Visualisatie van ATP synthase Dimeren in Mitochondriën door Electron Cryo-tomografie

Het algemene doel van deze procedure is om de structuur en organisatie van mitochondriale eiwitten in C twee te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst een bevroren gehydrateerd elektronenmicroscoop rooster te genereren dat het monster bevat. Vervolgens wordt een dosisbeperkte kantelreeks van het monster opgenomen in een elektronencryoscoop.

Vervolgens wordt de kantelreeks verwerkt om een tomografisch volume te genereren. Ten slotte worden de eiwitdichtheden gemiddeld om de structuur van de eiwitten te bepalen en worden de membranen gesegmenteerd om hun 3D-structuur te onthullen. Door de gemiddelden van eiwitten terug te plaatsen in de Tom Grahams, wordt de structuur en organisatie van eiwitten in het membraan onthuld.

Dus we doen elektronencryo tomografie van mitochondriën omdat we willen begrijpen hoe ze werken op moleculair niveau. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven andere methoden, zoals elektronenmicroscopie van dunne plastic secties, is dat de resolutie hoger is. Het materiaal is op geen enkele manier chemisch gefixeerd en de moleculaire details van de eiwitten worden behouden.

De techniek van elektronencryografie kan enige tijd kosten om onder de knie te krijgen, maar ervaren gebruikers kunnen vijf tot zes goede kwaliteit TOM gronden per sessie verkrijgen. Het moeilijkste deel van de procedure is het produceren van bevroren gehydrateerde roosters met een optimale ijsdikte Na het isoleren en pelleten van mitochondriën, gebruik volgens het tekstprotocol 250 millimolair T triosen in 10 millimolair HEPA-buffer om de pellet te resuspenderen tot een concentratie van ongeveer vijf milligram per milliliter van totaal eiwit glow discharge. Volledig koolstof EM-roosters koolstofzijde omhoog in een vacuümapparaat volgens de instructies van de fabrikant, vervloei een paar milliliter ethaan door een stroom ethaangas op de binnenkant van een met vloeibare stikstof gekoelde aluminium container te richten.

Gebruik een paar pincetten om een glow discharge DM-raster op te pakken en plaats het op de bank mix eiwit, een geconjugeerd gouden fiducial-suspensie, één-op-één met de mitochondriale suspensie, en breng onmiddellijk drie microliters van de oplossing aan op het rooster. Plaats vervolgens de pincetten in een vitrificatie-apparaat zoals een zelfgemaakte guillotine met een wig van filterpapier om het overtollige vocht van het rooster af te deppen en laat de trekker los om het rooster onmiddellijk in vloeibaar ethaan te dompelen. Breng vervolgens het rooster over van vloeibaar ethaan naar vloeibare stikstof om later te gebruiken.

Verwijder het overtollige ethaan van het rooster door de punt van een nieuwe filterpapierwig in het vloeibare ethaan te plaatsen. Terwijl het vocht stijgt, trekt u het rooster voorzichtig omhoog over het filterpapier, waarbij u het onder de vloeistooffront houdt, en brengt u het vervolgens onmiddellijk over in vloeibare stikstof om het later op te slaan. Plaats het rooster in een roosterbox en bewaar het in een met vloeibare stikstof gevulde doos om een tomografisch kantelreeks op te nemen.

Begin door ervoor te zorgen dat de vloeibare stikstofdozen vol zijn en controleer of de temperatuur van het monsterstadium en het roosteroverdrachtsapparaat onder de 100 kelvin ligt. Bevestig dat de elektronenmicroscoop goed is uitgelijnd door een afbeelding van een testrooster te maken en de kwaliteit van de doorns te controleren. T tho-ringen moeten rond zijn en zich uitstrekken tot aan de rand van de afbeelding. Plaats vervolgens een rooster met bevroren gehydrateerde mitochondriën.

Zoek vervolgens in zoekmodus naar gebieden met een geschikte ijsdikte en monsterkwaliteit. Neem een zoekbeeld van zes seconden van veelbelovende gebieden om de geschiktheid voor gegevensverzameling te bepalen. Nadat u een goed monstersgebied hebt gevonden, kantel het stadium plus of min 60 graden om de maximale kantelbereik te bepalen die beschikbaar is zonder obstructie van het belichtings- of focusgebied door roosterstaven of ijskristallen op een nabijgelegen ijsgevuld gat met een vergelijkbaar uiterlijk, verander naar de belichtingsmodus en pas de stralingsintensiteit of beeldverwervingstijd aan.

Dus heeft elk opgenomen beeld een elektronen dosis van 30 tot 50 elektronen per pixel voor CCD's of zes tot acht elektronen per pixel per seconde. Voor directe elektronendetektoren, bereken de dosisverdelingsverhouding of I nul over I 60 door de gemiddelde elektronenachting voor een beeld van één seconde verkregen bij nul graden te delen door die van een 60 graden beeld over een leeg gat. Maak een beeld van één seconde in de belichtingsmodus en noteer het aantal elektronen per angström vierkant.

Reken rekening houdend met de dosisverdelingsverhouding het totale aantal beelden en het kantelinterval dat kan worden opgenomen voor een specifieke totale elektrendosering met behulp van geschikte automatische gegevensverzameling software. Stel een Tom Agram op met de zojuist bepaalde parameters, typisch tomos. Voor deze monsters, begin bij plus of min 20 graden en ga door nul graden voordat u hoge kantelstanden bereikt.

Om tomos te maken en te segmenteren, converteer de kantelreeks naar een bestandsformaat dat geschikt is voor de reconstructiesoftware. Gebruik een Tom Graham reconstructieprogramma zoals Im mod, align de beelden door de positie van de gouden fiducial markeringen te markeren. Eenmaal uitgelijnd, genereer een Tommo Graham.

Verbeter het contrast van de tommo Graham door een afbeeldingsfilter zoals de niet-lineaire anisotropische diffusiefilter te gebruiken die wordt gedistribueerd met IM o voor visualisatie. Gebruik commercieel verkrijgbare programma's om de Tom handmatig te segmenteren. Wijs voxels toe die overeenkomen met de binnen- en buitenmembraan om afzonderlijke lagen te scheiden, eenmaal toegewezen, creëer een oppervlak om de membranen te visualiseren.

Gebruik de clicker-optie in de EM-package plugin voor emira, markeer de locatie van een TP syntase deeltjes met behulp van de gemarkeerde deeltjes als invoer en een geschikt softwarepakket zoals de deeltjesschatting. Voor het elektronentomografie programma, bereken een agram gemiddelde voor een resolutieschatting. Bereken de foyer shell correlatie tussen twee onafhankelijk bepaalde sub tommo gemiddelden met behulp van het gratis visualisatieprogramma.

Chimera past bekende röntgenstructuren in in de sub Tom Agram gemiddelde eerst handmatig, vervolgens automatisch met de opdracht fit zoals