Een cGMP-toepassing Uitbreiding Methode voor Aggregaten van menselijke neurale stamcellen en stamcellen afgeleid uit pluripotente stamcellen of foetaal hersenweefsel
15 juni 2014
Dit protocol beschrijft een nieuwe mechanische snij methode die de sferische expansie van neurale stamcellen en voorlopercellen aggregaten zonder dissociatie een enkele celsuspensie maakt. Handhaving van cel / cel contact maakt een snelle en stabiele groei voor meer dan 40 passages.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de neurosferen efficiënt door te laten gaan, zodat het contact tussen cel en cel gedurende de levensduur van de gekweekte cellen wordt gehandhaafd. Deze techniek creëert uitbreidingsvoorwaarden die nodig zijn voor humane neurale progenitorcellen. Dit wordt bereikt door maximaal twee T 1 75 flacons van dezelfde cellen te combineren en over te brengen naar een conische buis, waardoor de sferen in een tweede stap worden overgebracht naar een petrischaal, gecondenseerd tot geschorste neurosferen in een beheersbare massa op de petrischaal, waardoor de mes de H NPCs in kleine clusters kan snijden.
Vervolgens worden de doorgelaten of gehakte neurosferen opnieuw gesuspendeerd om de cellen van de petrischaal te verwijderen en kwart in de nieuwe flacons te plaatsen. Er worden resultaten verkregen die aantonen dat de haaktechniek een langetermijngroeistrategie biedt op basis van de expansiecurven die langetermijnlogaritmische groeisnelheden tonen in vergelijking met cellen die via de standaard enzymatische aanpak worden doorgelaten. Visuele demonstratie van deze techniek is essentieel als een sfeer.
Condensatiestappen zijn moeilijk om schriftelijk te beschrijven. Er zijn ook verschillende trucs om het proces te helpen. Als overtollig medium niet volledig uit de petrischaal is verwijderd, zullen de sferen eenvoudigweg in het medium worden geduwd in plaats van te worden gesplitst in kleinere clusters.
Begin deze procedure door de kleur van het medium van de flacon met H NPCs aan te pakken. Scan de flacon onder een microscoop om de cellen te observeren. Gebruik indien mogelijk een radicaal om de grootte van verschillende sferen te onderzoeken.
Als veel sferen een diameter van 300 micrometer of meer hebben, gaat u verder met het hakproces en hakt u de cellen om de zeven tot 10 dagen. Plaats vervolgens de flacon terug in de incubator en zet de chopper op. Zet de aan/uit-schakelaar van de chopper aan.
Stel in de BSC de hakdikte in op 200 micrometer en de blaaskracht op 180 graden of de negen uur positie. Bevestig vervolgens dat de automatische snelheidsknop zo ver mogelijk linksom is gedraaid. Beweeg vervolgens de tafelontgrendelingsknop zo ver mogelijk naar rechts en bevestig dat de platenhouder stabiel is.
Draai de handmatige armmanipulator met de klok mee om de arm naar zijn maximale niveau te brengen. Transfer vervolgens asseptisch een steriele dubbelzijdige hakmes op de chopperarmbout. Plaats met een tang de klem over het mes met behulp van de tang.
Het gebogen gedeelte van de klem moet zich boven de bovenrand van de arm bevinden. Houd vervolgens de klem op de arm en bevestig de moer op de bout. Laat de moer met de steriele ratesleutel een kwartslag los.
Transfer in deze procedure de voorgestelde hoeveelheid onderhoudsmedium in de nieuwe flacon. Transfer vervolgens asseptisch de cellen van de incubator naar de BSC. Laat de flacon op een buisjesrek staan en laat de sferen in de flacon bezinken.
Een bezonken. Aspiraat tot 12 milliliter supernatant. Spoel met een 10 milliliter serologische pipet alle losjes aanhechtende sferen van het oppervlak van de flacon weg.
Herhaal indien nodig en laat de sferen tussen Rens bezinken. Breng vervolgens het voorgestelde volume geconditioneerd medium over in de nieuwe flacon. Breng vervolgens al het resterende geconditioneerde medium en de sferen over in een nieuwe 15 milliliter conische buis.
