Name: Generatie Myospheres Van hESCs door Epigenetische herprogrammeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Leer myosferen genereren van hESCs door epigenetische herprogrammering met lentivirale infectie van Baf 60 C en Myo D. Deze methode produceert contractiele spiervezels voor onderzoek naar spierbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PLP is een Associate Investigator van Sanford Children&#39;s Health Research Center. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan PLP: R01AR056712, R01AR052779 en P30 AR061303 van het National Institute of Health / Nationaal Instituut van artritis en spier-en huidziekten (NIAMS), MDA en Sanford Children Health Research award. Dit werk is gedeeltelijk geprofiteerd van de financiering van onderzoek van het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap in het project-Health FP7 - 2009 ENDOSTEM 241.440 (Activering van vaatstelsel geassocieerde cellen en spieren stamcellen voor de reparatie en het onderhoud van spierweefsel) SA werd ondersteund door. CIRM fellowship.

1. Infectie van hESCs Dit protocol vereist hoge titer lentivirussen codering BAF60C en MyoD 13. Deze constructen zijn op aanvraag beschikbaar. <ol><li> Aanbevelingen voor het starten <ol><li> Om een hoge efficiëntie van infectie, plaat hESCs voor infectie op voedingsvrije omstandigheden (figuur 2A) om cellulaire concurrenten uit te schakelen tijdens de virale opname waarborgen. Inderdaad, MEF zijn notoir gemakkelijker te infecteren in vergelijking met hESCs en zijn bevoegd voor-MyoD gemedieerde conversie. Dus, waardoor MEF van hESC culturen verhoogt de besmettingsgraad. </li><li> Aanbevolen wordt om hoge titer lentivirussen te hoge efficiëntie van infectie waarborgen. Opties om de efficiëntie van de infectie te verbeteren worden besproken in het hoofdstuk &quot;de controle infectie&quot;. </li><li> Bereid-Matrigel beklede platen door toevoeging van 1 ml 1 mg / ml Matrigel in elk putje en laat minstens 1 uur bij kamertemperatuur (of O / N afgedicht bij 4 ° Cindien bereid de dag ervoor). </li></ol></li><li> Infectie procedure <ol><li> Dag vóór de infectie <ol><li> Voeg hES Cell Cloning &amp; Recovery Supplement in het medium bij 1000 X verdunning (2 mM eindconcentratie). </li></ol></li><li> Dag 0 - Infectie met BAF60C Opmerking: Voer de infectie van hESCs met BAF60C eerste, gevolgd door infectie met MyoD. <ol><li> Distantiëren een putje van een 6-well plaat hESCs als kolonies 14 in een eencellige suspensie gekweekt door incubatie met 1 ml TrypLE gedurende 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Transfer suspensie een 15 ml buis, voeg 9 ml hESC medium en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1200 rpm. </li><li> Tijdens het centrifugeren Bereid de infectie mengsel in een schone buis door aan 1 ml mTeSR1, polybreen (6 mg / ml) en HES Cell Cloning &amp; Recovery Supplement (2 mM). </li><li> Resuspendeer de cel pellet (ca. 5 x 10 5 -1 x 10 6 cellen uit een confluent goed van hESCs) met 1 ml van de infectie mix en plaat op een 6-well lage bevestigingsplaat, die de cellen verhindert zich te houden aan het plastic. </li><li> Voeg BAF60C-IRES-GFP virus bij 10 8 MOI en incubeer 3 uur in de incubator </li><li> Verzamel de cel suspensie die de virussen en gelijk te verdelen in twee-matrigel beklede putjes. Voeg vervolgens 2 ml mTeSR1 + HES Cell Cloning &amp; Recovery Supplement op elk putje en laat O / N in de incubator. </li></ol></li><li> Dag 1 <ol><li> Verwijder voorzichtig het medium met het virus en te vervangen door 2 ml mTeSR1and hES Cell Cloning &amp; Recovery Supplement. Cellen start klonteren zoals getoond in figuur 2B. </li></ol></li><li> Day2 - Infectie met MyoD <ol><li> Voordat u verder gaat controleer de fluorescentie status van de cellen onder een fluorescentiemicroscoop ervoor zorgen om een ​​hoge efficiëntie van infectie. Zo niet, zie de paragraaf &quot;het controleren infecterenion &quot;. </li><li> Als de cellen ten minste 80% confluentie bereikt als volgt; anders wachten op een extra dag voorafgaand aan de procedure. </li><li> Verwijder het medium en voeg 1 ml TrypLE reagens om de cellen te scheiden. Incubeer 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Herhaal