Name: Een Anoxia-verhongering Model voor ischemie / reperfusie in C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Leer een anoxie/verhongeringsmodel voor ischemie/reperfusie in C. elegans. Deze methode maakt het mogelijk om neuronale schade en gedragsveranderingen te evalueren met fluorescentiemicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Figuren 1 en 2 werden eerder gepubliceerd in Free Radical Biology &amp; Medicine (Queliconi et al.. 5) en hebben het auteursrecht van Elsevier. Dit werk werd ondersteund door de Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), het Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Processos Redox em Biomedicina, de Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox em Biomedicina, USPHS NS064945 (KN), en USPHS GM087483 (KN ). BBQ is een doctoraal student ondersteund door een FAPESP fellowship.

1. C. elegans Groei <ol><li> Bereid 35 mm Nematoden Groei Media (NGM) agar platen geënt met OP50 bacteriën, volgens de standaard teeltmethoden 1. </li><li> Synchroniseer C. elegans door het plaatsen van 6 zwangere volwassenen op een geplaatste NGM plaat. Verwijder volwassenen na ~ 100 eieren gelegd (~ 3 uur). </li><li> Incubeer de platen gedurende 3 dagen bij 20 ° C, waarna de wormen ontwikkeld jonge volwassen stadium en zijn optimaal voor dit experiment. Alternatieve protocollen C. synchroniseren elegans worden elders 10 beschreven. </li></ol> 2. Materialen voor AS <ol><li> M9 buffer (22 mM KH 2PO 4, 42 mM Na 2 HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4) worden gezuiverd van zuurstof door equilibreren met N2 (argon kan ook worden gebruikt) gedurende 30 min voorafgaand aan het experiment en bleef omringd door ijs. </li><li> Maak een klein gaatje (3 mmbreed) in het deksel van 1,5 ml microcentrifuge buizen waarin de wormen worden tijdens AS geplaatst. Het gat zorgt voor gasuitwisseling zonder het houden van het deksel open, omdat dit kan leiden tot overmatige media verdamping. </li></ol> 3. Anoxie / Honger <ol><li> Voer alle experimenten ten minste in drievoud. </li><li> Voeg 1 ml van RT, geoxygeneerde M9 buffer elke 35 mm plaat met jonge volwassen wormen gekweekt zoals hierboven beschreven. Let op dat het verwijderen van bacteriën uit de plaat (voeg M9 aan de randen waar bacteriën niet werden uitgezet). Na ~ 1 min de wormen moeten zwemmen in de M9. </li><li> Coat een 1 ml pipet tip met BSA door pipetteren en het verdrijven van een steriele 1% BSA-oplossing. </li><li> Neig de plaat zorgvuldig met de wormen in M9 buffer, verwijder de M9 uit dezelfde plaats waar het werd toegevoegd, en plaats de suspensie in de voorbereide microcentrifugebuizen. Laat rusten in ijs tot de wormen zijn gedaald tot beneden de buizen (1 ~-2 Min). </li><li> Haal het maximale bedrag van de M9 mogelijk zonder de wormen te verstoren van de buis (het verlaten van ongeveer 100 pl), voeg 1 ml van de zuurstof gespoeld en iced M9 en plaats de buis over ijs tot de wormen naar de bodem weer. Herhaal de laatste stap 3x. In de laatste wasbeurt, verwijder dan de M9 tot ~ 100 pi blijft in de buis. </li><li> Plaats de buizen met de wormen in zuurstofarme M9 in een zuurstofloze / zuurstofarme kamer (zie aanwijzingen hieronder, paragraaf 3.6.1) of, als alternatief, in een aangepaste gesloten verpakking (zie onderstaande instructies, paragraaf 3.6.2). <ol><li> Als een commerciële zuurstofloze / zuurstofarme kamer wordt gebruikt, laat wat gespoeld M9 in de kamer voordat stap 3.5 en herhaal stap 3.5 zodra de wormen zijn in de kamer. </li><li> Als een aangepaste kamer wordt gebruikt, wordt een gedetailleerde beschrijving van hoe een goedkope inrichting te creëren die eind van dit protocol is beschreven door een andere groep vooraf 11. In het kort: <ol&gt; <li> Maak twee gaten in een 250 ml Tupperware-achtige deksel en voeg buisconnectoren aan hen. Men zal worden gebruikt om het gasmengsel injecteren terwijl de andere het uitlaatgas in een waterbad wordt. </li><li> Plaats de wormen in de kamer en sluit de kamer met behulp van de deksel. </li><li> Gas met een constante N2 stroom (100 ml / min). </li><li> Plaats de container in een waterbad bij 26 ° C. Zorg ervoor dat de uitgang buis goed is ondergedompeld in water, zodat er geen lucht terugkeert en dat er geen lekken in het systeem (schijnbare door bellen die voortvloeien uit de kamer zelf). </li></ol></li></ol></li><li> Incubeer de wormen bij 26 ° C gedurende 20 uur. </li></ol> 4. Gesimuleerde Reperfusie <ol><li> Na 20 uur onder AS voorwaarden, verwijder de buizen uit de incubatiekamer in omgevingslucht. </li><li> Pipet C. elegans met een BSA-gecoate tip (zoals in stap 3.3) op een OP50 gezaaid 35 mm NGM plaat. Incubeer de platen bij 20 ° C gedurende 24 uur.Hierna zal de wormen klaar gescoord worden. </li></ol> 5. Het identificeren van Dead Versus levende wormen <ol><li> Met behulp van een platina pick Druk licht op de bovenkant van het hoofd van de worm. Levende wormen zal achteruit na aangeraakt te verplaatsen. Als de wormen zijn niet meer reageert, scoren als dood. Af en toe zal een worm niet achteruit te gaan, maar kan een kleine side-to-side beweging van het hoofd vertonen. Hoewel het technisch niet dood, deze wormen zijn bijna zeker te vervallen binnen enkele uren, en moet worden als dood. Als men te lang om te scoren de wormen wacht, kan de interne uitkomen van nageslacht optreden en deze &quot;zakken-of-wormen&quot; kunnen scheuren, waardoor het opsporen