alternatieve 3D bioreactor kweekmethode 40. De hakken protocol voorziet in de productie van grote banken ve foetale monster groter dan doorgang 10, een onwaarschijnlijke prestatie met behulp van standaard werkwijzen passage. Hoewel deze methode voor passage hNPCs is onconventioneel, het groeit in populariteit en werd onlangs gepubliceerd met andere celtypen, zoals neurale stamcellen uit menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen, waardoor grootschalige expansie voor diverse toepassingen, waaronder in vitro ziektemodel 41-46. Belangrijk is een cGMP-gehalte hNPC cellenbank reeds geproduceerd met hakken methode, waaruit blijkt dat de techniek kan worden toegepast op toekomstige klinische toepassingen.

<table><tbody><tr><td>Beaker, 50 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-100-50</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Bio-Veiligheidscabinet, klasse II</td><td>Baker</td><td>SG-603A</td><td>4 ft. of 6 ft. model.&nbsp; 6 ft. model aanbevolen; meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Blades, Dubbelzijdige voorbereiding</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers.&nbsp; LET OP: Scherp</td></tr><tr><td>Celvriesmedium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6295-50ML</td><td>DMSO, serumvrij</td></tr><tr><td>Centrifuge, draaischijf met 15 ml inzetstukken</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Conische buisjes, 15 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>S50712</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Conische buisjes, 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352074</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Gecontroleerde vriessnelheid</td><td>Planer</td><td>Kryo 750</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Cryovials, 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Kweekkolf, geventileerd, T12.5</td><td>BD Falcon</td><td>353107</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Kweekkolf, geventileerd, T25</td><td>BD Falcon</td><td>353081</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Kweekkolf, geventileerd, T175</td><td>BD Falcon</td><td>353045</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Kweekkolf, geventileerd, T75&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353110</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Filter, 0,22 &micro;m, bevestigde cup, 1 L</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Filter, 0,22 &micro;m, bevestigde cup, 150 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGVU01RE</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Filter, 0,22 &micro;m, bevestigde cup, 500 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Filter, 0,22 &micro;m, bevestigde cup, 50 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Filterpapier, 8,5 cm cirkels</td><td>Whatman/GE</td><td>1001-085</td><td></td></tr><tr><td>Pincet, standaard patroon - gekarteld/gebogen/18 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11001-18</td><td></td></tr><tr><td>Vrieskamer, isopropylalcohol</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>"Mr. Frosty"</td></tr><tr><td>Incubator, 37 &deg;C/5% CO2</td><td>Forma</td><td>370 series</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Hemacytometer, fase</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>McIlwain weefselsnijder</td><td>Lafayette Instruments</td><td>TC752-PD</td><td>&nbsp;Petrischaal modificatie vereist.&nbsp;&nbsp; LET OP:&nbsp; Bewegende, scherpe mes.</td></tr><tr><td>Micropipettor, 1-10 &mu;l</td><td>Gilson</td><td>F144562</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Micropipettor, 100-1.000 &mu;l (starterkit)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Micropipettor, 2-20 &mu;l (starterkit)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Micropipettor, 20-200 &mu;l (starterkit)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Moersleutel, autoklaveerbaar, 5/16"</td><td>Steritool</td><td>10302</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipetten, katoenverstopt</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-8B</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Petrischaal, glas, autoklaveerbaar</td><td>Corning</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipet hulp</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Klemschijf</td><td>McMaster-Carr</td><td>VARIABLE</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Steriele barrière pipet tips, 10 &mu;l</td><td>AvantGuard</td><td>AV10R-H</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Steriele barrière pipet tips, 1.000 &mu;l</td><td>AvantGuard</td><td>AV1000</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Steriele barrière pipet tips, 20 &mu;l</td><td>AvantGuard</td><td>AV20-H</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Steriele barrière pipet tips, 200 &mu;l</td><td>AvantGuard</td><td>AV200-H</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Steriele wegwerp pipetten, volledig kunststof omwikkeling, 10 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10J</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Steriele wegwerp pipetten, volledig kunststof omwikkeling, 2 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675-3C</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Steriele wegwerp pipetten, volledig kunststof omwikkeling, 25 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10K</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Steriele wegwerp pipetten, volledig kunststof omwikkeling, 5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10H</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Sterilisatie Zakken, 19 x 33 cm</td><td>Crosstex</td><td>SCL</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Zeef, 40 &micro;m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Weefsel kweek schalen, 60 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Buisjesrek, in elkaar grijpend vierweg</td><td>Fisherbrand</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Fisherbrand</td><td>S52602Q</td><td>meerdere fabrikanten/leveranciers</td></tr><tr><td>Specifieke verwerkingsreagentia voor neurale voorlopercellen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neural Stamcel Uitbreidingsmedium (Stemline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3194-500ML</td><td>Belangrijk om het Stemline

een cgmp-toepassing uitbreiding methode voor aggregaten van menselijke neurale stamcellen en stamcellen afgeleid uit pluripotente stamcellen of foetaal hersenweefsel