Laat de sferen bezinken en gooi de gebruikte flacon weg. Transfer vervolgens langzaam de cellen vanuit de 15 milliliter conische buis op de 60 millimeter petrischaal of shim-schijf in het laagste haalbare volume. Bewaar het resterende geconditioneerde medium omdat het wordt gebruikt om de cellen uit de schaal na het hakken te spoelen.
Probeer het door het medium en de sferen op het schaal bedekte oppervlak te minimaliseren. Begin vervolgens met het condenseren van de sfeerpool door de super natin terug over te brengen in de 15 milliliter conische buis. Verwijder zoveel mogelijk medium vanaf de bovenkant van de mediacelpool met een micropipeter met aërosol barrière tip.
Totdat het niet mogelijk is om medium te verwijderen zonder sferen, spreid de pool dan uit. Gebruik de zijkant van de pipettetip om het oppervlak te vergroten, kant de petrischaal lichtjes en gebruik de zijkant van de pipettetip om alle sferen voorzichtig naar één kant van de pool te schuiven. Nadat alle cellen zijn verplaatst, kant de petrischaal langzaam in de tegenovergestelde richting om het medium van de sferen te laten scheiden.
Breng vervolgens het gewiste medium terug in de 15 milliliter conische buis. Gebruik de zijkant van de pipettetip om alle sferen voorzichtig terug te schuiven naar het midden van de petrischaal. Zodat de pool een diameter heeft van 0,5 tot 2,4 centimeter.
Het is belangrijk om de diepte van de sfeerpool ondiep te houden. Als de pool te diep is, worden de sferen tijdens het hakken opzij geduwd. Transfer nu de petrischaal op de platenhouder en zet deze vast onder de haken van de platenhouder.
Gebruik de knop voor tafelontgrendeling om de platenhouder naar links te schuiven, zodat de blaas vrij is van de sferen en vast in de versnelling zit. Verlaag vervolgens de chopperarm door de handmatige manipulatorknop met de klok mee te draaien tot de blaas plat op de petrischaal neerkomt. Druk op de armbevestiging terwijl u de moer aandraait.
Druk vervolgens op de resetknop. Houd de petrischaal met één hand vast terwijl u de automatische armmanipulatorknop met de klok mee draait naar de 90 graden of 12 uur positie en begin met hakken wanneer alle sferen zijn gehakt. Draai de platenhouder 90 graden.
Laat vervolgens de bout los, laat de arm zakken en draai de moer weer vast. Herhaal de hakprocedure. Transfer vervolgens asseptisch de petrischaal van de platenhouder naar een werkruimte in de BSC.
Breng een milliliter geconditioneerd medium aan op de gehakte sferen. Resuspendeer vervolgens voorzichtig en breng de gehakte sferen over in een nieuwe 15 milliliter conische buis. Probeer het vormen van luchtbellen te vermijden en herha
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een nieuwe mechanische hakmethode waarmee sferische aggregaten van neurale stam- en progenitorcellen kunnen worden uitgebreid zonder dissociatie tot een enkelcel-suspensie. Het behoud van cel-celcontact maakt een snelle en stabiele groei gedurende meer dan 40 passages mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Stamcelonderzoek
Achtergrond
- Efficiënte passage van neurosferen is cruciaal voor het behoud van de celviabiliteit.
- Traditionele methoden verstoren vaak het cel-celcontact.
- Deze studie onderzoekt een mechanische haktechniek om de groei te bevorderen.
- Strategieën voor langetermijngroei zijn essentieel voor humane neurale progenitorcellen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode die het cel-celcontact tijdens het passageren behoudt.
- Het vergelijken van de groeisnelheden van gehaktte neurosferen ten opzichte van standaard enzymatische methoden.
- Het bieden van een visuele demonstratie van de haktechniek.
Gebruikte methoden
- Het combineren van maximaal twee T 1 75-flasks met dezelfde cellen.
- Het overbrengen van cellen naar een conische buis voor verdere verwerking.
- Het snijden van de aggregaten in kleine clusters met behulp van een scalpellamella.
- Het resuspenderen van de versneden neurosferen voor overdracht naar nieuwe flasks.
Belangrijkste Resultaten
- De haktechniek ondersteunt logaritmische groeisnelheden op de lange termijn.