zoals beschreven from1.2.2.2 - 1.2.2.6 voegen MyoD virus bij 10 8 MOI. </li></ol></li><li> Dag 3 <ol><li> Verwijder voorzichtig het medium met het virus en te vervangen door 2 ml mTeSR1and hES Cell Cloning &amp; Recovery Supplement. </li><li> Plaat MEF op matrigel beklede platen van 2,5 x 10 5 / cm 2 voor de volgende dag om verspreiding van de geïnfecteerde cellen mogelijk te maken. </li></ol></li><li> Dag 4 <ol><li> Verwijder het medium en voeg 1 ml TrypLE reagens om de cellen te scheiden. Incubeer 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Breng de cellen in een 15 ml falcon-buis, voeg 9 ml hESC medium en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1200 rpm. </li><li> Rerwijderen het supernatant en opnieuw te schorten in 6 ml van hESC medium. </li><li> Verwijder het medium uit de MEFs bevattende 6-well plaat en plaat hESCs in 1:2 verhouding, doseren 3 ml per MEF-bevattende put. TIP! Wanneer de kolonies bereiken samenvloeiing, kunnen sommige van de putten van MyoD/BAF60C-infected cellen in vloeibare stikstof worden bevroren als reserve voorraad. Invriezen medium omvat 90% van KOSR en 10% DMSO plus 2 mM hES Cell Cloning &amp; Recovery Supplement. Voorts zijn kan vervolgens worden blootgesteld aan de differentiatie protocol - zie hieronder voor de beschrijving. Indien meer cellen nodig zijn meer myospheres produceren geïnfecteerd hESCs verder gepropageerd als volgt: </li><li> Verwijder het medium en incubeer met 1 ml 1 mg / ml collagenase IV gedurende 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Verwijder collagenase IV en voeg 1 ml van hESC medium. </li><li> Onder een dissectie microscoop schraap de kolonies met een 10 ml tip. </li><li> Verzamel de brokken van Colonies in een 15 ml buis en laat bezinken gedurende 3 minuten. De bovenstaande vloeistof, resuspendeer in hESC medium en plaat op MEF platen met behulp van een verhouding 01:04. </li></ol></li></ol></li><li> Controle van infectie <ol><li> Terwijl het uitdragen van de cellen, is het raadzaam om de geïnfecteerde cellen plaat in een kleinere schaal te oogsten voor RNA-analyse en eiwit expressie analyses uit te voeren door immunofluorescentie om te controleren op biomarkers die de juiste biologische toestand in elk stadium weerspiegelen (zie Representatieve resultaten). Voor hoge titer lentivirussen het verwachte percentage geïnfecteerde cellen ten minste 80% bedragen. </li><li> Om een ​​hoge efficiëntie, kan de lentivirale vectoren worden gemodificeerd, introduceren een fluorescerende selectiemerker en / of een antibioticum resistentie. Onze lentivirale plasmide dat BAF60C draagt ​​ook GFP-fluorescentie. </li><li> Sorteren hESCs voor een fluorescerende marker. Bij lage efficiëntie van infectie wordt aanbevolen om een ​​fluorescentie gebruikenctivated cellen sortering (FACS-sortering) te verrijken voor cellen die BAF60C virus en vervolgens infecteren de cellen met hoge titer MyoD virus. <ol><li> Voeg hES Cell Cloning &amp; Recovery Supplement in het medium de dag voor de sortering. </li><li> De dag van het sorteren, dissociëren de cellen door TrypLE (zoals beschreven op dag 0) en resuspendeer de cellen in KO vervanging serum plus HES Cell Cloning &amp; Recovery Supplement FACS-buizen. </li><li> Aan het einde van het sorteren, het verzamelen van de cellen in KO vervanging serum en plaat op MEF platen voegen hES Cell Cloning &amp; Recovery Supplement. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. EB-achtige Inductie en Differentiatie <ol><li> Inductie en differentiatie procedure <ol><li> Dag 0 - EB inductie <ol><li> Zorg ervoor dat, voordat u begint met de differentiatie van BAF60C/Myod-infected hESCs, hoge aantal kolonies hebben in de put (figuur 2C). </li><li> Voor elk goed rerwijderen het medium, wassen met PBS en voeg 1 ml van 1 mg / ml collagenase IV. Incubeer 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Verwijderen collagenase en voeg 1 ml EB medium. </li><li> Onder een dissectie microscoop snel mechanisch distantiëren de koloniën in 400-800 celaggregaten door schrapen met een 10-ml tip. </li><li> Verzamel de brokken van kolonies in een 15 ml buis en laat bezinken gedurende 3 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof, resuspendeer