Name: Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Leer een methode voor tijdelijke genexpressie in Nicotiana benthamiana met Gibson assembly en een genkanon. Deze techniek richt zich op chloroplasten en peroxisomen zonder restrictie-enzymen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Jen Sheen van het Massachusetts General Hospital bedanken voor de gulle donatie van Nicotiana benthamiana zaailingen. Jen Bush hielp ons sterk in advies op het kweken van planten en het opzetten van een kweekkamer gebied. Tom Ferrante van de Wyss Institute aangeboden cruciale hulp bij confocale microscopie. De auteurs willen het vooral leuk om Don Ingber van Children&#39;s Hospital Boston en de Wyss Instituut voor de gulle donatie van een Gene Gun en bijbehorende supplies bedanken. De financiering voor dit project werd verstrekt door middel van een samenwerkingsovereenkomst met het ministerie van Energie Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000079) voor PAS, JCW, en Dokters van de Wereld, en door Chimerion Biotechnology, Inc voor MJV.

1. Ontwerp van alternatief-gesplitst Sequences voor Multiple Organel Targeting <ol><li> Bepaal de locaties voor uiteindelijke eiwitexpressie. Voor dit werk, de rente is de gerichtheid op de chloroplasten, peroxisomen, en cytosol. </li><li> Gebruik de literatuur om eiwitten en DNA-sequenties bekend om proteïnen te richten op organellen van belang vast te stellen. In dit geval een chloroplast-gerichte sequentie van Arabidopsis thaliana L-isoaspartate methyltransferase 6,15 en een peroxisoom targeting sequentie van Arabidopsis thaliana transthyretine-als S-allantoïne synthase 16,17 bepaald. </li><li> Identificeer een-alternatieve splicing regime dat de eiwitten van belang moet richten op de juiste organellen. Voor dit werk, splicingplaatsen zoals waargenomen in een natuurlijke Arabidopsis systeem 6. De mRNA-sequentie werd herontworpen nalatende het natuurlijk splice sites, maar sequenties werden geplaatst codering chloroplast-of peroxisomenome-targeting-tags binnen het alternatief-splicing introns (figuur 1). </li></ol> 2. Gibson Vergadering van DNA Parts Zie ook figuur 2. De Gibson montagemethode is afhankelijk van de werking van verschillende enzymen in een vooraf gemaakte mengsel 1) gedeeltelijk verteren de uiteinden van het dubbelstrengs DNA met enkelvoudige strengen en 2) gloeien gratis basenparen van DNA naburige onderdelen. Dit maakt klonering van DNA-fragmenten niet de specifieke restrictieplaatsen. <ol><li> Kies een volgorde van de elementen in het DNA-plasmide-construct. Als voorbeeld TriTag-1 heeft elementen: a) een plasmide vector (porie met een GFP-construct bekend te werken in planten, een kanamycine resistentie merker, en oorsprong van replicatie voor E. coli en Agrobacterium tumefaciens systemen), b) een promotersequentie (P ENTCUP2 getoond constitutief te zijn in planten), C) een chloroplast-gerichte sequentie (CTS), c) een peroxisoom targeting sequentie (PTS), en d) een aantal splitsingsplaatsen zoals eerder beschreven 6. </li><li> Ontwerpen van het construct base-voor-base met in silico ontwerpsoftware. ApE is een open source freeware pakket nuttig is voor dit werk. Opmerking: TriTag-1, heeft de volgorde: plasmidevector, promoter, ATG, splitsingdonorplaats, chloroplast doelsequentie splitsingdonorplaats, neutraal site splice acceptor site peroxisoom doelsequentie, splice acceptor site GFP vervat in plasmidevector . <ol><li> Het ontwerp van de in silico DNA-construct, zodanig dat er een 50-bp overlap tussen de stukken bij het ​​bestellen van primers voor PCR. Het is mogelijk om de 50 bp overlap als primers gebruikt: 25 bp beide richtingen. <ol><li> Zorg ervoor dat u bij te houden van de oorsprong van elk van de reeks stukken. Is als: een plasmide worden gekweekt en miniprepped; een lineaire reeks die kan worden gebruikt als PCR-matrijs; of een sequentie die zal moeten wordencommercieel gesynthetiseerd? Verschillende bedrijven bieden goedkope DNA-synthese diensten voor fragmenten &lt;500 bp. In dit geval, de TriTag zelf is 437 bp dus het voordelig het commercieel bestellen. </li><li> De beste resultaten komen als alle fragmenten PCR-geamplificeerd en gezuiverd uit de matrijs DNA. De weerstand marker is een goede plek om deze grote DNA te splitsen in twee kleinere sjablonen die gemakkelijker PCR-versterkt zijn. </li><li> Restrictie restrictie-enzymen DpnI knipt gemethyleerd DNA. Als de PCR-matrijs was een miniprep van E. coli, zal DpnI behandeling de verontreinigende template DNA te verwijderen. </li></ol></li></ol></li><li> Zuiveren van alle DNA-sequenties apart en elueren in water, TE of Buffer EB. <ol><li> Pore ​​vector deel 1, ~ 3000 bp (groene pijlen). PCR geamplificeerd en Dpnl behandeld. </li><li> Pore ​​vector deel 2, ~ 3000 bp (zwarte pijlen). PCR