Name: High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Leer een high-throughput screeningmethode voor het isoleren van breed-spectrum antivirale verbindingen uit chemische bibliotheken. Deze techniek gebruikt recombinante mazelen- en chikungunya-virussen met luciferase als reporter voor nauwkeurige meting van virusreplicatie en toxiciteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken dr. Yves L. Janin voor zijn vruchtbare opmerkingen en suggesties. Wij willen HH Gad bedanken voor CHIK / Ren en C. Combredet voor haar technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Institut Pasteur, het Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), het Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM), het Institut Carnot - Pasteur Maladies infectieuses (Programme STING naar POV en HM- L), de Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, programma STING 2,0 tot POV), en de &quot;Conseil Regional d&#39;Ile-de-France&quot; (Chemische Library Project, subsidies n ° 06-222 I / O en I 09-1739 / R naar HM-L.). Het werk aan CHIKV / Ren werd ondersteund door het project ArbOAS (ANR subsidie ​​2010-INTB-1601-1602).

1. Bereiding van 96-well platen met dochter Verbindingen <ol><li> Beweeg 96-well platen met moeder 10 mM voorraadoplossingen van chemische verbindingen in DMSO van -20 ° C tot kamertemperatuur. Verdun 5x verbindingen in DMSO tot gemiddeld 96-well platen verdunning verkrijgen tegen 2 mM. Verdunning wordt bereikt door pipetteren 5 ul in 20 ul DMSO en mengen. </li><li> Pipet 1 pi van verdunningsplaten in droge putten van wit, met streepjescode weefselkweek 96-well platen. Deze eerste reeks dochterplaten (D1) wordt gebruikt om de toxiciteit van verbindingen bij een uiteindelijke concentratie van 20 uM evalueren. WINKEL dochterplaten bij -20 ° C tot gebruik. </li><li> Verdun verbindingen weer 01:10 pipetteren 4 ui van verdunningsplaten in 36 pl DMSO en mengen. Pipetteer 1 ui in droge putten van witte, vlakke bodem, voorzien van een barcode weefselkweek 96-wells platen. Deze tweede set dochterplaten (D2) wordt gebruikt om de remming van MV replicatio evaluerenn door verbindingen bij een eindconcentratie van 2 uM. WINKEL dochterplaten bij -20 ° C tot gebruik. </li></ol> 2. Bereiding van celkweken wat verbinding toxiciteit bepalen <ol><li> Kweek HEK-293T-cellen bij 37 ° C en 5% CO2 in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) met gestabiliseerde L-glutamine en aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), streptomycine (100 ug / ml) en penicilline (100 IU / ml). Cellen worden gepasseerd door behandeling met trypsine om de 4-5 dagen, en 1:10 verdund in een frisse fles. Cellen moeten in log-fase voor experimenten. </li><li> Op de dag van het experiment, herstellen cellen door behandeling met trypsine en uitvoeren cel tellen. Pellet cellen door centrifugeren en resuspendeer ze op 3 x 10 5 cellen / ml in kweekmedium. Bedenk dat 12,5 ml celsuspensie worden voor elke zeefplaat. </li><li> Overdracht cellen om een ​​trog, en afzien van 100 ul van celsuspensie in D1 platen met spiked chemische compounds. Celsuspensie in de trog