in 3 ml EB medium en breng de celsuspensie om een ​​putje van een 6-wells lage bevestigingsplaat. </li></ol></li><li> Dag 1 <ol><li> Controleer de grootte van de kolonies en de celdood voordat u verder gaat. Als grote stukken aanwezig zijn, breken ze door zachtjes en neer te pipetteren met een pipet 5 ml, 3-4 keer. Als de celdood zeer hoog (veel drijvende cellen en afval) vervangen door medium verzamelen van de aggregaten in een 15 ml buis door zwaartekracht en plaat ze met 3 ml vers EB medium anders als volgt verder. </li><li> 1.5 toevoegenEB ml vers medium in de putjes </li></ol></li><li> Dag 2 <ol><li> Verander het medium door het verzamelen van de aggregaten van de putten in een 15 ml buis. Laat ze tot rust komen gedurende 2 minuten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof, te vervangen door 3 ml vers medium en EB herverdelen dezelfde putjes. </li></ol></li><li> Dag 3 <ol><li> Voeg 1,5 ml vers EB medium in de putjes. </li></ol></li><li> Dag 4 <ol><li> Ga te werk zoals beschreven in &quot;Dag 2&quot;. </li></ol></li><li> Dag 5 - myogene differentiatie van EB-achtige clusters (figuur 2D). <ol><li> Verzamel de aggregaten zoals beschreven in 2.1.3.1 en eenmaal wassen met 2 ml PBS; kan de geaggregeerde naar sediment. </li><li> Verwijder de PBS en voeg 3 ml DM medium; plaat op dezelfde putten. </li></ol></li><li> Dag 6 - Dag 20 <ol><li> Van d6 tot d20 vervang het medium door vers medium om de 3 dagen. Vertegenwoordiger myospheres worden getoond in Figure 2E. </li></ol></li></ol></li><li> Controleren myosphere differentiatie <ol><li> Alvorens verder, is het raadzaam om de efficiëntie van myogene differentiatie binnen de myospheres controleren doordat delen van de myospheres ingebed in oktober verbinding, zoals beschreven in een eerdere Jupiter protocol 12. Voer een immunofluorescentiekleuring voor myogene merkers zoals myognenin (kloon F5D, DSHB) en myosine zware keten (kloon MF20, DSHB) (zie Representatieve resultaten). TIP! Om succesvol te zijn met de kleuring voor myogenin op EB secties is het essentieel om antigen herstel uit te voeren door behandeling met natriumdodecylsulfaat (SDS) 0,5% gedurende 5 minuten zijn. Bovendien is het mogelijk om dit protocol voor een dubbele kleuring met F5D en MF20 antilichamen. </li></ol></li></ol> 3. Media Recepten <ol><li> ESC medium DMEM-F12 1 mM L-glutamine 20% Knockout Serum Vervanging medium (KOSR) 0,1 mM niet-essentiële aminozuren (NEAA) 50 U / ml penicilline / streptomycine (Pen / Strep) 0,1 mM beta-mercaptoethanol 8 ng / ml basische fibroblastgroeifactor (bFGF) </li><li> EB medium DMEM F12 1 mM L-glutamine 15% FBS 5% Horse Serum </li><li> DM medium DMEF F12 1X ITS Liquid Media Supplement 1X N-2 Supplement </li></ol>

<ol><li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+skeletal+muscle+regeneration+from+differentiating+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells.</a> Nat Med. 14, 134-143 (2008).</li>
<li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ES-+and+iPS-derived+myogenic+progenitors+restore+DYSTROPHIN+and+improve+contractility+upon+transplantation+in+dystrophic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 610-619 (2012).</li>
<li>Iacovino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cassette+exchange%3A+a+rapid+and+efficient+system+enabling+conditional+gene+expression+in+embryonic+stem+and+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene expression in embryonic stem and primary cells.</a> Stem Cells. 29, 1580-1588 (2011).</li>
<li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+engraftable+skeletal+myoblasts+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells.</a> Nat Med. 13, 642-648 (2007).</li>
<li>Goudenege, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblasts+derived+from+normal+hESCs+and+dystrophic+hiPSCs+efficiently+fuse+with+existing+muscle+fibers+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation.</a> Mol Ther. 11, 2153-2167 (2012).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> Embo J. 31, 301-316 (2012).</li>