geamplificeerd en Dpnl behandeld. </li><li> TriTag insert, 437 bp (blauwe pijlen). Commercieel besteld. Resuspend in DDH 2 O. </li><li> P ENTCUP promotor, ~ 750 bp (oranje pijlen). PCR-geamplificeerd en Dpnl behandeld. </li></ol></li><li> Meet de concentratie van elk van de DNA delen. Streven naar 150 ng / ul van de vector stukken. </li><li> Neem een ​​hoeveelheid van de Gibson assemblage mix uit de vriezer en ontdooien op ijs. Dit is in de handel verkrijgbaar, maar ook eenvoudig te maken in het lab 12-14. <ol><li> Er zijn twee stappen om dit recept: een stroperige 5x master mix en 15 ul reactie-formaat 1,33 x porties. De 5x master mix bevat: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 ul 1 M MgCl2, 600 pi 10 mM van elk dNTP, 300 ul 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000, 20 mg NAD, en DDH 2 O 6 ml. Bereid 320 ul aliquots (18) en vries na alle bij -20 ° C. De oplossing zal heel viskeus. Label deze &quot;5X isotherm buffer&quot; </li><li> Aan de ene resterende (320 pl), voeg 1,2 pl T5 Exonuclease, 20 pl Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, 160 ul Taq DNA Ligase en 700 ul DDH 2 O. Bereid 15 pi aliquots (~ 80) op ijs in PCR buizen en bewaar bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Bepaal volumes equimolaire hoeveelheden van elk van de fragmenten. Er zijn een paar online calculators, waaronder Gibthon.org. Er moet een totaal van 5 ul van de DNA delen worden. Voeg ze toe aan de 15 ul Gibson mix aliquot. Indien vereist volumes te klein om pipet verdunnen DNA fragmenten en / of gebruiken meer dan een aliquot. <ol><li> Vergeet niet om een controle van de vector DNA alleen voor te bereiden (bijvoorbeeld het DNA-deel dat de resistentie tegen antibiotica marker) en vul aan met water. </li></ol></li><li> Incubeer de buizen in een thermische cycler bij 50-55 ° C gedurende 30-60 minuten. Vervang op ijs en transformeren in E. coli via warmte-shock chemisch competente cellen. Gebruik geen elektrocompetente cellen. De hoge zoutconcentratie en de relatief lage DNA concentratiekan de cellen boog. <ol><li> Breng alle 20 ul van een commerciële bereiding van 200 pl calciumchloride competent E. coli. Incubeer op ijs 30 min en hitteschok 60 sec bij 42 ° C </li><li> Terug naar ijs 2 minuten, de 750 pi SOC of LB-medium en terug te schudden in een microcentrifugebuis 30 minuten bij 37 ° C. Plaat van het mengsel en geschikte verdunningen op LB + Kan (of andere geschikte antibiotica). Dit kan resulteren in hogere achtergrond (en een hoger aantal niet-doelwit recombinatie) dan traditionele-ligatie gebaseerde klonen maar verdient het aanbeveling scherm ongeveer 10 kolonies. </li></ol></li><li> Bevestig kloon via sequentie en slaan een monster bij -80 ° C </li></ol> 3. Biolistische Transfectie van tabak met de Gene Gun Dit is een techniek die wordt opgericht in Jupiter 18,19. De belangrijkste stappen en verschillen worden hierna beschreven. <ol><li> Groeien 50-100 ml E. coli of 200 ml Agrobacterium. Maxi-prep de cultuur. Een concentratie van ongeveer 1500 ng / ul moet gaan. </li><li> Bereid gen kogels zoals eerder beschreven. Plaats ze in de Gene Gun. </li><li> Voor transfectie van Nicotiana benthamiana tabaksblad epidermale weefsel, kiest een groot blad dicht bij de basis van een 3 maanden oude plant. Snijd het zorgvuldig en leg het ondersteboven neer op nat papier handdoeken in een 15 cm petrischaal. </li><li> Stel de He druk voor de Gene Gun 200-250 psi. </li><li> Doel voorzichtig Gene Gun tussen ribben op de onderzijde van een blad, ongeveer 3-5 cm erboven. Laat de veiligheid en leveren de deeltjes aan het blad. Elke kogel kan tweemaal worden gebruikt op dezelfde plaats op het blad. Als het blad explodeert, weggooien en een nieuw blad-er enige variatie in blad taaiheid door groeiomstandigheden zoals leeftijd, vocht, enz. Voor een 12-cm blad verwachten ongeveer 6 opnamen passen. </li><li> Sla het blad, bedekt met de bovenkant van eenPetrischaal voor 2-3 dagen bij weinig licht op de bank. </li><li> Onderzoek het blad in een dissectiemicroscoop uitgerust met UV-fluorescentie, en zoeken naar individuele cellen die GFP. Ontleden 5-10 mm delen van blad. </li><li> Dompel het blad in een diepe put microscoop dia onder ~ 200 ul 0,1% Triton X-100. Het wasmiddel voorkomt luchtbellen vormen op het oppervlak, en deepwell objectglaasje maakt een groter weefsel beeldgebied. </li></ol> 4. Confocale microscopie van Getransfecteerde Tissue Deze instructies variëren voor elk instrument, dus is het essentieel om goed getraind. <ol><li> Voor fluorescentie detectie experimenten, stelt de excitatie laser 489 nm, en stel de photomultiplier detectoren 500-569 nm voor GFP-fluorescentie en 630-700 nm voor chlorofyl auto-fluorescentie. Afbeelding cellen met behulp van een 40x water-immersie objectief. </li></ol>