regelmatig geroerd om sedimentatie te voorkomen. </li><li> Spike controleputjes A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 en G12 met 1 ul DMSO. Overeenkomstige putten worden gebruikt als referentie voor levende cellen (geen toxiciteit). Spike controleputjes B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 en H12 met 1 pl DMSO en 2,5 ul van een 0,5% IGEPAL oplossing doden. Overeenkomstige putten wordt gebruikt als referentie voor dode cellen (hoge toxiciteit). </li><li> Incubeer cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li></ol> 3. Voorbereiding van celkweken geïnfecteerd door rMV2/Luc <ol><li> Groeien en cellen te herstellen, zoals beschreven in 2.1 en 2.2. Nogmaals, resuspendeer cellen in 3 x 10 5 cellen / ml in kweekmedium. Bedenk dat 12,5 ml celsuspensie worden voor elke zeefplaat. </li><li> Optioneel: supplement kweekmedium met uridine bij 20 ug / ml. Opmerking: Bij de screening van chemische bibliotheken voor virale replication-remmers, lijkt het erop dat verbindingen targeting eerste stappen van de pyrimidinebiosynthese pathway vaak geïsoleerd 13,16,27,28. De toevoeging van uridine kweekmedium wordt gebruikt voor het filteren dergelijke antivirale moleculen. Inderdaad, dit efficiënt herstelt virale replicatie wanneer de stroomopwaartse enzymen van de pyrimidinebiosynthese pathway worden geblokkeerd. </li><li> Spaar 01:10 celsuspensie voor controle putjes met niet-geïnfecteerde cellen, en ga verder met infectie met resterende volume. </li><li> Ontdooi de juiste hoeveelheid rMV2/Luc voorraad oplossing. MV voorraad oplossingen zijn meestal op 10 6 -10 8 infectieuze deeltjes per ml. Kweek moet worden geïnfecteerd met 0,1 infectieuze deeltjes per rMV2/Luc doelwitcellen, wat overeenkomt met 0,1 multipliciteit van infectie (MOI). Opmerking: rMV2/Luc is afgeleid van MV vaccin (Schwarz-stam) en wordt gemanipuleerd in een BSL2 omgeving. </li><li> Voeg het virus aan celsuspensie en meng voorzichtig. Transfer geïnfecteerde cellen naar een dieptepunt, en afzien 100ui geïnfecteerde celsuspensie in de kolommen 2 tot 11 D2 platen die spiked chemische verbindingen. Celsuspensie in de trog regelmatig voorzichtig gemengd. </li><li> In de kolommen 1 en 12, afzien 100 ul van niet-geïnfecteerde cellen een goed twee. Geïnfecteerde cellen worden afgeleverd in de andere putjes. </li><li> Incubeer cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li></ol> 4. Luciferaseactiviteit Maatregelen en Data-analyse <ol><li> Verwijder D1 platen uit de incubator, en bepaal cellulaire levensvatbaarheid door het toevoegen van 50 pi-luciferase gebaseerde levensvatbaarheid reagens direct naar cultuur putten. Meng en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Lees platen met een luminometer. Integratie tijd is ingesteld op 100 msec per putje. </li><li> Verwijder D2 platen uit de incubator en bepalen luciferaseactiviteit door toevoeging van 50 ui luciferase substraat direct kweekputjes. Incubeer gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur en lees platen met een luminometer zoals describoven bed. </li><li> Bereken een Z&#39;-factor van elke