Name: Brain Slice Biotinylatie: An Ex Vivo Aanpak Regiospecifieke van plasma membraaneiwit Trafficking Meet in Adult Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Leer hoe je acute veranderingen in neuronale oppervlakte-eiwitten kwantificeert in ex vivo hersensneden. Deze biotinylatiemethode meet regiospecifiek membraaneiwittransport in volwassen neuronen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidies DA15169 en DA035224 om HEM

Alle dierlijke behandeling en weefsel oogst werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Massachusetts Medical School Institutional Animal Care gebruik Comite (IACUC), naar aanleiding van de goedgekeurde protocol # A1506 (Melikian, PI). Vereiste oplossingen Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) - Make dagverse 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2PO 4, 1,2 mM MgCl2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO 3, en 11 mM glucose Opmerking: Bereid ACSF als een 10x voorraad oplossing, met uitzondering van NaHCO3 en glucose. Maak 1x werkende oplossingen dagelijks van de 10x voorraad, aan te vullen met verse NaHCO3 en glucose. Sucrose aangevuld ACSF (SACSF) - Make dagverse 250 mM sucroos, 2,5 mM KCI, 1,2 mM NaH 2PO 4, 1,2 mM MgCl2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO 3, en 11 mM glucose Opmerking: Bereid SACSF als een 10x voorraad oplossing, met uitzondering van NaHCO3 en glucose. Maak 1x werkende oplossingen dagelijks van de 10x voorraad, aan te vullen met verse NaHCO3 en glucose. Sulfo-N-hydroxysuccinyl-SS-biotine (sulfo-NHS-SS-biotine, Pierce Chemical Company) De oplossingen moeten 200 mg / ml in DMSO en zijn bestand tegen meerdere vries / dooi cycli. Monsters opgeslagen bij -20 ° C. De succinyl ester snel gehydrolyseerd in een waterige oplossing, zodat werkende oplossingen moeten onmiddellijk worden voorbereid voorafgaand aan de toepassing te plakken. Slice Quench Solution ACSF aangevuld met 100 mM glycine RIPA Lysis Buffer 10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 0,1% SDS, 1% Na deoxycholaat RIPA met proteaseremmers (RIPA / PI) - Make dagverse RIPA aangevuld met 1 uM leupeptine, 1 uM pepstatine, 1 uM aprotinine en 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride. 1. Bereid Brain Slices <ol><li> Maak verse 1x SACSF en 1x ACSF </li><li> Chill SACSF op ijs in een kleine beker. Dit wordt gebruikt om de vers geoogste muizenhersenen houden. </li><li> Verzadigen de ACSF en SACSF met zuurstof door borrelen met 95% / 5% O 2 / CO 2, 20 minuten op ijs. </li><li> P30-38 muizen worden gebruikt voor optimale levensvatbaarheid van weefsel. Sacrifice dieren door cervicale dislocatie en onthoofding, en snel hersenen te verwijderen in prechilled, zuurstofrijk SACSF. </li><li> Met behulp van een trillende microtoom, maken 300 micrometer hersenen secties in regio van belang. </li><li> Desgewenst kan plakken verder ontleed voorafgaand aan terugwinning te verrijken voor bepaalde hersengebieden of afzonderlijke rechter en linker hemisferen respectievelijk gebruikt als controle en experimentele segmenten,. </li><li> Met behulp van een brand-gepolijste Pasteur pipet plakjes kamers set in 24-well platen bodem mesh. </li><li> Laat plakjes om te herstellen voor 40 min, 31 ° C in zuurstofrijk ACSF, met voortdurende, zachte borrelen. </li></ol> 2. Drug Treatment (indien van toepassing) en Slice Biotinylatie <ol><li> Na herstel, wassen segmenten 3x in voorverwarmde (37 ° C), geoxygeneerde ACSF borrelen constant met 95% / 5% O 2 / CO 2. </li><li> Voeg testverbindingen en incubeer met continue zuurstoftoevoer. <ol><li> Voor het gemak, voeg een 1/10 ste volume van 10x geconcentreerde drug, en meng door voorzichtig omkeren. </li><li> Schud platen voorzichtig in een waterbad op de gewenste temperatuur. </li></ol></li><li> Na behandeling met geneesmiddelen, snelchill plakjes door het wassen 3x in ijskoud ACSF. </li></ol> 3. Biotinyleren oppervlakte-eiwitten <ol><li> Bereid 1,0 mg / ml sulfo-NHS-SS-biotine ijskoude ACSF onmiddellijk voor etikettering. </li><li> Voeg 0,75 ml sulfo-NHS-SS-biotine te plakken en incubeer plakjes op ijs, 45 min. </li><li> Was de plakjes drie keer snel met ijskoude ACSF, vervolgens incubeer gedurende 10 minuten in ijskoud ACSF op ijs. </li><li> Was de plakjes drie keer met ijskoude slice afschrik buffer en incubeer met 0,75 ml slice afschrik buffer twee keer, 25 min, op ijs om gratis sulfo-NHS-SS-biotine lessen. </li></ol> 4. Bereid weefsellysaten <ol><li> Was de plakjes drie keer in ijskoud ACSF en breng elke plak een microcentrifugebuis met behulp van een brand gepolijste Pasteur pipet. </li><li> Zachtjes pellet slice door centrifugeren 200 xg, 1 min en zorgvuldig aspireren resterende ACSF. </li><li> Voeg 400 ul ijskoude RIPA / PI en breken weefsel door en neer te pipetteren eenmaal door een P200 pipette. </li><li> Transfer gedissocieerd slice / RIPA naar een nieuwe buis en incubeer 30 min, 4 ° C, roteren, om lysis te voltooien. </li><li> Pellet celresten door centrifugeren, 18.000 x g, 15 min, 4 ° C. </li><li> Bepaal lysaat eiwit gebruikmaking van de BCA eiwit assay, met runderserumalbumine (BSA) als