van de karkassen erg moeilijk. </li><li> Verwijder beide levende en dode wormen van de plaat zoals ze worden geteld om dubbele tellingen te vermijden. De levende wormen kunnen worden verplaatst naar een afzonderlijke plaat gedrag assays. De hoeveelheid levende wormen vergeleken met het totaal wordt weergegeven als% overlevende wormen (Figuur 1A </strong&gt;). </li></ol> 6. Touch Response Assay <ol><li> Een gedetailleerde beschrijving van dit protocol is gepresenteerd in Hart, Anne C., ed.. Gedrag (3 juli 2006), WormBook, ed.. De C. elegans Research Gemeenschap, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. <ol><li> Te scoren voor touch reactie, identificeren wormen die bewegen en licht raken de zijkant van het hoofd van de worm (in de buurt van het middelste deel van de keelholte) met een wimper pick (Figuur 3). </li><li> Als de worm schuift naar achteren, scoren zo reageren, zo niet, scoor reageert niet (Figuur 1B). Herhaal deze stap 10-15x voor elke worm met 10 sec interval. Probe tenminste 10 wormen in elke groep om nauwkeurige gegevens. Dezelfde test kan worden gebruikt om vooruit te beoordelen motorische veranderingen na lichte aanraking met het achterste lichaam muur. Zorg ervoor dat de kop of staart van de worm niet aan te raken, want dit bevordert een duidelijke gedrag. </li><li> Ten slottecollectieve genetische controle stammen [N2 Bristol wild-type voor positieve, mec (mechanosensorische) mutant voor negatieve - bijvoorbeeld CB1338 mec-3 (e1338) IV] om de kracht waarmee de wormen raken kalibreren. Te hard van een stimulatie zal een gedragsmatige respons op te wekken in mec mutanten, te weinig zal een effect niet ontlokken in wildkleur N2 controles. </li></ol></li></ol> 7. Neuronale Wijzigingen <ol><li> Te visualiseren bericht AS neuronale wijzigingen, gebruik dan een stam die GFP uitdrukt in het touch-reagerende mec neuronen 4,5. Deze neuronen lange uitlopers die langs de lichaamswand en worden gemakkelijk behaald morfologische afwijkingen. Daarnaast kan de morfologische informatie geïntegreerd gedragsmetingen neuronale functie, zoals hierboven beschreven. Een stam die kan worden gebruikt voor dit doel TU2583, die verkrijgbaar is uit de C. elegans Genetica Center en bevat de uIs25 geïntegreerde transgen GFP weerm de mec-18 promotor, of alternatief TU2562, waarin een geïntegreerde mec-3 :: GFP-fusie bevat. </li><li> Bereid een agarose pad. <ol><li> Smelt 2% agarose in water, breng aan M9 1x met een 10x voorraad, en de oplossing te handhaven op 70 ° C. </li><li> Breng een druppel (~ 20 pi) van deze oplossing op een glasplaatje (25 mm x 75 mm) die is geplaatst tussen twee dia&#39;s, die elk een stuk tape op de onderzijde. </li><li> Plaats een definitieve glasplaatje loodrecht op de eerste bovenop de 2% agarose oplossing en laat het afkoelen bij kamertemperatuur. Dit zou een pad dat de dikte van de band vormen. </li><li> Verwijder de bovenste dia en voeg 10 ul van M9 die 0,1% tetramisol, die de wormen zal immobiliseren. </li></ol></li><li> Verplaats enkele (~ 10) leven wormen op de 2% agarose glijbaan. Plaats een dekglaasje over hen en visualiseren GFP met behulp van een fluorescentie microscoop onder een 100x objectief met de juiste belichting. </li><li> Beschadigdeneuronen een cytosolische membraan parelsnoer patroon in de processen uit meerdere punctum (figuur 2A) en / of afwijkingen waarin zich lijkt te breken (figuur 2B) tonen. Telling punctum en vertonen in zowel neuronen per worm, met in totaal ten minste 10 wormen. </li></ol> 8. -Lab gemaakt Hypoxic Kamer <ol><li> Een Tupperware-stijl, afsluitbaar, luchtdichte container kan worden uitgerust als een zuurstofloze kamer. Zorg een container die zo klein mogelijk te kiezen. Een kleine container creëert een hypoxische omgeving sneller en gemakkelijker te passen in het waterbad (figuur 4). </li><li> Maak twee gaten in het deksel (kan worden gedaan met een schroevendraaier of door verhitting pincet en dwingen in het deksel) en plaats een plastic of metalen connector die de buis (figuur 5A) past. Gebruik lijm die onder water kan worden gebracht en ook wordt hard na drogen verplaatsing voorkomende connector en daarmee de kans op lekken (Figuur 5B) verminderen. </li><li> De houder moet in het waterbad worden geplaatst dat het volledig is ondergedompeld (figuur 4). Om de container te dompelen, gebruik dan een fles gewicht of een snoekduik gewicht. </li><li> Een pijpverbindingen worden gebruikt om een gasmengsel te voeren en de andere buis fungeert als een drukontlasting, daarom moet het onder water gelaten zodat de houder is afgesloten van de externe omgeving (figuur 4). </li><li> De samenstelling van de lucht kan worden gemoduleerd met behulp van aangepaste gemaakt gas, mass flow controllers of een apparaat dat de gewenste gassen mengt. De gasstroom moet worden gecontroleerd, zoals high flow overmatige verdamping kan creëren. Bijvoorbeeld, in een 250 ml beker, 100 ml / min van gas goede ruimte voor de wormen en een geschikte flux verschaffen. </li><li> De lengte van de buis moet tot een minimum worden beperkt, aangezien zij gasdoorlatend, kan eenllowing de ingang van O 2. Het is belangrijk om te voorkomen dat het gebruik van siliconen, Tygon buizen omdat deze materialen zijn doorlaatbaar voor gasuitwisseling. Wij verkiezen polypropyleen of nylon buizen. Glazen of metalen buis handhaven van de gassen goed, maar zijn ook moeilijker om mee te werken. </li></ol>