plaat D1 van de toxiciteit test de kwaliteit van het scherm 29 rechtvaardigen. Z &#39;= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), waarbij μ en σ + + corresponderen met behulp van luminescentie en standaardafwijkingen HEK-293T cellen met alleen DMSO (geen toxiciteit), en μ-en σ-zijn middelen van luminescentie en standaarddeviaties voor cultuur putten behandeld met IGEPAL om cellen te doden. Z &#39;is naar verwachting meer dan 0,5, of de overeenkomstige plaat verwijderd. </li><li> Stel toxiciteit drempel μ + / 2. Gooi verbindingen met luminescentie waarde onder deze cut-off (figuur 3A). </li><li> Bereken een Z&#39;-factor voor elk D2 plaat van het antivirale assay. Hier, μ en σ + + corresponderen met behulp van luminescentie en standaardafwijkingen geïnfecteerde cellen gekweekt met alleen DMSO en μ en σ-zijn middelen luminescentie en standaarddeviaties voor niet-geïnfecteerde cellen. Ook platen met Z &amp; #39; waarden onder 0,5 worden verwijderd. </li><li> Bereken de remming van virale replicatie als volgt: procentuele remming = (μ + - luciferaseactiviteit voor verbinding X) / (μ + - μ-) * 100. Stel remming drempel van 75%, en selecteer verbindingen die zowel verminderen luminescentie waarde onder deze cut-off (Figuur 3B) en zijn niet giftig zijn volgens de criteria in 4.4 beschreven. </li></ol> 5. Tweede scherm voor de toxiciteit en Broad-spectrum antivirale activiteit <ol><li> Controleer 01:02 seriële verdunningen voor elke hit verbinding in DMSO, vanaf 500 uM tot 4 micrometer (8 verdunningen). Vul wit, voorzien van een barcode weefselkweek platen met 50 ul kweekmedium. Voeg 1 ul van elke verbinding verdunning in cultuur putten. Herhaal dit twee keer tot 3 cultuur platen met dubbele seriële verdunningen voor elke treffer verbinding hebben. </li><li> Bereid 37,5 ml van een HEK-293T celsuspensie bij 6 x 10 5 cellen / ml in kweekmedium zoals hierboven beschreven (2.1 en 2.2). Verdeel 2x 12,5 ml in falcon buizen en cellen infecteren met ofwel rMV2/Luc bij MOI = 0,1 of recombinante CHIKV uiten Renilla luciferase (CHIKV / Ren) bij MOI = 0,2. Meng door omkeren. Opmerking: CHIKV / Ren is afgeleid van een wild-type stam van CHIKV en moet daarom worden gemanipuleerd in een BSL3 omgeving. Platen kunnen worden verplaatst van BSL3 naar BSL1 zodra Renilla substraat is toegevoegd aan kweekputjes (zie hieronder). </li><li> Doseer 50 ul van niet-geïnfecteerde, rMV2/Luc-infected of CHIKV / Ren-geïnfecteerde cellen in kweek platen met seriële verdunningen van hit verbindingen. Incubeer 24 uur bij 37 ° C. </li><li> Voeg 50 ul van vuurvliegluciferase substraat vuurvliegluciferase activiteit in rMV2/Luc-infected putten bepalen. Voeg 50 ul van Renilla luciferasesubstraat om Renilla luciferase activiteit in CHIKV / Ren-geïnfecteerde putten bepalen. Tenslotte, voeg 50 ul luciferase-gebaseerde levensvatbaarheid-assay reagens geïnfecteerde cellen cellulaire levensvatbaarheid te bepalen. </li><li> Plot gegevens (Figuur 4) en bepalen hit verbindingsconcentraties dat MV en CHIKV replicatie remmen met 50%. Negeer verbinding waaruit blijkt wat de toxiciteit in deze test. </li></ol>