standaard. </li></ol> 5. Isoleer Gebiotinyleerd Eiwitten <ol><li> Optimaliseer Bead / totaal eiwitverhouding. Opmerking: Individuele eiwitexpressieniveaus kan sterk variëren tussen verschillende hersengebieden. Tenzij alle gebiotinyleerde eiwit in een gegeven hoeveelheid weefsel lysaat wordt vastgelegd, is het niet mogelijk om eventuele veranderingen in de oppervlakte-expressie nauwkeurig te detecteren. Daarom is het noodzakelijk om empirisch bepalen van de optimale kraal / totaal eiwit verhouding voor een bepaald eiwit / hersengebied voor inschepen op een nieuw segment biotinylering studie. <ol><li> Incubeer 25 ul streptavidine agarosekorrels met toenemende hoeveelheids van weefsel lysaat (naar schatting bereik 25-200 ug), en ga dan verder zoals hieronder beschreven voor het binden, was-en elutie. </li><li> Kwantificeren van de resulterende immuunreactieve bands en kiezen voor een kraal / lysaat verhouding in het lineaire bereik van de binding die nauwkeurige kwantificering van verhoogd of verlaagd eiwit oppervlakte-expressie mogelijk wordt. </li></ol></li><li> Bereid Streptavidine-agarose kralen <ol><li> Bepaal totale kraal volume nodig voor alle monsters. Bereid een voldoende kraal volume voor dat bedrag plus een extra (dwz 4 monsters bij 25 ul / monster = 100 pl kralen + een extra = 125 pi kralen. </li><li> Vortex Streptavidine kraal voorraad en pipet uit gewenste volume. Bij gebruik van een P200 pipet, knipte het eind van de tip om verstopping of kraal schade te voorkomen. </li><li> Was kralen 3 keer in 0,5-1,0 ml RIPA / PI conserveringsmiddelen, vortexen na elke toevoeging RIPA en verzamelen kralen tussen wasbeurten verwijderen door centrifugeren 18.000 xg, 1 min bij kamertemperatuur. </li><li> Aspireren off buffer tussen de wasbeurten met een glazen Pasteur pipet bevestigd aan een thermoskan. Een plastic P200 uiteinde bevestigd aan het uiteinde van de glazen Pasteur pipet levert fijnere controle bij aspireren. Het is niet noodzakelijk geheel verwijderen van alle buffer van de eerste twee wassen, aangezien het risico aanzuigen kralen in de pipet. Na de laatste wasbeurt, verwijder zoveel overtollige buffer mogelijk zonder opzuigen van de kralen. </li><li> Voeg RIPA / PI kralen terug naar hun oorspronkelijke volume te brengen, en neer te pipetteren tot resuspendeer. Vermijd vortexen op dit punt, zoals kralen zal vasthouden aan de buiswand. </li><li> Aliquot kralen in microcentrifugebuizen met een P200 met de punt afgesneden. Pipet op en neer meerdere malen tussen de monsterneming te verzekeren kralen blijven gelijkmatig geschorst en verdeeld onder de buizen. </li></ol></li><li> Bind gebiotinyleerde eiwitten aan kralen streptavidine <ol><li> Verdeel cellysaten de buizen die de agarose korrels. Voor experimenten whe<html> re meerdere monsters worden vergeleken, zorg ervoor dat dezelfde hoeveelheid eiwit te gebruiken voor elk monster voor nauwkeurige vergelijkingen. </li><li> Voeg extra RIPA / PI monsters een 200 ul minimaal volume te brengen. Dit zorgt ervoor dat de monsters voldoende tijdens de incubatie zal mengen en ook verenigt het eiwit concentraties over monsters. </li><li> Plaats buisjes in een rol rotator en meng gedurende de nacht bij 4 ° C. </li><li> In afzonderlijke buizen, afzien van een equivalent van het totale lysaat volume gebruikt voor elk monster. Alternatief, als de monstervolumes hoog, een fractie van het totale lysaat volume kan plaats gereserveerd om maximale laadvolume op SDS-PAGE gels tegemoet. Deze zullen worden gebruikt om de oppervlakte-expressie normaliseren de totale hoeveelheid eiwit. </li><li> Voeg hetzij een gelijk volume van 2x of 1/5 volume 6x SDS-PAGE monsterbuffer en hetzij incuberen bij 4 ° C, parallel met kraal monsters of bewaar bij -20 ° C totdat de monsters geanalyseerd. </li></ol></li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Elute en analyseren monsters <ol><li> Pellet parels door centrifugeren 18.000 xg, 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig supernatant en wassen kralen drie keer met 0,75 ml RIPA. Om kraal verlies te minimaliseren, laat een klein hoofd volume buffer boven kralen tussen de wasbeurten. Na de laatste wasbeurt, verwijder zoveel RIPA mogelijk, zonder verstoring van de kraal pellet. </li><li> Elueer gebiotinyleerde eiwitten uit streptavidineparels doordat de disulfidebinding. Voeg 25 ul 2x SDS-PAGE reducerende sample buffer, vortex goed en draai monsters 30 min, kamertemperatuur. Opmerking: Veel membraaneiwitten hebben een sterke neiging te aggregeren wanneer gekookt in SDS-PAGE sample buffer, ernstig afbreuk hun elektroforetische mobiliteit. Als dit het geval is voor het eiwit wordt onderzocht, voorkomen verwarming van de monsters en in plaats daarvan elueren langzaam bij kamertemperatuur. Als koken is absoluut noodzakelijk (bijvoorbeeld als een ander eiwit onderzocht in parallel vereist koken), sample buffer kan worden aangevuld met 2 M ureum (eindconcentratie) om aggregatie te minimaliseren. Hoewel effectief in het verminderen van aggregatie in sommige gevallen ureum compromissen vaak band optredens. </li><li> Analyseer de monsters door immunoblot. </li><li> Ontdooi totale lysaat monsters en draaien parallel met kraal monsters, 30 min, kamertemperatuur. </li><li> Afzonderlijke eiwitten op SDS-PAGE gels. </li><li> Identificeer eiwit (s) van belang door immunoblotting. <ol><li> Wees er zeker van dat bands worden gedetecteerd in het lineaire bereik van detectie voor kwantificering. </li><li> Om te verzekeren dat de biotinylatiereagens geen toegang tot intracellulaire eiwitten verkregen via beschadigde / gecompromitteerd cellen. Dit wordt het beste bereikt door immunoblotting parallel voor een intracellulair eiwit specifiek voor het celtype onderzocht. </li><li> Kwantificeren band dichtheden en bereken de relatieve eiwitoppervlak dichtheid als een procent van de totale hoeveelheid eiwit expressie niveau. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+portals+of+entry+into+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li>
<li>Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li>
<li>Leto, D., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+transport+by+insulin%3A+traffic+control+of+GLUT4%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).</li>
<li>Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+membrane+trafficking+defects+of+disease-associated+dynamin+2+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations.</a> Traffic. 12, 1620-1633 (2011).</li>
<li>Li, X., DiFiglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recycling+endosome+and+its+role+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The recycling endosome and its role in neurological disorders.</a> Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).</li>
<li>Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-independent+endocytosis%3A+mechanisms+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).</li>
<li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+unplugged%3A+multiple+ways+to+enter+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Res. 20, 256-275 (2010).</li>
<li>Barry, M. F., Ziff, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+trafficking+and+the+plasticity+of+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).</li>
<li>Bredt, D. S., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+at+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking at excitatory synapses.</a> Neuron. 40, 361-379 (2003).</li>
<li>Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+synapses+and+the+emergence+of+a+postsynaptic+mechanism+for+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).</li>
<li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).</li>
<li>Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+the+ventral+tegmental+area%3A+electrophysiological+and+behavioral+correlates+in+individual+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats.</a> J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).</li>
<li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+dopamine+neurons%3A+Behavioral+correlates+in+GluRA%28-%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice.</a> PNAS. 101, 14282-14287 (2004).</li>
<li>Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+addiction%3A+the+role+of+reward-related+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).</li>
<li>Thomas, M. J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+the+mesolimbic+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).</li>
<li>Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+protein+kinase+C-induced+internalization+of+the+dopamine+transporter+is+mediated+by+a+clathrin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism.</a> Traffic. 6, 157-170 (2005).</li>
<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical%2C+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li>
<li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li>
<li>Melikian, H. E., Buckley, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+trafficking+regulates+the+activity+of+the+human+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter.</a> J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).</li>
<li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+trafficking+of+the+human+dopamine+transporter.+Clathrin-mediated+internalization+and+lysosomal+degradation+in+response+to+phorbol+esters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters.</a> J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).</li>
<li>Sorkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screen+reveals+an+essential+role+of+Nedd4-2+in+dopamine+transporter+ubiquitination+and+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis.</a> J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).</li>
<li>Eriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+dopamine+transporter+trafficking+in+live+neurons+by+use+of+fluorescent+cocaine+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs.</a> J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).</li>
<li>Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subcellular+distribution+of+endosomal+compartments+and+the+dopamine+transporter+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële belangen die strijdig zijn met dit werk.