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+gene+function+in+Caenorhabditis+elegans+using+RNA-mediated+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+Funct.+Genom.+Proteom%22%5BJournal%5D)">Studying gene function in Caenorhabditis elegans using RNA-mediated interference.</a> Briefings Funct. Genom. Proteom. 7 (3), 184-194 (2008).</li>
<li>Vanden Hoek,, L, T., Shao, Z., Li, C., Zak, R., Schumacker, P. T., Becker, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reperfusion+injury+on+cardiac+myocytes+after+simulated+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reperfusion injury on cardiac myocytes after simulated ischemia.</a> Am. J. Physiol. 270 (4), 1334-1341 (1996).</li>
<li>Ba Scott,, Avidan, M. S., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+hypoxic+death+in+C.+elegans+by+the+insulin%2FIGF+receptor+homolog+DAF-2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of hypoxic death in C. elegans by the insulin/IGF receptor homolog DAF-2.</a> Science. 296 (5577), 2388-2391 (2002).</li>
<li>Queliconi, B. B., Marazzi, T. B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicarbonate+modulates+oxidative+and+functional+damage+in+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Rad.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Bicarbonate modulates oxidative and functional damage in ischemia-reperfusion.</a> Free Rad. Biol. Med. 55, 46-53 (2013).</li>
<li>Wojtovich, A. P., DiStefano, P., Sherman, T., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP-sensitive+potassium+channel+activity+and+hypoxic+preconditioning+are+independent+of+an+inwardly+rectifying+potassium+channel+subunit+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP-sensitive potassium channel activity and hypoxic preconditioning are independent of an inwardly rectifying potassium channel subunit in Caenorhabditis elegans.</a> FEBS Lett. 586 (4), 428-434 (2012).</li>
<li>Dasgupta, N., Patel, A. M., Scott, B. A., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+Preconditioning+Requires+the+Apoptosis+Protein+CED-4+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxic Preconditioning Requires the Apoptosis Protein CED-4 in C. elegans.</a> Curr. Biol. 17 (22), 1954-1959 (2007).</li>
<li>Jia, B., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+anesthetic+preconditioning+present+in+the+invertebrate+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Volatile anesthetic preconditioning present in the invertebrate Caenorhabditis elegans.</a> Anesthesiology. 108 (3), 426-433 (2008).</li>
<li>Wojtovich, A. P., Sherman, T. A., Nadtochiy, S. M., Urciuoli, W. R., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLO-2+is+cytoprotective+and+contributes+to+mitochondrial+potassium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SLO-2 is cytoprotective and contributes to mitochondrial potassium transport.</a> PloS One. 6 (12), e28287(2011).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).</li>
<li>Fawcett, E. M., Horsman, J. W., Miller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+defined+gaseous+environments+to+study+the+effects+of+hypoxia+on+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (65), e4088(2012).</li>
<li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bokov, A. F., Hakala, K. W., Weintraub, S. T., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+anaerobic+response+of+C.+elegans+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Profiling the anaerobic response of C. elegans using GC-MS.</a> PLoS One. 7 (9), 10-1371 (2012).</li>
<li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+cell+cycle-regulated+proteins+correlates+with+anoxia-induced+suspended+animation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of cell cycle-regulated proteins correlates with anoxia-induced suspended animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (5), 1473-1483 (2002).</li>
<li>Jiang, H., Guo, R., Powell-Coffman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+hif-1+gene+encodes+a+bHLH-PAS+protein+that+is+required+for+adaptation+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans hif-1 gene encodes a bHLH-PAS protein that is required for adaptation to hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7916-7921 (2001).</li>
<li>Twumasi-Boateng, K., Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+age-dependent+reversal+in+the+protective+capacities+of+JNK+signaling+shortens+Caenorhabditis+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">An age-dependent reversal in the protective capacities of JNK signaling shortens Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 11 (4), 659-667 (2012).</li>
<li>Wang, Y., Chen, J., Wei, G., He, H., Zhu, X., Xiao, T., Yuan, J., Dong, B., He, S. S. kogerbøG., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+intermediate-size+transcriptome+shows+high+degree+of+stage-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans intermediate-size transcriptome shows high degree of stage-specific expression.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5203-5214 (2011).</li>
<li>Perry, C. N., Huang, C., Liu, W., Magee, N., Carreira, R. S., Gottlieb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+mitochondrial+electron+transfer+enzyme%2C+Ndi1%2C+in+myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury.</a> PloS One. 6 (2), e16288(2011).</li>
<li>Chai, Y., Li, W., Feng, G., Yang, Y., Wang, X., Ou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Cellular+Dynamics+During+Caenorhabditis+elegans+Postembryonic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Cellular Dynamics During Caenorhabditis elegans Postembryonic Development.</a> Nature Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li>
<li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na%2B%2FH%2B+exchanger+NHX-2+increases+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J. Biol. Chem. 278 (45), 44657-44666 (1074).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