<ol><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+drugs+in+current+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Antiviral drugs in current clinical use.</a> J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).</li>
<li>Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervention+strategies+for+emerging+viruses%3A+use+of+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals.</a> Curr Opin Virol. , (2013).</li>
<li>Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+strategies+to+inhibit+the+replication+of+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses.</a> Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).</li>
<li>Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+predominant+mechanism+by+which+ribavirin+exerts+its+antiviral+activity+in+vitro+against+flaviviruses+and+paramyxoviruses+is+mediated+by+inhibition+of+IMP+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase.</a> J Virol. 79, 1943-1947 (2005).</li>
<li>Wang, B. X., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+and+yang+of+viruses+and+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The yin and yang of viruses and interferons.</a> Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).</li>
<li>Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+advances+in+the+treatment+and+prevention+of+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus.</a> Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).</li>
<li>Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+and+the+host+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systems biology and the host response to viral infection.</a> Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).</li>
<li>Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Approaches+towards+the+Development+of+Host-Directed+Antiviral+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics.</a> Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).</li>
<li>Connolly, D. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+Toll-like+receptor+targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2012).</li>
<li>Thakur, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+activators+of+RNase+L+with+broad-spectrum+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).</li>
<li>Shoji-Kawata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+candidate+therapeutic+autophagy-inducing+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide.</a> Nature. 494, 201-206 (2013).</li>
<li>Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+analyst%27s+couch%3A+TLR-targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).</li>
<li>Bonavia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+broad-spectrum+antiviral+compounds+and+assessment+of+the+druggability+of+their+target+for+efficacy+against+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).</li>
<li>Rider, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral therapeutics.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Krumm, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+host-directed+small-molecule+inhibitors+of+myxovirus+RNA-dependent+RNA-polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases.</a> PLoS One. , (2011).</li>
<li>Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).</li>
<li>Harvey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK983%3A+a+novel+compound+with+broad-spectrum+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity.</a> Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).</li>
<li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+were+new+medicines+discovered%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).</li>
<li>Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+high-throughput+screening+to+quantify+antiviral+activity+against+viruses+that+induce+limited+CPE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE.</a> J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).</li>
<li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon%2C+virus-like+particles%2C+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).</li>
<li>Panchal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+high-content+imaging+assays+for+lethal+viral+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens.</a> J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).</li>
<li>Pohjala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+alphavirus+entry+and+replication+identified+with+a+stable+Chikungunya+replicon+cell+line+and+virus-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).</li>
<li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem Biol. 17, 646-657 (2010).</li>
<li>Komarova, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+virus-host+interactions+in+an+infectious+context+using+recombinant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses.</a> Mol Cell Proteomics. , (2011).</li>
<li>Henrik Gad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E2-E166K+substitution+restores+Chikungunya+virus+growth+in+OAS3+expressing+cells+by+acting+on+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry.</a> Virology. 434, 27-37 (2012).</li>
<li>Wang, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+dengue+virus+through+suppression+of+host+pyrimidine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis.</a> J Virol. 85, 6548-6556 (2011).</li>
<li>Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D282%2C+a+non-nucleoside+inhibitor+of+influenza+virus+infection+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Chem+Chemother%22%5BJournal%5D)">D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Qing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dengue+virus+resistance+to+brequinar+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).</li>
<li>Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+dihydroorotate+dehydrogenases+and+their+inhibitors+and+uses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses.</a> J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).</li>
<li>Yoon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening-based+identification+of+paramyxovirus+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors.</a> J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).</li>
<li>Maréchal, E., Roy, S., Lafanechère, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMar%C3%A9chal%2C+E+%22Chemogenomics+and+Chemical+Genetics%3A+A+User%27s+Introduction+for+Biologists%2C+Chemists+and+Informaticians%22">Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Gentzsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+complete+life+cycle+screen+for+identification+of+small+molecules+with+pro-+or+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity.</a> Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).</li>
<li>Caignard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V+protein+of+Tioman+virus+is+incapable+of+blocking+type+I+interferon+signaling+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De screening pijplijn hier beschreven beoogd selecteren verbindingen met een geschikt profiel als breed-spectrum remmers van RNA-virussen. Wanneer een bibliotheek van 10.000 verbindingen werd gescreend met dit protocol en voornoemde filtering criteria zijn toegepast, dwz remming van MV replicatie superieur is aan 75%, 40 verbindingen (0,4%) scoorden positief. Trouwens, ongeveer de helft van hen toonde enkele toxiciteit in de luciferase-gebaseerde levensvatbaarheid assay, en werden buiten beschouwing gelaten om ...