<ol><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trait+stacking+in+transgenic+crops%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22GM+crops%22%5BJournal%5D)">Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities.</a> GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).</li>
<li>Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+plant+splicing+code%3A+experimental+and+computational+approaches+for+predicting+alternative+splicing+and+splicing+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).</li>
<li>Hickey, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene+regulation+in+plants+by+alternative+splicing+of+a+suicide+exon%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).</li>
<li>Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+in+plants+-+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing in plants - coming of age.</a> Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).</li>
<li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).</li>
<li>Dinkins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+transcriptional+initiation+sites+and+alternative+5%27-+and+3%27-splice+site+selection+of+the+first+intron+deploys+Arabidopsis+protein+isoaspartyl+methyltransferase2+variants+to+different+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+for+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).</li>
<li>Kebeish, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplastic+photorespiratory+bypass+increases+photosynthesis+and+biomass+production+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).</li>
<li>Maier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Introduction+of+a+Glycolate+Oxidative+Cycle+into+A.+thaliana+Chloroplasts+Leads+to+Growth+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+the+isoprenoid+pathway+in+tobacco+by+expressing+the+cytoplasmic+mevalonate+pathway+in+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts.</a> Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).</li>
<li>Sapir-Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+localization+of+Arabidopsis+isopentenyl+diphosphate+isomerases+suggests+that+part+of+the+plant+isoprenoid+mevalonic+acid+pathway+is+compartmentalized+to+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).</li>
<li>Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+heterologous+protein+to+multiple+plant+organelles+via+rationally+designed+5%27+mRNA+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags.</a> Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl%2FD-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li>
<li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+a+camel+through+the+eye+of+a+needle%3A+the+import+of+folded+proteins+by+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).</li>
<li>Reumann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Arabidopsis+leaf+peroxisomes+reveals+novel+targeting+peptides%2C+metabolic+pathways%2C+and+defense+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms.</a> The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+Fluorescence+Complementation+%28BiFC%29+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li>
<li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie worden eenvoudige strategieën beschreven voor het lokaliseren van een transgeen eiwit meerdere cellulaire compartimenten in planten. Het doel was construct dat een gen tot expressie zou meer dan een organel in Nicotiana benthamiana ontwerpen. Strategieën omvatten rationeel ontwerp van GFP-gebaseerde DNA-constructen, Gibson montage, levering van de plasmiden te bladcellen met de Gene Gun, en observatie van de resultaten met confocale microscopie. Drie verschillende kor...