Ondanks jarenlange kennis die endocytische mensenhandel kritisch gevolgen synaptische signalering in de hersenen, het is een uitdaging om kwantitatief veranderingen in eiwitoppervlak expressie in volwassen neuronen meten bewezen. In dit werk, melden wij een betrouwbare benadering van oppervlakte-eiwit ex vivo labelen in acute hersenen plakjes. Hersenen slice preparaten hebben een jarenlange geschiedenis van nut voor elektrofysiologische opnames, omdat ze onderhouden synaptische verbindingen en mobiele levensvat...

Endocytische mensenhandel is een alomtegenwoordige cellulair mechanisme dat verfijnt de plasmamembraan presentatie van een verscheidenheid van integrale membraaneiwitten. Endocytosis levert vitale voedingsstoffen aan het intracellulaire milieu 1 en ongevoelig receptor signalering in respons op receptoractivering 2. Endocytische recycling terug naar de plasmamembraan kan bovendien versterken cellulaire signalering door verhogend eiwit expressie op het celoppervlak 3. Bovendien worden membraantransport verstoringen betrokken bij tal van ziekten en pathologische omstandigheden 4,5, gewezen op de noodzaak om de moleculaire mechanismen die eiwit endocytische mensenhandel regeren onderzoeken. Hoewel veel eiwitten gebruiken klassieke clathrin-afhankelijke internalisatie mechanismen, steeds meer aanwijzingen over de afgelopen jaren laat zien dat meerdere clathrin-onafhankelijke endocytische mechanismen regelen de endocytische potentieel van een toenemende aanbod vaneiwitten 6,7. Zo heeft de noodzaak om endocytische mechanismen vergemakkelijken handel in fysiologisch relevante systemen te onderzoeken flink gegroeid. In de hersenen, endocytische mensenhandel van receptoren, ionkanalen en neurotransmitter transporters heeft een primaire rol bij het ​​vaststellen van synaptische plasticiteit 8-11 en de reactie op drugs 12-15, uiteindelijk invloed neuronale prikkelbaarheid en synaptische reacties. Tot dusver heeft de meerderheid van de neuronale mensenhandel studies beroepen op heterologe expressie systemen of gekweekte primaire neuronen, die geen van beide kan een getrouw beeld geven mechanismen een rol spelen bij volwassen neuronen. Hier melden wij een aanpak die oppervlak biotinylatie gebruikt om oppervlakte-eiwit niveaus in acute hersenenplakken afgeleid van volwassen knaagdieren kwantitatief te meten. Met deze aanpak, presenteren we data die aantonen dat de muis striatale dopamine transporter snel internaliseert in rereactie op forbol-ester gemedieerde proteïne kinase C (PKC) activatie.