RNA-virussen zijn verantwoordelijk voor een grote verscheidenheid van menselijke infecties, en hebben een enorme impact op de bevolking wereldwijd, zowel in termen van volksgezondheid en economische kosten. Efficiënte vaccins ontwikkeld tegen verschillende menselijke RNA-virussen en worden veel gebruikt als profylactische behandelingen. Er is echter nog een ern therapeutische middelen tegen RNA virusinfecties. Inderdaad, efficiënte vaccins beschikbaar zijn tegen belangrijke humane pathogenen zoals dengue-virus, hepatitis C-virus of menselijk respiratoir syncytieel virus (HRSV). Trouwens, RNA-virussen zijn verantwoordelijk voor de meerderheid van nieuwe ziekten, die zijn toegenomen in frequentie als gevolg van de wereldwijde uitwisseling en menselijke impact op ecologische systemen. Tegen deze dreiging dat RNA-virussen vertegenwoordigen, onze therapeutische arsenaal is uiterst beperkt en relatief inefficiënt 1-3. Huidige therapieën zijn voornamelijk gebaseerd op recombinant type I interferonen (IFN-α / β) naar aangeboren immuniteit te stimuleren,of de toediening van ribavirine. Hoewel het werkingsmechanisme van deze ribonucleoside analoge controversieel en waarschijnlijk afhankelijk van verschillende mechanismen, de remming van cellulaire IMPDH (inosine monofosfaat dehydrogenase), die intracellulaire GTP zwembaden put, moet uiteraard 4. Ribavirine in combinatie met gepegyleerd IFN-α, is de belangrijkste behandeling tegen hepatitis C-virus. Echter, IFN-α / β en ribavirine behandelingen zijn relatief slechte werkzaamheid in vivo tegen de meeste RNA-virussen doeltreffend stompe IFN-α / β signalering door expressie van virulentiefactoren 5, allemaal vaak ribavirine 3. Dit toegevoegd dat ribavirine opheft belangrijke toxiciteit kwesties, maar onlangs werd aangenomen tegen ernstige ziekte HRSV controversiële voordelen 6. Meer recent zijn een virus-specifieke behandelingen op de markt gebracht, in het bijzonder tegen influenzavirus met de ontwikkelinf neuraminidase remmers 3. Echter, de grote diversiteit en permanente ontstaan ​​van RNA-virussen zich verzet tegen de ontwikkeling van specifieke behandelingen tegen elk van hen in een relatief nabije toekomst. Al met al, dit benadrukt de noodzaak van efficiënte strategieën om krachtige antivirale moleculen in de nabije toekomst te identificeren en te ontwikkelen. Het is triviaal te zeggen dat een breed spectrum remmer werkzaam tegen een groot paneel van RNA-virussen dit zou oplossen. Hoewel een dergelijke molecule is nog steeds de droom van een viroloog&#39;s, ons beter begrip van cellulaire afweermechanismen en aangeboren immuunsysteem suggereren dat sommige mogelijkheden bestaan ​​7,8. Verschillende academische en industriële laboratoria zijn nu op zoek naar moleculen die specifieke facetten van cellulaire afweermechanismen of metabole routes om virale replicatie stomp stimuleren. Hoewel dergelijke verbindingen waarschijnlijk zal tonen significante bijwerkingen, zullen behandelingen tegen acute virale infecties toe te dienened voor een relatief korte tijd, waardoor ze aanvaardbaar ondanks enige mogelijke toxiciteit op lange termijn. Verschillende strategieën zijn ontwikkeld om dergelijke breed-spectrum antivirale moleculen identificeren. Sommige onderzoeksprogramma&#39;s gericht op het vinden van moleculen die specifieke afweer of metabole routes richten. Dit omvat bijvoorbeeld pathogeen herkenning receptoren antivirale genexpressie 9 wekken en op antivirale factoren zoals RNaseL 10, autofagie machines virus afbraak 11 te bevorderen, nucleoside synthesemethoden 12,13 of apoptotische cascades dood van virus-geïnfecteerde cellen precipiteren 14. Andere groepen hebben fenotypische schermen die niet zijn gericht op basis 13,15-17 ontwikkeld. In dat geval zijn antivirale moleculen eenvoudig geïdentificeerd door hun vermogen om virale replicatie te blokkeren in een bepaald cellulair systeem. Algemeen wordt aangenomen dat een verbinding remming 2-3 onafhankelijke RNA-virussen een geschikt profiel voor een breed-sp zouectrum antivirale molecule. Het werkingsmechanisme van hit verbindingen gekozen met dergelijke empirische benadering is alleen bepaald in een tweede tijd en uiteindelijk kan leiden tot de identificatie van nieuwe cellulaire doelwitten voor antivirale middelen. Interessant, een retrospectieve analyse van nieuwe geneesmiddelen door de Amerikaanse Food and Drug Administration goedgekeurd tussen 1999 en 2008 is gebleken dat in het algemeen, zoals fenotypische screenings vaak beter presteren dan-target-based benaderingen van first-in-class kleine synthetische molecules 18 ontdekken . Virale replicatie in high-throughput celgebaseerde proeven wordt meestal bepaald op virus cytopathische