AS grote schaal gebruikt in C. elegans model IR letsel. Enkele belangrijke punten moet worden benadrukt voor dit protocol: C. elegans zijn bestand tegen een breed scala van blessures, rechtvaardigen de noodzaak voor 3 gelijktijdige beledigingen (hitte, honger en anoxie) tot de dood te bereiken met behulp van dit systeem. Anoxia alleen niet de wormen te doden in dit venster van de tijd 14. Bovendien temperatuurstijging vormt een extra belasting, dus is het belangrijk om de voet te volgen. Strikt genomen, is honger niet significant bij aan de mate van sterfte 7, per se, maar het blijkt variabiliteit te verminderen onder experimentele replicaten. Aangezien er aanzienlijke variatie van dag tot dag kan zijn, is het uiterst belangrijk te vergelijken met monsters lopen direct parallel en experimenten over meerdere dagen herhaald. In het algemeen worden de resultaten gemeten drie afzonderlijke platen van 50-100 wormen / experimentele groep en dit zijn den gemiddeld en beschouwd als een enkele experimentele repliceren. In het algemeen, tussen de zeven en negen herhalingen voldoende om te bereiken of uit te sluiten statistische significantie te zijn. Het ontwikkelingsstadium van de wormen in het experiment moet ook zorgvuldig worden gecontroleerd als de gevoeligheid van verschillende fasen AS schade aanzienlijk 15,16 varieert. Het gebruik van jongvolwassenen standaard en larvale stadium (L3 en L4) wormen lijken beter bestand tegen de schadelijke effecten van AS (ongepubliceerde gegevens) zijn. Dit protocol biedt twee manieren om de experimenten uit te voeren, de ene met een lab gemaakt apparaat (met behulp van Tupperware type containers en gas ingang 11) en andere met behulp van een commercieel zuurstofarme kamer 4,6. Anoxie kan worden bereikt met andere middelen die de zuurstof consumeren, zoals elders beschreven 13,17. Het gebruik van alternatieve technieken om een ​​zuurstofarme omgeving te creëren kan de AS incubatietijd nodig te wijzigenom de gewenste hoeveelheid van dood maken. Gericht op ~ 20% overleving is een ideaal uitgangspunt voor het bestuderen van beschermende maatregelen, terwijl 80% is eveneens ideaal voor interventies die de schadelijke effecten van AS verergeren. Een ander belangrijk nadeel is het moment waarop de waarnemer scores dood / levend wormen. Als de tijd voor analyse wordt verlengd na 24 uur, kunnen de gegevens misleidend omdat dode wormen steeds moeilijker te identificeren. Dit kan het gevolg worm karkassen worden relatief transparant in de tijd, maar ook aan het feit dat bevruchte embryo&#39;s kunnen ontwikkelen in nageslacht postmortale binnenzijde van de karkassen en verstoren ze als ze zich voordoen. De analyse van neuronale morfologie kunnen worden gemodificeerd om te kijken naar eiwit expressie 18, nucleaire fragmentatie en 4 andere parameters 19 te vervangen door een worm stam die de juiste genetisch gecodeerde marker expressie. Een laatste opmerking is dat de visualisatie van deneuronale processen moeten worden uitgevoerd dan 30 minuten na plaatsing van de wormen op de dia. Dieren onder narcose gehouden op dia&#39;s voor langere periodes kan AS-onafhankelijke schade vertonen. Pas de hoeveelheid dieren per dia afhankelijk van de tijd die nodig is om te volgen en te analyseren.