<table><tbody><tr><td>sulfo NHS-SS-biotin</td><td>Pierce</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin agarose</td><td>Pierce</td><td>20347</td><td></td></tr><tr><td>IgG-free, Protease-free bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating microtome sectioner</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell mesh-bottomed inserts (8 &micro;m pore size)</td><td>Millipore</td><td>PI8P 012 50</td><td>Deze kunnen met de hand worden gewassen en hergebruikt</td></tr></tbody></table>

brain slice biotinylatie: an<em&gt; ex vivo</em&gt; aanpak regiospecifieke van plasma membraaneiwit trafficking meet in adult neuronen

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Gereglementeerde endocytische mensenhandel is het centrale mechanisme faciliteren van een verscheidenheid van neuromodulatory gebeurtenissen, door het dynamisch regelen van receptor, ionkanalen en vervoerder oppervlak cel presentatie op een minuten tijdschaal. Er is een grote diversiteit van mechanismen die endocytisch handel in individuele eiwitten controleren. Studies die de moleculaire onderbouwing van mensenhandel hebben voornamelijk ingeroepen oppervlak biotinylatie om kwantitatief veranderingen in membraaneiwit oppervlakte-expressie te meten in reactie op exogene prikkels en genetische manipulatie. Echter, deze benadering is voornamelijk beperkt tot gekweekte cellen, die niet trouw kunnen weerspiegelen de fysiologisch relevante mechanismen die een rol spelen bij volwassen neuronen. Bovendien kan gekweekte cel benaderingen regio-specifieke verschillen in de handel mechanismen onderschatten. Hier beschrijven we een aanpak die celoppervlak biotinylering uitstrekt tot de acute hersenen slice voorbereiding. Wijaantonen dat deze methode zorgt voor een high-fidelity aanpak van snelle veranderingen in de membraan eiwitoppervlak niveaus in volwassen neuronen te meten. Deze benadering is waarschijnlijk brede bruikbaarheid op het gebied van neuronale endocytische handel hebben.

De neuronale dopamine transporter is geïnternaliseerd in reactie op PKC activering in cellijnen 16-20. Ondanks vele rapporten waaruit blijkt dat PKC-geïnduceerde DAT oppervlak verliezen in een verscheidenheid van cellijnen en expressie-systemen, is het een uitdaging om deze bevinding in gekweekte dopaminerge neuronen 21-23 bevestigen. We gebruikten muis striatale plakjes direct testen of DAT internaliseert in reactie op PKC activering bij volwassen dopaminerge neuronen. Na slice voorbereiding, werd...

Neuronale membraan mensenhandel stelt dynamisch plasmamembraaneiwit beschikbaarheid en significant invloed neurotransmissie. Tot op heden, is het een uitdaging om neuronale endocytische handel in volwassen neuronen te meten. Hier beschrijven we een zeer effectieve, kwantitatieve methode om snelle veranderingen in de oppervlakte-eiwit expressie ex vivo bij acute plakjes hersenen te meten.

Brain Slice Biotinylatie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak Regiospecifieke van plasma membraaneiwit Trafficking Meet in Adult Neuronen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van acute veranderingen in neuronale oppervlakte-eiwitten. In ex vivo hersensnedepreparaten wordt dit bereikt door eerst levensvatbare acute hersensneden te maken. Vervolgens worden de sneden behandeld met de betreffende geneesmiddelen.Vervolgens worden de eiwitten op het celoppervlak gelabeld met behulp van membraanimpermeabele reagentia. Tot slot worden de biotinylerede oppervlakte-eiwitten geïsoleerd met behulp van streptavidine-affiniteitschromatografie. Uiteindelijk wordt immunobloting gebruikt om veranderingen in de expressie van oppervlakte-eiwitten na behandeling met geneesmiddelen te kwantificeren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals celgebaseerde lokalisatie, is dat het transport van neuronale eiwitten in situ wordt onderzocht in plaats van in heterologe expressiesystemen of primaire neuronale culturen. Over het algemeen zullen personen die nog niet bekend zijn met deze methode moeite hebben met het prepareren van levensvatbare hersensnijden. Om hersensnijden te prepareren, begint u met het maken van verse 1x kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) en sucrose-g

brain-slice-biotinylation-an-ex-vivo-approach-to-measure-region

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Gereglementeerde endocytose regelt de cel oppervlakte-expressie niveaus van de meerderheid van de membraaneiwitten. Hier maken wij gebruik van herleidbaar, membraan impermeant biotinylatie reagentia aan de endocytische koers van de dopamine transporter (DAT), een membraaneiwit polytopic te meten. De methode maakt een directe benadering van het meten van de endocytische snelheid van de meeste plasma-membraan eiwitten.

