Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun

Het algemene doel van het volgende experiment is om de transiënte genexpressie van een GFP-gelabelde reporter in epidermale cellen van tabaksbladeren waar te nemen. Dit wordt bereikt door eerst een DNA-construct te ontwerpen dat tot expressie zal komen in de chloroplasten en peroxisomen. Het construct wordt vervolgens gebouwd met behulp van PCR-amplificatie en Gibson-assemblage.

Vervolgens wordt een genenpistool gebruikt om het construct af te leveren in epidermale cellen van tabaksbladeren. Uiteindelijk laat beeldvorming van het tabaksblad via confocale microscopie GFP-expressie zien in de chloroplast en het peroxisoom. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals klassiek kloneren, is dat er geen restrictie-enzymen nodig zijn, waardoor elke sequentie die via PCR kan worden geamplificeerd, kan worden gekloond.

Vanwege de flexibiliteit van het genetische ontwerp strekken de toepassingen van deze technieken zich uit naar een grotere schaal. Genetische modificatie van landbouwgewassen. Begin dit protocol door de locaties binnen de plantencel voor de uiteindelijke eiwitexpressie te bepalen. Voor dit werk is het doel om de expressie te richten op de chloroplast, het peroxisoom en het cytosol.

Ontwerp vervolgens het expressieconstruct. Het construct moet een promotor, een detecteerbaar gen en een terminator bevatten binnen één enkel plasmide. In dit geval stuurt de constitutieve promotor P end cup twee de expressie van GFP aan, gevolgd door de Nolene Synthe-terminator of nos t.

Let op dat we in dit experiment een reeks trit-tags (één, twee en drie) zullen testen, die aan het C-terminus van GFP zijn gekoppeld voor expressie in chloroplasten en peroxisomen. De Gibson assembly-methode is afhankelijk van de werking van verschillende enzymen in een kant-en-klare mix om de uiteinden van dubbelstrengs DNA gedeeltelijk te verteren en het annealen van complementaire basenparen van naburige DNA-sequenties te vergemakkelijken. Het uiteindelijke construct bestaat uit drie delen die in vier PCR-reacties geamplificeerd moeten worden voorafgaand aan de Gibson assembly.

De eerste en tweede reacties amplificeren een plasmidevector van 8.000 basenparen, PORE, die GFP NOS T en een cany-resistentiemarker bevat. De resistentiemarker is een geschikte plek om dit grote DNA te verdelen in twee kleinere templates die gemakkelijker via PCR te amplificeren zijn. De derde reactie amplificeert de promotor P end cup twee, en de vierde reactie amplificeert triag één met behulp van in silico designsoftware zoals ape design, waarbij de constructie base voor base is ontworpen, zodanig dat er een overlap van 50 basenparen tussen elk fragment is.

Bij het bestellen van primers voor PCR is het mogelijk om de overlap van 50 basenparen te gebruiken als primers van telkens 25 basenparen per richting. Nadat de PCR is uitgevoerd om elk component te amplificeren, dient het PCR-product afzonderlijk te worden gezuiverd en te worden verdund in gedestilleerd gedeïoniseerd water. Indien het PCR-template een miniprep van e coli was, zal behandeling met het restrictie-enzym DPN het contaminerende template-DNA verwijderen. Meet vervolgens de concentraties van elk van de DNA-fragmenten.

Stel de vectorkoncentratie in op ongeveer 150 nanogram per microliter voor elk te assembleren construct, inclusief een controle, neem een aliquot van 15 microliter van de Gibson Assembly-mix uit de vriezer en ontdooi deze op ijs. Bepaal met behulp van de open-source online tool @gibbon. org de volumes voor equimolaire hoeveelheden van elk van de fragmenten.

Voeg het berekende volume van elk van de fragmenten toe aan de 15 microliter Gibson-mix. Bereid daarnaast een controle voor met enkel het vector-DNA. Het totale volume van elke reactie moet 20 microliters zijn.

Gebruik water om het volume aan te passen indien nodig. Incubeer de buisjes gedurende 30 tot 60 minuten bij 50 tot 55 °C. Plaats de buisjes na de incubatie terug op ijs.

Haal een microcentrifugebuisje met een commerciële preparatie van 200 µL calciumchloride-competente E. coli uit een vriezer van -80 °C en warm deze licht op in de hand. Voeg vervolgens alle 20 µL van de reactie toe aan de E. coli. Incubeer de culturen 30 minuten op ijs, breng ze daarna over naar een waterbad van 42 °C en voer een hitte-shock uit gedurende 60 seconden.

Gebruik geen elektrocompetente cellen. De relatief hoge zoutconcentratie en lage DNA-concentratie kunnen ervoor zorgen dat de cellen na transformatie overspringen. Plaats de culturen twee minuten terug op ijs, voeg vervolgens 750 µL SOC- of LB-medium toe en laat ze 30 minuten herstellen bij 37 °C.