C. elegans is een nematode die is wijd goedgekeurd als een meercellige eukaryote modelorganisme sinds de introductie door Brenner 1. Het is een goedkoop, eenvoudig en veelzijdig model, waarmee gemakkelijk verbanden tussen genetische veranderingen en fenotypische veranderingen 2. Ischemie wordt gekenmerkt door een gebrek aan voedingsstoffen en zuurstof aan een weefsel, gevolgd door reperfusie, wanneer een uitbarsting van zuurstofradicalen geproduceerd 3 en de meeste schade optreedt. In 2002, een model van ischemie / reperfusie (IR) in C. elegans is ontwikkeld 4 met het indienen van de hele worm aan zuurstoftekort, voedingsstoffen ontbering en hittestress voor ongeveer 20 uur, gevolgd door 24 uur onder normale omstandigheden. Hoewel dit model technisch een anoxie-verhongering (AS) staat, celdood via mechanismen die geconserveerd in zoogdieren, met inbegrip van schade geïnduceerd door oxidanten tijdens reperfusie &lt;sup&gt; 5. Bovendien vergelijkbaar zoogdier IR, beschadigd is door AS in C. elegans kan worden voorkomen door ischemische preconditionering 6,7 of verdoving preconditionering 8,9. Onderstaande protocollen demonstreren hoe IR bootsen in C. elegans met behulp van de AS-model, hoe om te scoren morfologische en gedragsmatige afwijkingen die het gevolg zijn van AS, en hoe u het protocol aan te passen op een manier die het mogelijk maakt het experiment uit te voeren met een lagere initiële investering met behulp van een op maat gemaakt, eenvoudig geconstrueerde kamer alternatief .

<table><tbody><tr><td>N2&nbsp; strain</td><td>CGC</td><td></td><td>Wild type strain. http://www.cbs.umn.edu/CGC/</td></tr><tr><td>TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td><td>CGC</td><td>TU2583</td><td>integrated fluorescent transgene used to label touch neurons.
http://www.cbs.umn.edu/CGC/</td></tr><tr><td>CB1338 mec-3 (e1338)IV</td><td>CGC</td><td>CB1338</td><td>canonical mec-3 mutant that is touch insensitive.
http://www.cbs.umn.edu/CGC/</td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U Microscope&nbsp;</td><td>Nikon USA</td><td>TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Low Temperature Incubator</td><td>Sheldon Manufacturing Inc.</td><td>Model 2005</td><td></td></tr><tr><td>Eyelash Pick</td><td></td><td></td><td>An eyelash pick can be prepared by attaching&nbsp; an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3).</td></tr><tr><td>Hypoxic Chamber</td><td>Coy</td><td>8307030</td><td>Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.</td></tr></tbody></table>

een anoxia-verhongering model voor ischemie / reperfusie in<em&gt; c. elegans</em

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocollen voor anoxia / verhongering in het genetisch modelorganisme C. elegans simuleren ischemie / reperfusie. Wormen worden gescheiden van bacteriële voedsel en onder anoxie geplaatst voor 20 uur (gesimuleerde ischemie) en vervolgens verplaatst naar een normale atmosfeer met voedsel (gesimuleerde reperfusie). Deze experimentele paradigma leidt tot hogere sterfte en neuronale schade en technieken worden aan de levensvatbaarheid van organismen, wijzigingen in de morfologie van aanraking neuron processen en drukgevoeligheid, die gedrags uitgang van neuronale functie vertegenwoordigt beoordelen. Ten slotte wordt een methode voor het construeren van hypoxische incubators gebruik van gemeenschappelijke keuken opslag containers beschreven. De toevoeging van een massastroom besturingseenheid maakt wijzigingen aan te brengen het gasmengsel in de aangepaste incubators en een circulerend waterbad maakt zowel temperatuurregeling en maakt het gemakkelijk om lekken te identificeren. Deze methode biedt een goedkoop alternatief voor commercieelbeschikbare eenheden.