Het meten van plasma membraaneiwit endocytische de tarieven door Omkeerbare biotinylatie

Dit rapport beschrijft het gebruik van live cell imaging en photobleach technieken om de oppervlakte-expressie, transportroutes en handel in kinetiek van exogeen uitgedrukt, pH-gevoelige GFP-gelabelde eiwitten in de plasmamembraan van neuronen te bepalen.

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

We beschrijven een methode om eiwit label op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek polyklonaal antilichaam tegen extracellulaire epitopen. Eiwit door het antilichaam gebonden op het celoppervlak en vervolgens geïnternaliseerd via endocytose kunnen worden onderscheiden van eiwitten nog op of verhandeld bij het oppervlak tijdens de incubatie.

Differentiële Labeling van Cell-oppervlak en Internalized Eiwitten na Antibody Voeden van Levende gekweekte neuronen

We geven een gedetailleerd protocol voor inductie van lange termijn potentiëring van de CA1 regio van de hippocampus en de daaropvolgende isolatie van nucleaire verrijkte fracties uit de tetanized gebied van het segment. Deze benadering kan worden gebruikt om activiteit te bepalen afhankelijk kerneiwit invoer cellulaire modellen van leren en geheugen.

Isolatie van CA1 Nuclear verrijkte fracties van hippocampus Slices om te studeren activiteit-afhankelijke nucleaire import van Synapto-nucleaire Messenger Eiwitten

Axonale transport van BDNF, een neurotrofe factor, is van cruciaal belang voor de overleving en functie van verschillende neuronale populaties. Sommige degeneratieve stoornissen worden gekenmerkt door verstoring van axonale structuur en functie. We toonden de technieken die gebruikt worden om live handel in QD-BDNF in microfluïdische kamers met zowel primaire neuronen te onderzoeken.

Real-time beeldvorming van Axonale Vervoer van Quantum Dot-label BDNF in primaire neuronen

Lichtmicroscooptechnieken gekoppeld aan biochemische analyses verduidelijken de betrokkenheid van SNARE-gemedieerde exocytose bij netrine-afhankelijke axonvertakking. Deze combinatie van technieken maakt identificatie mogelijk van moleculaire mechanismen die axonvertakking en celvormverandering controleren.

Gebruik makend van gecombineerde methoden om de rol van de plasmamembraan Delivery Tijdens Axon vertakking en neuronale Morphogenesis Definieer

Hier presenteren wij een breukmembraan fractioneringsprotocol dat een robuuste procedure voor het isoleren van eiwitten uit verschillende synaptische compartimenten vertegenwoordigt.

Breinmembraanfractie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak om de subsynaptische eiwit lokalisatie te beoordelen

Twee biotinylatie-gebaseerde methoden, ontworpen voor het bepalen van de expressie van de celoppervlak en de endocytische snelheid van eiwitten uitgedrukt in het plasmamembraan, worden in dit rapport weergegeven.

Bepaling van de expressie van de celoppervlakte en de endocytische snelheid van eiwitten in primaire astrocytekulturen met behulp van biotinylering

Dit artikel presenteert een methode voor de studie van glutamaat receptor (glur) handel in gezien primaire hippocampal culturen. Met behulp van een antilichaam-voedende benadering voor het etiket van endogene of overexpressie receptoren in combinatie met farmacologische benaderingen, deze methode maakt het mogelijk voor de identificatie van moleculaire mechanismen regulering van GluR oppervlakte expressie door modulerende processen voor internalisatie of recycling.

Een aanpak van antilichamen voeding te bestuderen glutamaat receptor handel in Dissociated primaire Hippocampal culturen

Deze methode introduceert een eenvoudige techniek voor de detectie van endogene monoamineafgifte met behulp van acute hersenplakken. De opstelling maakt gebruik van een 48-well plaat met daarin een weefselhouder voor monoamineafgifte. Vrijgegeven monoamine wordt geanalyseerd door HPLC in combinatie met elektrochemische detectie. Bovendien biedt deze techniek een screeningsmethode voor het ontdekken van geneesmiddelen.

Een op platen gebaseerde test voor de meting van endogene monoamineafgifte in acute hersenplakken

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Leer hoe je acute veranderingen in neuronale oppervlakte-eiwitten kwantificeert in ex vivo hersensneden. Deze biotinylatiemethode meet regiospecifiek membraaneiwittransport in volwassen neuronen.

Brain Slice Biotinylatie: An

Meer video's verkennen