effecten. Cellen geïnfecteerd en gekweekt in 96 - of 384-well platen in de aanwezigheid van geteste verbindingen. Na enkele dagen worden cellagen gefixeerd en gekleurd met kleurstoffen zoals kristalviolet. Tenslotte wordt absorptie bepaald met een plaatlezer en verbindingen remmen virale replicatie worden geïdentificeerd door hun vermogen om cellulaire lagen weer behoudenm-virus-geïnduceerde cytopathische effect. Als alternatief zijn viraal-gemedieerde cytopathische effecten beoordeeld met behulp van standaard levensvatbaarheid testen zoals MTS reductie. Dergelijke assays zijn zeer handelbaar en kosteneffectief, maar lijden drie belangrijke beperkingen. Eerste plaats hebben zij een virus-cel kleurcombinatie virale replicatie cytopathische slechts enkele dagen, maar dit is niet altijd mogelijk, en pleiten voor alternatieve benaderingen 19. Ten tweede zijn ze slecht kwantitatieve aangezien zij gebaseerd zijn op een indirecte maat voor virale replicatie. Ten slotte kunnen toxische verbindingen worden als positief geteld hits, en daarom moet worden geëlimineerd met een teller scherm van cellulaire levensvatbaarheid. Om deze hindernissen te overwinnen, hebben recombinante virussen of replicons gemanipuleerd door reverse genetica reporter eiwitten, zoals EGFP of luciferase expressie, een aanvullende transcriptie-eenheid of in frame met viraal eiwit genen (enkele voorbeelden 20-23). Wanneer deze virussen repliceren reporter proteins worden geproduceerd samen met virale eiwitten zelf. Dit verschaft een kwantitatieve bepaling van virale replicatie te meten en evalueren van de remmende activiteit van kandidaat moleculen. Dit geldt met name voor recombinante virussen luciferase tot expressie brengt (of andere enzymen die in staat bioluminescentie) aangezien deze reporter systeem vertoont een breed dynamisch bereik met een hoge gevoeligheid en vrijwel geen achtergrond. Bovendien is er geen excitatie lichtbron, waardoor wordt voorkomen interferentie met verbinding fluorescentie 24. Hier hebben we detail een high-throughput-protocol om chemische bibliotheken voor een breed-spectrum remmers van RNA-virussen te screenen. Verbindingen worden eerst getest op menselijke cellen geïnfecteerd met een recombinant mazelenvirus (MV) uiten vuurvliegluciferase 25 (rMV2/Luc, figuur 1, primaire scherm). MV behoort tot orde Mononegavirales, en wordt vaak beschouwd als een prototypisch lid van negatieve-streng RNA-viruses. Als zodanig wordt MV genoom als een matrijs door het virale polymerase mRNA-moleculen die coderen voor virale eiwitten synthetiseren. In het recombinante MV stam genaamd rMV2/Luc wordt luciferase-expressie tot expressie van een extra transcriptie-eenheid ingevoegd tussen P en M-genen (Figuur 2A). Daarnaast worden verbindingen getest op hun toxiciteit voor menselijke cellen handel gebruikelijk luciferase gebaseerde reagens die resulteert door ATP kwantificering, het aantal metabolisch actieve cellen in kweek (Figuur 1, primaire screening). Volledige chemische bibliotheken kunnen gemakkelijk worden gescreend met beide assays om verbindingen die niet toxisch en efficiënt blokkeren MV replicatie selecteren. Vervolgens worden bekeken getest op remming dosis-respons van MV replicatie, de afwezigheid van toxiciteit en hun vermogen om Chikungunya virus (CHIKV) replicatie (Figuur 1, tweede scherm) beïnvloeden. CHIKV is een lid van Togaviridae familie en zijn genoom is apOSITIEVE enkelstrengs RNA-molecuul. Als zodanig is het volledig los van mazelen en verbindingen remmen zowel MV en CHIKV staan ​​een grote kans om een ​​groot paneel van RNA-virussen remmen. CHIKV structurele eiwitten worden direct vertaald van het virale genoom, dat structurele eiwitten gecodeerd door transcriptie en translatie van een subgenome mRNA molecuul. De in vitro assay voor replicatie CHIKV is gebaseerd op een recombinante stam genaamd CHIKV / Ren, die Renilla luciferase-enzym tot expressie als een gesplitste deel van de niet-structurele polyproteïne door een insertie van het reportergen tussen nsP3 en NSP4 sequenties 26 (figuur 2B). De mate van Renilla luciferaseactiviteit maakt het monitoren van virale replicatie in een vroeg stadium van CHIKV levenscyclus. Deze high-throughput-protocol werd gebruikt om snel verbindingen te identificeren met een geschikt profiel voor een breed-spectrum antivirale middelen in een commerciële bibliotheek van 10.000 Molecules verrijkt voor chemische diversiteit. Verbindingen werden hoofdzakelijk volgende regel van vijf Lipinski&#39;s, met een molecuulgewicht variërend 250-600 dalton, en hieronder inloggen 5 D waarden. De meeste van deze moleculen waren nieuwe chemische entiteiten die niet beschikbaar zijn in andere commerciële bibliotheken.