Dit werk is een metabole engineering / synthetische biologie project waarin plantencellen zijn ontworpen om een ​​reporter eiwit tot expressie in meerdere organellen, maar met slechts een enkele DNA-construct. Een benadering om eiwitten te richten op meerdere locaties omvat klonen meerdere genetische kopieën, die elk een andere lokalisatie peptide. Elk exemplaar moet worden ingevoerd door de opeenvolgende retransformation, of als alternatief, door terugkruisen enkele transformaties 1. Dit houdt extra klonen, en wordt beperkt door een lokalisatie tag per eindpunt. Een andere manier om een proteïne te lokaliseren op meerdere locaties is door alternatieve splicing 2-5. RNA wordt getranscribeerd vanaf een enkel gen, maar verschillende exemplaren van het transcript verschillend verwerkt, vaak meer dan een manier per cel. Dit kan leiden tot meer dan een boodschapper-RNA in de cel getranscribeerd uit een gen. Deze verschillende messenger RNA kan coderen voor verschillende isovormen van hetzelfde eiwit of in het geval van een frameshift, een ander eiwit helemaal. Hoewel alternatieve splicing is in de literatuur beschreven voor vele jaren, de werkingsmechanismen en geconserveerde donor en receptor splice sites worden alleen wordt meer recent opgehelderd 6. Omdat deze sites worden beter beschreven, zij schept kansen voor engineering. Plant metabole ingenieurs staan ​​voor een uitdaging bij een eiwit tot expressie in meerdere organellen. Voor een eiwit dat moet worden gelokaliseerd meerdere organel, moet de technicus hetzelfde gen klonen meerdere malen, elk met een aparte signaalsequentie richten aan het organel plaats. Voor een enkel gen in drie organellen, dit gewoon drie genen. Maar voor een zes-gen metabole route, dit uitgebreid tot 18 genen, een aanzienlijke inspanning klonen. Combineren van meerdere lokalisatie sequenties in een enkele, alternatief-gesplitste gen tekenificantly vermindert deze inspanning. Bijvoorbeeld, re-engineering fotorespiratie 7,8 en isoprenoide synthese 9,10 omvat zowel de chloroplasten en peroxisomen. In ons geval hebben we geprofiteerd van spliceplaatsen zoals waargenomen in een natuurlijke Arabidopsis thaliana systeem eerder beschreven 6. We rationeel herontworpen de mRNA-sequentie alleen achter de natuurlijke splitsingsplaatsen, maar geplaatst sequenties die chloroplast-of peroxisoom targeting markeringen zouden coderen in de alternatieve splicing introns (Figuur 1). Het tot expressie gebrachte eiwit kan al dan niet een label, naargelang de pre-mRNA dat gecodeerd werd uitgesneden als een intron (figuren 1g en 1h). Voor meer informatie over het ontwerp van de constructies die in dit werk, zie het begeleidend artikel 11. Omdat dit nog steeds een aanzienlijke inspanning klonen, Gibson samenstel, een nieuwe methode voor het kloneren van DNA-constructen, is used in de bouw. De Gibson werkwijze kan worden gebruikt voor elke sequentie, ongeacht restrictieplaatsen (figuur 2) 12-14. De specifieke combinatie van enzymen maakt een stap isotherm montage. Bij deze werkwijze worden meerdere dubbelstrengs lineaire DNA delen, dat zij overlappende sequenties van ~ 50 bp gemaakt. De Gibson assemblage enzym mix gedeeltelijk verteert het lineair DNA delen, het blootstellen van enkele strengen van homologe sequenties. Deze gedeeltelijke enkelstrengs sequenties worden opnieuw gegloeid in het reactiemengsel, waardoor een snelle, een-stap sequentie-onafhankelijke ligatie vrij subklonering reactie. Dit werk beschrijft 1) rationeel ontwerp alternatief verbonden constructen voor expressie in planten chloroplasten, peroxisomen, en cytosols, 2) hun klonen met behulp van de nieuwe-ligatie vrije methode van Gibson assemblage, 3) de levering ervan in tabaksbladeren cellen met de Gene Gun, en 4) resultaten tonen organel targeting, zoals waargenomen met GFPen confocale microscopie.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotide primers</td><td>IDT</td><td>(custom)</td><td>Design specifically voor construct</td></tr><tr><td>GeneBlocks</td><td>IDT</td><td>(custom)</td><td>500 bp oligonucleotiden</td></tr><tr><td>ApE software</td><td>U Utah</td><td>(download)</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td></tr><tr><td>MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Gebruikt om PCR-producten te zuiveren</td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Gebruikt om kloning-geschikte hoeveelheden plasmide voor te bereiden</td></tr><tr><td>Phusion Master Mix met GC Buffer</td><td>NEB</td><td>M0532S</td><td>Gebruikt om het gen van belang te PCR-amplificeren</td></tr><tr><td>Gibson assembly reactiemix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Mastermix van de volgende 9 ingrediënten</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH7.5</td><td>Teknova</td><td>T1075</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>G Biosiences</td><td>82023-086</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Fermentas</td><td>R0192</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>1 M DTT</td><td>Fermentas</td><td>R0861</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Affymetrix</td><td>19966</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Applichem</td><td>A1124,0005</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>T5 exonuclease</td><td>Epicentre</td><td>T5E4111K</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>Phusion polymerase</td><td>NEB</td><td>F530S</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>Taq DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0208L</td><td>Gibson assembly mix</td></tr><tr><td>Gibthon.org</td><td></td><td></td><td>Website om berekeningen te vereenvoudigen</td></tr><tr><td>Plasmid PLUS Maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td>Gebruikt om DNA voor gene gun kogels voor te bereiden</td></tr><tr><td>Gene Gun systeem</td><td>BioRad</td><td>165-2451</td><td>Bevat alle noodzakelijke onderdelen</td></tr><tr><td>Nicotania benthamiana</td><td>(n/a)</td><td>(n/a)</td><td>Gift van Jen Sheen, MGH</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Leica</td><td>SP5 X MP</td><td>Beeldvorming van resulterende cellen</td></tr><tr><td>Deep well slides</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71561-01</td><td>Gebruikt voor confocale beeldvorming</td></tr><tr><td>A Plasmid Editor (ApE) </td><td>University of Utah </td><td></td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td></tr><tr><td>Gibthon:Ligation calculator</td><td></td><td></td><td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td></tr></tbody></table>