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Een cel expansie techniek om grote aantallen cellen vergaren van een enkel exemplaar voor onderzoek experimenten en klinische studies zouden veel baat hebben de stamcel gemeenschap. Veel van de huidige methoden expansie zijn bewerkelijk en kostbaar, en die waarbij volledige dissociatie kan leiden tot verschillende stam-en voorlopercellen celtypen tot differentiatie of vroegtijdige veroudering ondergaan. Om deze problemen te overwinnen, hebben we een geautomatiseerde mechanische passage aangeduid als &quot;hakken&quot; dat eenvoudige en goedkope methode ontwikkeld. Deze techniek vermijdt chemische of enzymatische dissociatie in enkele cellen en in plaats daarvan maakt de grootschalige uitbreiding van opgeschort, bolvormige culturen die constant cel / cel contact te onderhouden. De snij methode voornamelijk gebruikt voor foetale hersenen afgeleide neurale progenitorcellen of neurosferen en onlangs verschenen voor gebruik met neurale stamcellen uit embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen. De procedure INVOLVes zaaien neurospheres op een weefselkweek petrischaaltje en vervolgens slaagt voor een scherpe, steriel mes door de cellen effectief automatiseren van het moeizame proces van het handmatig mechanisch dissociëren elke bol. Schorsing van cellen in cultuur zorgt voor een gunstig oppervlakte-volume verhouding; en meer dan 500.000 cellen kunnen worden gegroeid in een enkele neurosfeer van minder dan 0,5 mm in diameter. In een T175 kolf, kunnen meer dan 50 miljoen cellen groeien in suspensie kweken vergeleken met slechts 15 miljoen adherente culturen. Belangrijk is dat de hakken procedure werd gebruikt onder de huidige good manufacturing practice (cGMP), waardoor massaproductie hoeveelheid van klinische kwaliteit cel producten.

<img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig5highres.jpg" width="500" /> Figuur 5. Representatieve gegevens. A) Verwachte cel aantallen hNPCs op p19 bevroren, vervolgens ontdooid en uitgebreid als een aanhanger monolaag met behulp van enzymatische dissociatie vergelijking met neurosferen gepasseerd via de hakken methode. Dag 0 vertegenwoordigt wanneer de cellen werden ontdooid bij p20. B) Vertegenwoordiger be...

Dit protocol beschrijft een nieuwe mechanische snij methode die de sferische expansie van neurale stamcellen en voorlopercellen aggregaten zonder dissociatie een enkele celsuspensie maakt. Handhaving van cel / cel contact maakt een snelle en stabiele groei voor meer dan 40 passages.

Een cGMP-toepassing Uitbreiding Methode voor Aggregaten van menselijke neurale stamcellen en stamcellen afgeleid uit pluripotente stamcellen of foetaal hersenweefsel

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de neurosferen efficiënt te passeren, zodat het cel-celcontact gedurende de gehele levensduur van de gekweekte cellen behouden blijft. Deze techniek creëert de expansiecondities die vereist zijn voor humane neurale progenitorcellen. Dit wordt bereikt door maximaal twee T 175-flasks van dezelfde cellen te combineren en over te brengen naar een conische buis; in een tweede stap worden de sferen overgebracht naar een Petrischaal, waardoor de gesuspendeerde neurosferen worden gecondenseerd tot een hanteerbare massa op de Petrischaal, wat het mogelijk maakt om de H NPCs met een mesje in kleine clusters te snijden.Vervolgens worden de gepasseerde of gehakt neurosferen opnieuw gesuspendeerd om de cellen uit de Petrischaal te verwijderen en over te brengen naar de nieuwe flessen. De resultaten tonen aan dat de haktechniek een groeistrategie voor de lange termijn biedt, waarbij de expansiecurven een langdurige logaritmische groeisnelheid laten zien in vergelijking met cellen die via de standaard enzymatische methode zijn gepasseerd. Een visuele demonstratie van deze techniek is essentieel voor een sfeer.Condensatiestappen zijn lastig schri

a-cgmp-applicable-expansion-method-for-aggregates-human-neural-stem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De mogelijkheid om menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) te manipuleren in vitro het mogelijk maakt om hun bruikbaarheid te onderzoeken als cel transplantatie voor therapeutische doeleinden en voor de menselijke ontwikkeling van het zenuwstelsel te verkennen. Dit protocol bevat een methode voor het kweken en de passage hNSPCs in de hoop van de toenemende reproduceerbaarheid van het menselijk stamcelonderzoek.