<table><tbody><tr><td>Freedom EVO platform</td><td>TECAN</td><td></td><td>Robotic platform</td></tr><tr><td>96-well polystyrene cell culture microplates, white</td><td>Greiner Bio One</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>Luciferase-gebaseerde levensvatbaarheidstest</td></tr><tr><td>Bright-Glo Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E2610</td><td>Reagens met vuurvlieg luciferase-substraat</td></tr><tr><td>Renilla-Glo luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E2710</td><td>Reagens met Renilla luciferase-substraat</td></tr><tr><td>Britelite plus Reporter Gene Assay System</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6016761</td><td>Reagens met vuurvlieg luciferase-substraat. Kan worden gebruikt als alternatief voor Bright-Glo reagens om luciferase-activiteit te bepalen.</td></tr></tbody></table>

high-throughput screening voor breed-spectrum chemische remmers van rna-virussen

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA-virussen zijn verantwoordelijk voor grote menselijke ziekten zoals griep, bronchitis, dengue, hepatitis C of mazelen. Zij een nieuwe bedreiging vanwege de toegenomen wereldwijde uitwisseling en menselijke populaties doordringende meer en meer natuurlijke ecosystemen vertegenwoordigen ook. Een goed voorbeeld van een dergelijke nieuwe situatie is chikungunya-virus epidemie van 2005-2006 in de Indische Oceaan. Recente vooruitgangen in ons begrip van cellulaire mechanismen regelen virusreplicatie suggereren dat verbindingen richten gastheercel functies, in plaats van het virus zelf, kan een groot paneel van RNA-virussen remmen. Sommige breed-spectrum antivirale verbindingen zijn geïdentificeerd met gastheer doelgerichte assays. Echter, het meten van de remming van virale replicatie in celkweken middels reductie van cytopathische effecten als uitlezing nog altijd een essentieel screening strategie. Dergelijke functionele testen zijn sterk verbeterd door de ontwikkeling van recombinante virussen expressie ca reporter enzymenPablo van bioluminescentie zoals luciferase. In dit rapport, we detail een high-throughput screening pijpleiding, die recombinant mazelen en chikungunya virussen met cellulaire levensvatbaarheid assays combineert, om verbindingen te identificeren met een breed-spectrum antivirale profiel.

Deze screening pijplijn steunt eerst op de selectie van verbindingen die MV replicatie remmen en geen significante cellulaire toxiciteit (Figuur 1, primaire scherm) niet zien. Het maakt gebruik van luciferase-gebaseerde assays om cellulaire toxiciteit en de remming van virale replicatie bepaald. Alle pipetteerstappen en data acquisitie kan worden uitgevoerd in een hoge-doorvoer setting met een robot platform. Cellulaire toxiciteit van verbindingen wordt bepaald met behulp va...

In vitro assays om virusreplicatie te meten zijn sterk verbeterd door de ontwikkeling van recombinante RNA-virussen tot expressie luciferase of andere enzymen die in staat bioluminescentie. Hier hebben we detail een high-throughput screening pijplijn dat dergelijke recombinante stammen van mazelen en chikungunya virussen breed-spectrum antivirale middelen te isoleren van chemische bibliotheken combineert.

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Het algemene doel van deze procedure is om breedspectrum antivirale middelen uit chemische bibliotheken te isoleren met behulp van een combinatie van in vitro celgebaseerde assays. Dit wordt bereikt door eerst verbindingen te selecteren die de in vitro replicatie remmen van een recombinante stam van het mazelenvirus die luciferase als reporter codeert. Parallel daaraan wordt de toxiciteit van de verbinding geschat met behulp van een op luciferase gebaseerde viabiliteitsassay.De gecombineerde fenotypische gegevens van beide assays worden gebruikt om HIT-moleculen te isoleren. De laatste stappen bestaan uit het opnieuw testen van de HIT-verbindingen op dosisrespons-replicatieremming van het mazelen- en chikungunya-virus, en het nauwkeuriger meten van de in vitro toxiciteit. Uiteindelijk worden breedspectrum antivirale verbindingen geïdentificeerd en gevalideerd door de screening.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals standaard virusreplicatie-assays gebaseerd op cytopathische effecten, is dat het luminescentie als uitlezing gebruikt en twee sterk uiteenlopende virussen combineert die luciferase als reporter tot expressie brengen. De pr