voorbijgaande gene expression tobacco gebruik gibson vergadering en de gene gun

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Om een ​​enkel eiwit op meerdere subcellulaire organellen richten, planten typisch dupliceren de relevante genen, en een automatische elk gen afzonderlijk met behulp van complexe regulerende strategieën, inclusief differentiële promotors en / of signaal sequenties. Metabole ingenieurs en synthetische biologen vindt het richten enzymen een bepaalde organel staan ​​voor een uitdaging voor een eiwit dat moet worden gelokaliseerd in meer dan een organel, moet de technicus hetzelfde gen klonen meerdere keren. Dit werk brengt een oplossing voor deze strategie: evaluatie van alternatieve splitsing van mRNA. Deze technologie maakt gebruik van gevestigde chloroplast en peroxisoom targeting sequenties en combineert ze tot een enkel mRNA dat alternatieve wijze wordt gesplitst. Sommige splice varianten naar de chloroplast, wat het peroxisoom en genen tot het cytosol. Hier het systeem is ontworpen voor meerdere organel richt met alternatieve splicing. In dit werk werd GFP verwacht expr zijnEssed in de chloroplast, cytosol en peroxisomen door een reeks van rationeel ontworpen 5 &#39;mRNA tags. Deze tags hebben het potentieel om de hoeveelheid klonen vereist wanneer heterologe genen moeten worden uitgedrukt in verschillende subcellulaire organellen verminderen. De constructen werden ontworpen eerder werk 11 en werden gekloneerd middels Gibson samenstel, een ligatie onafhankelijke klonen methode die restrictie-enzymen vereist. De resulterende plasmiden werden geïntroduceerd in Nicotiana benthamiana epidermale blad cellen met een gemodificeerd Gene Gun protocol. Tenslotte werden getransformeerd bladeren waargenomen met confocale microscopie.

Het ontwerp inspanning was een gevolg van aanzienlijke planning. Novel dit project is het gebruik van alternatieve splicing van een pre-mRNA dat vertaald in differentieel tot expressie gebrachte eiwitten te creëren. Deze eiwitten worden uitgedrukt in verschillende organellen, in dit geval de chloroplast, peroxisoom en / of cytosol. Wij aangepast natuurlijke Arabidopsis gen dat alternatieve wijze wordt gesplitst 6 en geplaatste bekende chloroplast 6 en peroxisoom 17 targeting seq...

Dit werk beschrijft een nieuwe werkwijze voor het selectief richten subcellulaire organellen in planten, bepaald met de BioRad Gene Gun.

Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de transiënte genexpressie van een GFP-gelabelde reporter in epidermale cellen van tabaksbladeren waar te nemen. Dit wordt bereikt door eerst een DNA-construct te ontwerpen dat tot expressie zal komen in de chloroplasten en peroxisomen. Het construct wordt vervolgens gebouwd met behulp van PCR-amplificatie en Gibson-assemblage.Vervolgens wordt een genenpistool gebruikt om het construct af te leveren in epidermale cellen van tabaksbladeren. Uiteindelijk laat beeldvorming van het tabaksblad via confocale microscopie GFP-expressie zien in de chloroplast en het peroxisoom. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals klassiek kloneren, is dat er geen restrictie-enzymen nodig zijn, waardoor elke sequentie die via PCR kan worden geamplificeerd, kan worden gekloond.Vanwege de flexibiliteit van het genetische ontwerp strekken de toepassingen van deze technieken zich uit naar een grotere schaal. Genetische modificatie van landbouwgewassen. Begin dit protocol door de locaties binnen de plantencel voor de uiteindelijke eiwitexpressie te bepalen. Voor dit werk is het doel om de expressie te richten op de chloroplast, het peroxisoom en het cytosol.Ontwerp vervolgens het expressieconstruct. Het construct moet een promotor, een detecteerbaar gen en een terminator bevatten binnen één enkel plasmide. In dit geval stuurt de constitutieve promotor P end cup twee de expressie van GFP aan, gevolgd door de Nolene Synthe-terminator of nos t.Let op dat we in dit experiment een reeks trit-tags (één, twee en drie) zullen testen, die aan het C-terminus van GFP zijn gekoppeld voor expressie in chloroplasten en peroxisomen. De Gibson assembly-methode is afhankelijk van de werking van verschillende enzymen in een kant-en-klare mix om de uiteinden van dubbelstrengs DNA gedeeltelijk te verteren en het annealen van complementaire basenparen van naburige DNA-sequenties te vergemakkelijken. Het uiteindelijke construct bestaat uit drie delen die in vier PCR-reacties geamplificeerd moeten worden voorafgaand aan de Gibson assembly.De eerste en tweede reacties amplificeren een plasmidevector van 8.000 basenparen, PORE, die GFP NOS T en een cany-resistentiemarker bevat. De resistentiemarker is een geschikte plek om dit grote DNA te verdelen in twee kleinere templates die gemakkelijker via PCR te amplificeren zijn. De derde reactie amplificeert de promotor P end cup twee, en de vierde reactie amplificeert triag één met behulp van in silico designsoftware zoals ape design, waarbij de constructie base voor base is ontworpen, zodanig dat er een overlap van 50 basenparen tussen elk fragment is.Bij het bestellen van primers voor PCR is het mogelijk om de overlap van 50 basenparen te gebruiken als primers van telkens 25 basenparen per richting. Nadat de PCR is uitgevoerd om elk component te amplificeren, dient het PCR-product afzonderlijk te worden gezuiverd en te worden verdund in gedestilleerd gedeïoniseerd water. Indien het PCR-template een miniprep van e coli was, zal behandeling met het restrictie-enzym DPN het contaminerende template-DNA verwijderen. Meet vervolgens de concentraties van elk van de DNA-fragmenten.Stel de vectorkoncentratie in op ongeveer 150 nanogram per microliter voor elk te assembleren construct, inclusief een controle, neem een aliquot van 15 microliter van de Gibson Assembly-mix uit de vriezer en ontdooi deze op ijs. Bepaal met behulp van de open-source online tool @gibbon. org de volumes voor equimolaire hoeveelheden van elk van de fragmenten.Voeg het berekende volume van elk van de fragmenten toe aan de 15 microliter Gibson-mix. Bereid daarnaast een controle voor met enkel het vector-DNA. Het totale volume van elke reactie moet 20 microliters zijn.Gebruik water om het volume aan te passen indien nodig. Incubeer de buisjes gedurende 30 tot 60 minuten bij 50 tot 55 °C. Plaats de buisjes na de incubatie terug op ijs.Haal een microcentrifugebuisje met een commerciële preparatie van 200 µL calciumchloride-competente E. coli uit een vriezer van -80 °C en warm deze licht op in de hand. Voeg vervolgens alle 20 µL van de reactie toe aan de E. coli. Incubeer de culturen 30 minuten op ijs, breng ze daarna over naar een waterbad van 42 °C en voer een hitte-shock uit gedurende 60 seconden.Gebruik geen elektrocompetente cellen. De relatief hoge zoutconcentratie en lage DNA-concentratie kunnen ervoor zorgen dat de cellen na transformatie overspringen. Plaats de culturen twee minuten terug op ijs, voeg vervolgens 750 µL SOC- of LB-medium toe en laat ze 30 minuten herstellen bij 37 °C.Plat daarna het mengsel uit op LB-platen met kanamycin of een ander geschikt antibioticum en incubeer deze gedurende één nacht bij 37 °C; screen vervolgens 10 kolonies via sequencing. Houd er rekening mee dat deze methode kan