Het onderwerpen van C. elegans tot 20 hr AS bij 26 ° C in een speciaal laboratorium gemaakte incubatiekamer beschreven (Sectie 3.6.2) tot aanzienlijke mortaliteit (figuur 1A) 5. Latere fluorescente beeldvorming van punctum en breuken in de GFP gemerkte neuronenprocessen overlevenden bevestigde de aanwezigheid van morfologische afwijkingen (figuur 2). De overlevenden reageerde ook slecht op lichte body wall touch (Figuur 1B). Dit model is gebruikt door meerdere groepen te bestuderen hoe genetische aanleg, farmaceutische interventie, en metabole plasticiteit beïnvloedt als afhankelijke uitkomsten 4-6,8,9,12,13. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" /> Figuur 1. C. elegans overleving en aanraking reactie naAS. A) Percentage van de wormen die 24 uur na AS overleving vertonen. De N2 stam is het wild type genetische achtergrond, en KWN85 bevat een geïntegreerde transgen dat mec neuronen etiketten met GFP. B) Reactie op stimuli van levende C. raken elegans (N2 Strain) na AS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" /> Figuur 2. Raak neuron wijzigingen na AS. Touch neuron (PLML en PLMR) afwijkingen zoals bochtig processen en breaks (A) of de accumulatie van GFP aggregaten in de processen (B) werden gecontroleerd in overlevende verdoofd C. eleg<html> ans na AS. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" /> Figuur 3. Wimper pick. Een samengestelde wimper pick. In het bijvoegsel, een detail van de wimpers vastgelijmd aan de tandenstoker hout. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" /> Figuur 4. -Lab gemaakt hypoxische kamer in het waterbad. Een gesloten container klaar om het experiment te starten. Pijlen geven de ingang en uitgang van gas en het gewicht wordt gebruikt om te voorkomen dat zwevende fles. 231fig5.jpg &quot;/&gt; Figuur 5. Details van de inwendige en uitwendige zijde van het deksel. A) Buitenzijde van het deksel, waarin de buis en de aansluiting aan de eerder gemaakte gat. B) Buitenzijde van het deksel, waarin de koppelstuk bevestigd aan de eerder gemaakte gat.

Een protocol wordt beschreven dat gebruikt anoxie / uithongering C. elegans model ischemie / reperfusie. Functionele resultaten omvatten een verhoogde mortaliteit, zichtbare afwijkingen in GFP-gelabelde neuronale processen, en verminderde gedragsreacties die neuronale functie nodig hebt.