- De resultaten wijzen op een verbeterde groei in vergelijking met traditionele methoden.
- Visuele demonstraties benadrukken de effectiviteit van de techniek.
- Gehakte neurosferen behielden gedurende een langere periode een betere celviabiliteit.
Conclusies
- De mechanische hakmethode is effectief voor het expanderen van neurale progenitorcellen.
- Het behouden van cel-celcontact is cruciaal voor een optimale groei.
- Deze techniek biedt een veelbelovend alternatief voor enzymatische passaging.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze mechanische hakmethode maakt schaalbare expansie van menselijke neurale stamcel- en progenitorcelaggregaten mogelijk terwijl cruciaal cel-celcontact behouden blijft, waarmee een belangrijke bottleneck in de productie van stamcellen voor zowel onderzoek als klinische toepassingen wordt weggenomen. Door enzymatische dissociatie te vermijden, vermindert de techniek de differentiatiedruk en het risico op senescentie, wat een consistente productie van klinisch relevante neurale celproducten onder cGMP-condities ondersteunt. Dit positioneert de methode als een waardevol instrument voor het verminderen van risico's bij vroege validatie van neurale targets en het mogelijk maken van reproduceerbare generatie van preklinische modellen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt fysiologische cel-celinteracties in neurale progenitorculturen, wat studies naar target-engagement met een hogere biologische relevantie ondersteunt.
- Operationele waarde: Maakt langdurige expansie over meer dan 40 passages mogelijk, wat zorgt voor een continue celvoorraad voor iteratieve campagnes voor target-validatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert homogene sferoïden-culturen die geschikt zijn voor gestandaardiseerde assay-formaten waarvoor een 3D-cellulaire architectuur vereist is.
- Operationele waarde: Genereert hoge opbrengsten (>50 miljoen cellen per T175-fles) vergeleken met adherente culturen, wat de screening-doorvoer en de efficiëntie van reagentia verbetert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekte-relevante modellering door cellen afgeleid van pluripotente stamcellen of foetaal weefsel uit te breiden zonder fenotypische drift.
- Operationele waarde: Compatibel met cGMP-productie, wat een naadloze overgang van ontdekking naar productie op klinische schaal faciliteert.
Pipeline- & workflowintegratie
De hakmethode past binnen het continuüm van ontdekking tot prekliniek door een betrouwbare expansie van neurale progenitorcellen mogelijk te maken voor doelwitvalidatie, assayontwikkeling en mechanistische risicoreductie voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing via langdurige kweek van fysiologisch relevante neurale aggregaten.
- Screening: Levert reproduceerbare resultaten met een hoog celgetal, essentieel voor assay-standaardisatie en compound-screeningcampagnes.
- Analytics: Maakt kwantificering van expansiekinetiek en viabiliteitsmetrieken mogelijk om go/no-go-beslissingen te onderbouwen.
- Translationeel Onderzoek: Handhaaft de cellulaire getrouwheid van discovery tot preklinische validatie, waardoor biologische variabiliteit wordt verminderd.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een schaalbaar, geautomatiseerd passageringsplatform dat toepasbaar is op meerdere neurale stamcelbronnen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door behoud van natuurlijke cel-celcontacten en vermindering van cultuur-geïnduceerde artefacten.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde, mechanische passaging minimaliseert gebruikersvariabiliteit en ondersteunt schaalbare, reproduceerbare processen.
- Strategische waarde: Vermindert biologische risico's in neurale targetprogramma's door een consistente celkwaliteit over verschillende passages te waarborgen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang mogelijk door een betrouwbare, cGMP-conforme celvoorziening voor preklinische en klinische studies.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist training in aseptische technieken en het bedienen van een mechanische hakker.
- Afhankelijk van de toegang tot steriele messen, conische buizen, Petrischalen en incubatoren.
- Vereist gestandaardiseerde condensatie- en resuspensiestappen om een consistente grootteverdeling van de sferoïden te waarborgen.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen kan optimalisatie van de hakdikte en de kracht van het mes vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van handmatige stappen voor het verwijderen van het medium tijdens de condensatie, wat de doorvoersnelheid kan beïnvloeden als dit niet wordt geoptimaliseerd.