high-throughput-screening-for-broad-spectrum-chemical-inhibitors-rna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Nieuwe gastheer factoren die betrokken zijn bij virale infectie kan worden geïdentificeerd door middel van cel-gebaseerde genoom-brede verlies van functie RNAi screening.

RNAi Screening voor Host factoren die betrokken zijn in Vaccinia Virus infectie met behulp van Drosophila Cellen

Drie assays, zoals de cytopathische effect (CPE) gebaseerde bepaling, dosis-respons assay en tijd-van-toevoeging (ToA) assay ontwikkeld, geoptimaliseerd, gevalideerd en toegepast op nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus (BTV) identificeren alsmede zoals het bepalen van de mogelijke mechanisme-van-actie (MoA) voor nieuw geïdentificeerde antivirale middelen.

Testsystemen voor de identificatie van nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus

Hier beschrijven we cellulaire cytotoxiciteit en ronde infectiviteitsassays die zorgen voor een snelle en nauwkeurige screening van verbindingen om hun cellulaire cytotoxiciteit (CC50) bepalen en IC 50-waarden tegen WT en resistente HIV-1.

Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers

Hier presenteren we een protocol dat specifieke stappen van de virale binnenkomst onderzoekt om nieuwe antivirale middelen te identificeren en te evalueren.

Early Viral Entry testsystemen voor de identificatie en evaluatie van antivirale verbindingen

Methoden om de werkzaamheid en toxiciteit van RNA-moleculen die zich richten op post-integratie stappen van de HIV-1 replicatiecyclus te evalueren, worden beschreven. Deze methoden zijn nuttig voor het screenen van nieuwe moleculen en het optimaliseren van de indeling van bestaande.

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Hier beschrijven we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te ontdekken van de doelen van de gastheer die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie, specifiek rhabodvirus en vaccinia virus therapie, maar het kan gemakkelijk aangepast worden aan andere oncolytische virus platformen of voor het ontdekken van host-genen die virus replicatie in het algemeen moduleren.

Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

We beschrijven een cel-gebaseerde test om te melden aan de HIV-1 fusion via de uitdrukking van groen fluorescent proteïne aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het kan worden gebruikt voor het testen van remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen.

Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

Hier presenteren we de protocollen om te identificeren 1) virus-gecodeerde immunomodulators ter bevordering van arbovirus replicatie en 2) eukaryotische gastheer factoren die arbovirus replicatie beperken. Deze fluorescentie - en luminescentie gebaseerde methoden toestaan onderzoekers snel verkrijgen van kwantitatieve uitlezingen van arbovirus replicatie in simplistische testen met lage signaal-ruis verhouding.

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

In dit werk beschrijven we de protocollen die worden gebruikt in op replicon gebaseerde en virale enzymgebaseerde testen om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie in een screeningsformaat met hoge doorvoer.

Antivirale testen met hoge doorvoer om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie

We beschrijven een single-cell high-throughput assay voor cytotoxiciteit van T-cellen te meten wanneer geïncubeerd met tumor doelcellen. Deze werkwijze gebruikt een dichte, elastomeer reeks sub-nanoliter wells (~ 100.000 putjes / array) ruimtelijk beperken de T-cellen en doelcellen met gedefinieerde verhoudingen en is gekoppeld met fluorescentie microscopie effector-target conjugatie en daaropvolgende apoptose controleren.

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Leer een high-throughput screeningmethode voor het isoleren van breed-spectrum antivirale verbindingen uit chemische bibliotheken. Deze techniek gebruikt recombinante mazelen- en chikungunya-virussen met luciferase als reporter voor nauwkeurige meting van virusreplicatie en toxiciteit.

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

Meer video's verkennen