Een Anoxia-verhongering Model voor ischemie / reperfusie in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Het algemene doel van deze procedure is om ischemie-reperfusie na te bootsen in sea elegance. Dit wordt bereikt door sea elegance over te brengen naar een microbuisje en de bacteriën uit te spoelen. De tweede stap is het creëren van een anoxische omgeving.Met behulp van een in het laboratorium vervaardigde hypoxische kamer worden de dieren 20 uur lang blootgesteld aan anoxie, waarna ze na 24 uur in aerobe omstandigheden worden geplaatst. De laatste stap bestaat uit het tellen van de dode dieren en het scoren van de aanrakingsrespons. Neuronale modificaties worden daarnaast waargenomen via fluorescentiemicroscopie.Uiteindelijk wordt anoxische uithongering bij C. elegans gebruikt om in een eenvoudiger en flexibeler genetisch model dezelfde condities te creëren als die worden gezien bij ischemie en letsel bij hogere eukaryoten. De voordelen van deze technieken ten opzichte van bestaande methoden van ischemische reperfusie in geïsoleerde hartcellen zijn dat C. elegans een zeer krachtig genetisch model is en bovendien een transparant organisme is, wat het gebruik van diverse verschillende vloeistoffen en technieken mogelijk maakt. Daarnaast laten we u zien hoe u, in plaats van een dure hypoxie- of omgevingskamer, een zelfgemaakte hypoxie- en omgevingskamer uit het laboratorium kunt gebruiken die slechts enkele dollars kost.Over het algemeen moet iedereen die met deze methode werkt op de hoogte zijn van enkele cruciale punten, zoals het spoelen van de buffers, uiterste zorgvuldigheid bij het scoren van de wormen en het constant houden van de gebruikte temperatuur en de zuurstofhoeveelheid. Al deze factoren kunnen de uitkomst van het experiment beïnvloeden. Om een aangepaste hypoxische kamer te maken, kan een luchtdichte afsluitbare container (type Tupperware) worden omgebouwd tot een anoxische kamer. Kies de kleinst mogelijke container, aangezien een kleine container sneller een hypoxische omgeving creëert en gemakkelijker in het waterbad past.Maak twee gaten in het deksel met een afmeting die geschikt is voor een plastic of metalen connector die op de slang past. Bevestig deze met een watervaste lijm die na droging uithardt om beweging van de connector te voorkomen en zo de kans op lekkage te verkleinen. Als alternatief kan een neopreen ring worden gebruikt om de connector beter af te dichten op de container. Plaats de container in het waterbad zodat deze volledig is ondergedompeld.Om de container onder te dompelen, wordt een flessengewicht of een duikgewicht gebruikt. Een van de buisverbindingen wordt gebruikt om een gasmengsel te introduceren en de andere buis fungeert als drukontlastingsklep.Laat het daarom onder het water staan, zodat de container is afgesloten van de externe omgeving. Om de kweek van c elegance te starten zoals beschreven in het tekstprotocol, bereid dan M nine buffer voor en verwijder de zuurstof door dit 30 minuten vóór het experiment te equilibreren met stikstof en omringd door ijs te bewaren. Maak een klein gaatje in het dopje van 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes waarin de wormen worden geplaatst tijdens de anoxische uithongering.Het gat maakt gasuitwisseling mogelijk zonder dat het deksel open hoeft te blijven, wat zou kunnen leiden tot overmatige verdamping van het medium. Voeg één milliliter zuurstofrijk M9-buffer op kamertemperatuur toe aan elke 35 millimeter plaat met jonge volwassen wormen. Wees voorzichtig om te voorkomen dat er bacteriën van de plaat worden verwijderd.Na ongeveer één minuut zouden de wormen in de M nine moeten zwemmen. Coat vervolgens een pipetteertip van 1 milliliter met bovine serumalbumine of BSA door een steriele 1% BSA-oplossing op te zuigen en weer uit te stoten. Kantel voorzichtig de plaat met de wormen in M nine-buffer en verwijder de M nine op dezelfde plek waar deze is toegevoegd.Plaats de suspensie vervolgens in de voorbereide microcentrifugebuisjes. Laat de monsters in het ijs rusten totdat de wormen naar de bodem van de buisjes zijn gezakt. Verwijder de maximale hoeveelheid M9 die mogelijk is zonder de wormen in de buis te verstoren.Voeg vervolgens één milliliter van het met zuurstof gespoelde en gekoelde M9-buffer toe en plaats de buis op ijs totdat de wormen naar de bodem zakken. Herhaal deze wasstap drie keer. Verwijder bij de laatste wasbeurt de M9-buffer totdat er ongeveer 100 µL in de buis overblijft.Plaats vervolgens de buisjes met de wormen in gedeoxygeneerde M9-buffer in de kamer en sluit de kamer af met het deksel terwijl er een constante stikstofstroom van 100 milliliters per minuut wordt toegevoerd. Plaats de container in een waterbad op 26 °C. Zorg ervoor dat de uitlaatbuis goed in het water is ondergedompeld zodat er geen lucht terugstroomt en dat er geen lekken in het systeem aanwezig zijn.Incubeer de wormen vervolgens 20 uur bij 26 °C. Pipetteer na de incubatie, met een BSA-gecoate tip, de sea elegance op een nematode growth media-plaat van 35 mm. Incubeer de platen 24 uur bij 20 °C. Daarna zijn de wormen klaar om gescoord te worden.Raak met een platinanaald voorzichtig de bovenkant van de kop van de levende worm aan. Wormen zullen achteruit bewegen na aanraking; als de wormen niet reageren, worden ze als dood gescoord. Af en toe zal een worm niet achteruit bewegen, maar mogelijk een lichte zijwaartse beweging van de kop vertonen; hoewel deze wormen technisch gezien niet dood zijn, zullen ze vrijwel zeker binnen enkele uren sterven en moeten ze als dood worden gescoord.Herhaal deze stap 10 tot 15 keer voor elke worm met intervallen van tien seconden. Onderzoek ten minste 10 wormen per groep om nauwkeurige gegevens te verkrijgen voor de visualisatie van neuronale modificaties na anoxie-uithongering. Gebruik een stam die groen fluorescent eiwit of GFP tot expressie brengt in de aanrakingsgevoelige mech-neuronen.Plaats een druppel 2%ARO-oplossing op een glazen objectglas dat is geplaatst tussen twee andere glazen plaatjes die aan de onderzijde zijn voorzien van een enkel stukje plakband. Plaats een laatste glazen plaatje loodrecht op het eerste bovenop de 2%ARO-oplossing en laat dit afkoelen bij kamertemperatuur. Dit moet een laagje vormen met de dikte van het plakband.Verwijder vervolgens het bovenste objectglas en voeg 10 µL M9-buffer toe die 0,1% tetraole bevat, om de wormen te immobiliseren. Verplaats ongeveer 10 levende wormen naar het 2% agarose-objectglas en plaats hier een dekglas overheen. Visualiseer GFP met een fluorescentiemicroscoop onder een 100x objectief met de juiste verlichting.Beschadigde neuronen vertonen in de uitlopers een cytosolisch membraanpatroon in de vorm van een snoer van parels, bestaande uit meerdere puncta en/of abnormaliteiten waarbij de uitlopers gebroken lijken te zijn. Tel de puncta en abnormaliteiten in beide neuronen voor elke worm, gebruikmakend van in totaal ten minste 10 wormen. Het blootstellen van C. elegans aan 20 uur anoxie en uithongering bij 26 °C in een op maat gemaakte laboratorium-incubatiekamer leidde tot significante mortaliteit.De overlevenden reageerden daarnaast slecht op lichte aanraking van de lichaamswand. Vervolgende fluorescentie-imaging van puncta en breuken in de GFP-gelabelde neuronale processen van de overlevenden bevestigde de aanwezigheid van morfologische abnormaliteiten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe ischemie kan worden opgewekt.Een observatie in door het laboratorium gemaakte hypoxische kamers, waarbij u ook in staat zou moeten zijn om sterfte en neuro-modificaties in Caenorhabditis elegans te meten. Dit model is door meerdere groepen gebruikt om te bestuderen hoe natuurlijke ionen uit diverse interventies en het metabolisme de levensduur en sterfte onder hypoxische omstandigheden kunnen beïnvloeden.