Plat daarna het mengsel uit op LB-platen met kanamycin of een ander geschikt antibioticum en incubeer deze gedurende één nacht bij 37 °C; screen vervolgens 10 kolonies via sequencing. Houd er rekening mee dat deze methode kan leiden tot een hogere achtergrond en een groter aantal niet-doelgerichte recombinatiegebeurtenissen dan traditionele ligatiegebaseerde klonering. De biotische transfectie van tabak met een genenpistool is eerder beschreven in JoVE.

Hier worden de belangrijkste stappen en verschillen met betrekking tot eerdere protocollen besproken. Na het amplificeren en isoleren van de constructen, worden de gene gun bullets voorbereid zoals beschreven in het JoVE-artikel van woods en zeto en in de gene gun geladen voor transfectie van epidermaal weefsel van het blad van Nico Tania Benham Miana tabak. Kies een groot blad dicht bij de basis van een drie tot vijf maanden oude plant.

Plaats het met de onderzijde naar boven op natte papieren handdoeken in een Petri-schaal van 15 centimeter, terwijl u geschikte oog- en gehoorbescherming draagt. Stel de heliumdruk van het genenkanon in op 200 tot 250 PSI. Richt het genenkanon voorzichtig tussen de nerven op de onderzijde van een blad, ongeveer drie tot vijf centimeter erboven. Ontgrendel de beveiliging en breng de partikels aan op het blad.

Gebruik elk kogelvormig onderdeel twee keer op dezelfde plek op het blad. Verplaats naar een andere locatie en herhaal het proces als het blad openscheurt; gooi dit blad dan weg en begin met een nieuw blad. Er is enige variatie in de stevigheid van het blad als gevolg van groeicondities zoals leeftijd, vochtigheid, enzovoort.

Nadat alle injecties zijn voltooid, wordt het blad afgedekt en twee tot drie dagen op de werkbank bij weinig licht bewaard. Onderzoek het blad met een dissectiemicroscoop die is uitgerust met UV-fluorescentie en zoek naar individuele cellen die GFP tot expressie brengen. Wanneer cellen worden gevonden die GFP tot expressie brengen, worden met een dissectieschaar voorzichtig secties van 5 tot 10 millimeter uit het blad verwijderd.

Dompel elk individueel bladfragment onmiddellijk onder in de put van een diepe put microscopische glasplaat die ongeveer 200 µL 0,1% Triton X 100 bevat. Het detergent helpt te voorkomen dat er luchtbellen op het oppervlak ontstaan en de diepe put microscopische glasplaat maakt het mogelijk om een groter weefselbeeldingsgebied van cellen af te beelden met een confocale microscoop uitgerust met de juiste filters en een 40 x waterimmersie-objectief. In deze studie werden de drie verschillende GFP-organel-targetconstructen vergeleken met niet-getagde GFP en rubis.Coag.

GFP-confocale microscopie werd gebruikt om GFP-fluorescentie aan te tonen in transient getransformeerde enkelvoudige cellen in controle-experimenten waarin niet-getagd GFP werd tot expressie gebracht. Fluorescentie is uitsluitend waarneembaar in de nucleus en het cytosol, maar niet in de chloroplast, die worden geïdentificeerd door de rode autofluorescentie van chlorofyl, zoals te zien is in dit voorbeeld van een cel getransfecteerd met een chloroplast-specifieke Rubis Oag. Het GFP-construct GFP werd tot expressie gebracht in de grote organellen.

De cel is wit omlijnd. Het geel geeft gebieden aan van colokalisatie van het construct met chlorofyl, wat aangeeft dat het construct naar de chloroplast is gericht, zoals te zien is in deze afbeelding van een met triag één getransfecteerde cel; GFP-expressie is zichtbaar in de chloroplast, de periferie, het cytosol en kleine punctate organellen die waarschijnlijk peroxisomen zijn. Evenzo brengen met triag twee getransfecteerde cellen GFP tot expressie in de chloroplast, het cytosol en de peroxisomen; triag drie, dat bestaat uit een peroxisoomsignaal ingebed in een regio met lage complexiteit van de chloroplastsequentie, lokaliseerde uitsluitend in de chloroplast en het peroxisoom.

Let op dat deze cel zich in een andere bladlaag bevindt. Deze figuur vat de expressie samen die waargenomen is in de compartimenten van een typische epidermale cel van een tabaksblad. De relatieve grootte en locaties binnen de cel worden getoond, evenals de relatieve expressieniveaus die zijn waargenomen via gene gun transfectie en confocale microscopie.

Let op dat het niet-getagde GFP lokaliseert in het cytosol en de nucleus, de PIMT twee GFP-controle lokaliseert in de chloroplast en triag één GFP, triag twee GFP en Triag 3G FP lokaliseren in de chloroplast en het peroxisoom, zoals voorspeld. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een plasmide construeert met Gibson-assemblage, dit ballistisch aflevert in tabaksbladeren en GFP-expressie binnen drie dagen observeert. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat 150 ng/µL vector-DNA wordt gebruikt voor de Gibson-assemblage, en 1500 ng/µL van uw uiteindelijke DNA-construct om de gene gun-projectielen te maken. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals agrobacterium-transfectie, worden uitgevoerd om stabiele genexpressie te verkrijgen in plaats van transiënte expressie.