Passage menselijke neurale stamcellen

Een eenvoudige en betrouwbare methode op isolatie en de cultuur van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale corticale weefsel wordt beschreven. Culturen zijn afgeleid van bekende menselijke neurologische aandoeningen kunnen worden gebruikt voor de karakterisering van pathologische cellulaire en moleculaire processen, maar ook als een platform om de farmacologische werkzaamheid beoordelen.

Generatie van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale Cortical weefsel

Protocollen voor neuronale differentiatie van pluripotente menselijke stamcellen (hPSCs) vaak tijdrovend en vereisen grote celkweek vaardigheden. Hier hebben we een kleine molecule aangepast gebaseerde differentiatie procedure een multititre plaat formaat, zodat eenvoudige, snelle en efficiënte productie van humane neuronen in een gecontroleerde manier.

Snelle en efficiënte generatie van de neuronen van menselijke pluripotente stamcellen in een Multititre Plate Format

This video demonstrates the generation of neural progenitor cells from non-transgenic and transgenic human pluripotent stem cells (hPSCs). hPSCs are differentiated into neural progenitor cells using a neuronal differentiation medium. While differentiation is induced in non-transgenic cells using small molecules, the transgenic hPSCs are differentiated by adding an antibiotic that induces the promoter for a neuronal differentiation-specific transcription factor.

Differentiating Non-Transgenic and Transgenic Human Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells

Deze procedure levert telencephalic neuronen door door checkpoints die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in menselijke ontwikkeling. De cellen mogen spontaan differentiëren blootgesteld aan risicofactoren te duwen naar de neurale stam, geïsoleerd en uitgeplaat op dekglaasjes om voor terminale differentiatie en maturatie.

De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Cerebrale organoids vertegenwoordigen een nieuw modelsysteem voor vroege menselijke hersenen ontwikkeling in vitroonderzoeken. Dit artikel bevat de gedetailleerde methodologie voor het efficiënt genereren van homogene dorsale reukkolf-type organoids van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen met inbegrip van kritische karakterisatie en validatie stappen.

Generatie van gestandaardiseerde en reproduceerbaar reukkolf-type cerebrale Organoids van mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier presenteren we een methode voor een menselijke in vitro model van stretch letsel in een 96-Wells-formaat op een tijdschaal die relevant zijn voor de invloed van trauma's. Het gaat hierbij om methoden voor het fabriceren van rekbare platen, kwantificeren van de mechanische belediging, kweken en verwonden van cellen, imaging en hoog inhoudsanalyse te kwantificeren van de schade.

Methode voor hoge snelheid Stretch letsel van mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige neuronen in een 96-Wells-indeling

In dit protocol, wij streven ernaar om te beschrijven een reproduceerbare methode voor combineren losgekoppeld menselijke pluripotente stamcel afgeleid neuronen en astrocyten samen in 3D bol cocultures, behoud van deze gebieden vrij zwevende voorwaarden, en daarna het meten van synaptic circuit activiteit van de bollen met immunoanalysis en multielectrode serie opnamen.

Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft een dynamisch cultuursysteem om gecontroleerde grootteaggregaten van menselijke pluripotente stamcellen te produceren en differentiatie in cerebellar organoïden verder te stimuleren onder chemisch gedefinieerde en feedervrije omstandigheden met behulp van een bioreactor voor eenmalig gebruik.

Schaalbare generatie van volwassen cerebellar organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen en karakterisering door immunostaining

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in een benchtop 3D-suspensie bioreactor.

Productie van menselijke neurogenine 2-induceerbare neuronen in een driedimensionale suspensie bioreactor

Leer een mechanische hakmethode voor het expanderen van menselijke neurale stamcelaggregaten zonder dissociatie tot enkele cellen. Deze techniek behoudt cel-celcontact en ondersteunt stabiele groei gedurende meer dan 40 passages.

Een cGMP-toepassing Uitbreiding Methode voor Aggregaten van menselijke neurale stamcellen en stamcellen afgeleid uit pluripotente stamcellen of foetaal hersenweefsel (Video) | JoVE Journal

Een cGMP-toepassing Uitbreiding Methode voor Aggregaten van menselijke neurale stamcellen en stamcellen afgeleid uit pluripotente stamcellen of foetaal hersenweefsel

Meer video's verkennen