an-anoxia-starvation-model-for-ischemiareperfusion-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit document beschrijft hoe u continue-stroom hypoxie kamers te gebruiken om atmosferen met bepaalde concentraties van O...

Het creëren van Defined Gasvormige omgevingen om de gevolgen van hypoxie Studie naar<em&gt; C. elegans</em

Het gebruik van Time lapse microscopie om Anoxie-geïnduceerde Suspended Animation Visualiseer in<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryo&#39;s

Beschrijven we methoden om aspecten van amylopathies in de worm te...

Een<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Model Systeem voor Amylopathy Study

Om de relatie tussen eiwithomeostase, stress en veroudering te bestuderen, hebben we veranderingen in eiwitvouwing gemonitord door eiwitdisfunctie, eiwitlocalisatie in de cel en eiwitstabiliteit op organismisch, cellulair en eiwitniveau te volgen, met behulp van de genetisch hanteerbare metazoa Caenorhabditis elegans als modelsysteem.

Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

Hier beschrijven we de gedetailleerde procedure van intestinale ischemie-reperfusie bij muizen waardoor reproduceerbaar letsel zonder sterfte aan de standaardisatie van deze techniek in het veld bevorderen. Dit model van intestinale ischemie-reperfusieschade kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen van schade en regeneratie te bestuderen.

Muizenmodel van Intestinale ischemie-reperfusie schade

Een muismodel van cerebrale ischemie-reperfusie is gevestigd te onderzoeken de pathofysiologie van een beroerte. We distally de rechts midden cerebrale slagader en rechts gemeenschappelijke halsslagader afbinden en bloedstroom herstellen na 10 of 40 min van ischemie.

Muismodel van twee-schip occlusie van cerebrale ischemie-reperfusie

Hier karakteriseren we cellulaire proteotoxische stressreacties in de nematode C. elegans door het meten van de activering van fluorescerende transcriptieverslaggevers en assaying gevoeligheid voor fysiologische stress.

Metingen van fysiologische stressreacties in C. Elegans

Hier introduceren en beschrijven we op grote schaal toegankelijke methoden met behulp van een aantal veelzijdige nematodemodellen, waaronder hypergeactiveerde ionenkanaalgeïnduceerde necrose en eiwitaggregaat-geïnduceerde neurotoxiciteit, om de cellulaire en moleculaire onderbouwing van leeftijdsgerelateerde neurodegeneratieve ziekten te monitoren en te ontleden.

Modellering van leeftijdsgegende neurodegeneratieve ziekten bij Caenorhabditis elegans

Imaging C. elegans Embryo&#39;s met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

Het gemak van het behoud en het uitdragen van de...

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Leer een anoxie/verhongeringsmodel voor ischemie/reperfusie in C. elegans. Deze methode maakt het mogelijk om neuronale schade en gedragsveranderingen te evalueren met fluorescentiemicroscopie.

Een Anoxia-verhongering Model voor ischemie / reperfusie in

Meer video's verkennen