leiden tot een hogere achtergrond en een groter aantal niet-doelgerichte recombinatiegebeurtenissen dan traditionele ligatiegebaseerde klonering. De biotische transfectie van tabak met een genenpistool is eerder beschreven in JoVE.Hier worden de belangrijkste stappen en verschillen met betrekking tot eerdere protocollen besproken. Na het amplificeren en isoleren van de constructen, worden de gene gun bullets voorbereid zoals beschreven in het JoVE-artikel van woods en zeto en in de gene gun geladen voor transfectie van epidermaal weefsel van het blad van Nico Tania Benham Miana tabak. Kies een groot blad dicht bij de basis van een drie tot vijf maanden oude plant.Plaats het met de onderzijde naar boven op natte papieren handdoeken in een Petri-schaal van 15 centimeter, terwijl u geschikte oog- en gehoorbescherming draagt. Stel de heliumdruk van het genenkanon in op 200 tot 250 PSI. Richt het genenkanon voorzichtig tussen de nerven op de onderzijde van een blad, ongeveer drie tot vijf centimeter erboven. Ontgrendel de beveiliging en breng de partikels aan op het blad.Gebruik elk kogelvormig onderdeel twee keer op dezelfde plek op het blad. Verplaats naar een andere locatie en herhaal het proces als het blad openscheurt; gooi dit blad dan weg en begin met een nieuw blad. Er is enige variatie in de stevigheid van het blad als gevolg van groeicondities zoals leeftijd, vochtigheid, enzovoort.Nadat alle injecties zijn voltooid, wordt het blad afgedekt en twee tot drie dagen op de werkbank bij weinig licht bewaard. Onderzoek het blad met een dissectiemicroscoop die is uitgerust met UV-fluorescentie en zoek naar individuele cellen die GFP tot expressie brengen. Wanneer cellen worden gevonden die GFP tot expressie brengen, worden met een dissectieschaar voorzichtig secties van 5 tot 10 millimeter uit het blad verwijderd.Dompel elk individueel bladfragment onmiddellijk onder in de put van een diepe put microscopische glasplaat die ongeveer 200 µL 0,1% Triton X 100 bevat. Het detergent helpt te voorkomen dat er luchtbellen op het oppervlak ontstaan en de diepe put microscopische glasplaat maakt het mogelijk om een groter weefselbeeldingsgebied van cellen af te beelden met een confocale microscoop uitgerust met de juiste filters en een 40 x waterimmersie-objectief. In deze studie werden de drie verschillende GFP-organel-targetconstructen vergeleken met niet-getagde GFP en rubis.Coag.GFP-confocale microscopie werd gebruikt om GFP-fluorescentie aan te tonen in transient getransformeerde enkelvoudige cellen in controle-experimenten waarin niet-getagd GFP werd tot expressie gebracht. Fluorescentie is uitsluitend waarneembaar in de nucleus en het cytosol, maar niet in de chloroplast, die worden geïdentificeerd door de rode autofluorescentie van chlorofyl, zoals te zien is in dit voorbeeld van een cel getransfecteerd met een chloroplast-specifieke Rubis Oag. Het GFP-construct GFP werd tot expressie gebracht in de grote organellen.De cel is wit omlijnd. Het geel geeft gebieden aan van colokalisatie van het construct met chlorofyl, wat aangeeft dat het construct naar de chloroplast is gericht, zoals te zien is in deze afbeelding van een met triag één getransfecteerde cel; GFP-expressie is zichtbaar in de chloroplast, de periferie, het cytosol en kleine punctate organellen die waarschijnlijk peroxisomen zijn. Evenzo brengen met triag twee getransfecteerde cellen GFP tot expressie in de chloroplast, het cytosol en de peroxisomen; triag drie, dat bestaat uit een peroxisoomsignaal ingebed in een regio met lage complexiteit van de chloroplastsequentie, lokaliseerde uitsluitend in de chloroplast en het peroxisoom.Let op dat deze cel zich in een andere bladlaag bevindt. Deze figuur vat de expressie samen die waargenomen is in de compartimenten van een typische epidermale cel van een tabaksblad. De relatieve grootte en locaties binnen de cel worden getoond, evenals de relatieve expressieniveaus die zijn waargenomen via gene gun transfectie en confocale microscopie.Let op dat het niet-getagde GFP lokaliseert in het cytosol en de nucleus, de PIMT twee GFP-controle lokaliseert in de chloroplast en triag één GFP, triag twee GFP en Triag 3G FP lokaliseren in de chloroplast en het peroxisoom, zoals voorspeld. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een plasmide construeert met Gibson-assemblage, dit ballistisch aflevert in tabaksbladeren en GFP-expressie binnen drie dagen observeert. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat 150 ng/µL vector-DNA wordt gebruikt voor de Gibson-assemblage, en 1500 ng/µL van uw uiteindelijke DNA-construct om de gene gun-projectielen te maken. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals agrobacterium-transfectie, worden uitgevoerd om stabiele genexpressie te verkrijgen in plaats van transiënte expressie.

transient-gene-expression-tobacco-using-gibson-assembly-gene

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Beschrijving van een virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) methode voor de knock-down van genexpressie...

Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat

Planten bieden een nieuw systeem voor de productie van farmaceutische eiwitten op commerciële schaal die is beter schaalbaar, kostenefficiënte en veilige dan de huidige expressie paradigma. In deze studie, rapporteren we een eenvoudig en handig, toch schaalbare aanpak van target-gen-bevattende...

Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

Virus-geïnduceerde gene silencing is een nuttig hulpmiddel voor het identificeren van genen betrokken bij nonhost resistentie van planten. We demonstreren het gebruik van bacteriële pathogenen tot expressie GFPuv het identificeren gen zwijgen planten vatbaar voor nonhost pathogenen. Deze benadering is eenvoudig, snel en faciliteert grootschalige screening en soortgelijk protocol kan worden toegepast op het bestuderen van verschillende andere planten-microbe interacties.

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening voor de identificatie van genen betrokken bij Nonhost Resistance

Voorbijgaande eiwitproductie in Nicotiana planten op basis van vacuüm infiltratie met Agrobacteriën uitvoeren lancering vectoren (tabak mozaïek virus-based) is een snelle en economische benadering van vaccin antigenen en therapeutische eiwitten te produceren. We vereenvoudigde de procedure en verbeterd doel accumulatie door het optimaliseren van de voorwaarden van bacteriën kweken, selecteren gastheer soorten, en co-introduceren van RNA-silencing onderdrukkers.

Optimalisatie en het gebruik van<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Gemedieerde Transient eiwitproductie in<em&gt; Nicotiana</em

We beschrijven een experimenteel ontwerp aanpak die kan worden bepaald en modelleren invloed van transgene regulerende elementen plantengroei en ontwikkeling parameters en incubatieomstandigheden de tijdelijke expressie van monoklonale antilichamen en reporter eiwitten in planten.

Karakterisering van complexe systemen met behulp van de Design of Experiments Aanpak: Transient Eiwitexpressie in tabak als een case study

Tabaksplanten werden gebruikt om een ​​schimmel cellulase, TrCel5A produceren via een tijdelijk expressiesysteem. De uitdrukking zou kunnen worden gecontroleerd met behulp van een fluorescerende fusie-eiwit, en het eiwit activiteit werd gekenmerkt post-expressie.

Expressie van recombinant Cellulase Cel5A uit<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In tabaksplanten

De synthese van aangepaste plasmiden is arbeidsintensief en tijdrovend. Dit protocol beschrijft het gebruik van Gibson-assemblage-klonering om de werk en duur van de procedure voor aangepaste DNA-klonering te verminderen. Het beschreven protocol produceert ook betrouwbare getagde eiwitconstructies voor zoogdierexpressie tegen vergelijkbare kosten als de traditionele cut-and-paste DNA-klonering.

Generatie van plasmide vectoren die-FLAG tagged eiwitten onder de verordening van de Mens elongatiefactor-1α Promoter Met behulp van Gibson Vergadering

In deze studie werd de expressie van een doelgerichte humane recombinante eiwit in verschillende productieplatforms vergeleken. We concentreerden ons op traditionele fermentor-gebaseerde culturen en op planten, waarbij we de instelling van elk systeem beschreven en, op basis van de gerapporteerde resultaten, de inherente grenzen en voordelen voor elk platform benadrukten.

Een vergelijkende analyse van recombinant eiwit expressie in verschillende biofactories: Bacteriën, Insect Cells and Plant Systems

Op subcellulair niveau worden signaleringsgebeurtenissen dynamisch gemoduleerd door ontwikkelings- en omgevingssignalen. Hier beschrijven we een protocol dat het tabaks-transiente expressiesysteem gebruikt om dynamische eiwit-eiwitinteracties te monitoren en om de ruimtelijke organisatie van signaaltransductie in plantencellen bekend te maken.

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

Met behulp van een pBIBAC-GW binaire vector maakt genereren van transgene planten met intact single-kopie invoegingen, een eenvoudig proces. Hier is een reeks van protocollen die leiden de lezer door het proces van het genereren van transgene planten van Arabidopsis en testen van de planten voor INTACTHEID en aantal kopieën van de inserts gepresenteerd.

Genereren van transgene planten met Single-kopie invoegen met behulp van de binaire Vector BIBAC-GW

Voorbijgaande heterologe expressie van biosynthetic enzymen in Nicotiana benthamiana bladeren kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe producten van hoogwaardige triterpene. Hierin is beschreven van een gedetailleerd protocol voor snelle (5 dagen) preparative-schaal productie van triterpenen en analogen met behulp van dit krachtige plantaardige platform.

Voorbijgaande expressie in Nicotiana Benthamiana verlaat voor de productie van de Triterpene op een voorbereidende schaal

Leer een methode voor tijdelijke genexpressie in Nicotiana benthamiana met Gibson assembly en een genkanon. Deze techniek richt zich op chloroplasten en peroxisomen zonder restrictie-enzymen.

Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun

Meer video's verkennen