<li>Albini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+of+human+embryonic+stem+cells+into+skeletal+muscle+cells+and+generation+of+contractile+myospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells into skeletal muscle cells and generation of contractile myospheres.</a> Cell Rep. 3, 661-670 (2013).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 5434-5438 (1989).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Ho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+embryonic+stem+cell+chromatin+remodeling+complex%2C+esBAF%2C+is+essential+for+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 5181-5186 (2009).</li>
<li>Gomes, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pluripotent+stem+cells+by+using+cryosections+of+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li>
<li>Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M. Human embryonic stem cell cardiogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarcova%2C+M+%22Human+Stem+Cell+Manual%3A+a+Laboratory+Guide%22">Human Stem Cell Manual: a Laboratory Guide</a>. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. H. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam. 227-237 (2007).</li>
<li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle%3A+the+role+of+MyoD1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

De hier voorgestelde protocol beschrijft hoe driedimensionale clusters van samentrekkende spiervezels (myospheres) genereren direct uit hESCs. De voorgestelde strategie heeft de ongekende en buitengewone potentieel om mini spieren in suspensie die geschikt is als kan worden &quot;ziekte in een schotel&quot;-model voor zowel screening assays en ontwikkelingsstudies produceren. Bovendien is de methode myospheres genereren uit hESCs is eenvoudig en vereist geen FACS-sortering stap tijdens de differentiatie, die doorgaans een negatieve invloed op de opbrengst van teruggewonnen cellen vereisen. Bovendien zou een sorteerprocedure tijdens de differentiatie interfereren met de aggregatie omdat dit betekent een dissociatie van de EB in enkele cellen. De voorgestelde methode is gebaseerd op de epigenetische reprograming hESCs van een bepaalde parameter, MyoD en BaAF60C, die niet uitgedrukt in pluripotente embryonale stamcellen. MyoD en BAF60C over een &quot;kern&quot; eiwitcomplex thbij markeert de genomische loci waaruit transcriptie overgaat tot het skelet myogene programma te activeren. De twee factoren zijn om de cellen uit met behulp van lentivirale infecties en daarom essentieel om een ​​hoge efficiëntie van infectie van beide factoren in alle cellen te verkrijgen. Dit kan worden bereikt door gebruik van hoge titer virussen of virussen voorzien van selectiemerkers. Kweekomstandigheden een belangrijke rol spelen bij het optimaliseren van de omvang van de myogene differentiatie. Wij stellen een serum op basis van differentiatie protocol voor de differentiatie van MyoD/BAF60C uiten hESCs in clusters van myogene voorlopers, gevolgd door incubatie in serum-vrij gedefinieerde medium (die insuline transferrine - ITS) om de conversie van myogene voorlopers bereiken in skeletachtige myotubes. Het is echter mogelijk dat andere gedefinieerde media gelijke of betere myogene differentiatie kan bereiken. Een stroombegrenzing van het protocol is dat het gebaseerd is op het gebruik van foetaal runderserum, die naast bevattening veel dierlijke eiwitten en stoffen, toont veel te veel variaties. Dit kan resulteren in lagere efficiëntie of heterogeniteit van myogene conversie binnen myospheres. Van de nota, niet alle EB-achtige structuren afgeleid van BAF60/MyoD-expressing hESCs zijn myospheres; namelijk, sommige zijn EB-achtige aggregaten volledig samengesteld uit myovezels. Het aantal myospheres normaal afgeleid van hESCs uiten BAF60C en MyoD kan variëren van 30 tot 60% zoals geschat door immuunkleuring op EB secties uitgevoerd aan het einde van het protocol (zie resultaten). Een mogelijke benadering van een kweekschaal voor slechts myospheres verrijking zou een myogene reporter gebruikt. Dit vergemakkelijkt het teruggooien van het gedeeltelijk of niet gedifferentieerd EB-achtige clusters en selecteren alleen de myospheres. Tenslotte zou een beter begrip van de mechanismen verantwoordelijk voor de temporele eisen van de factoren geïntroduceerd nuttig om de wijze van levering verbeteren. Bijvoorbeeld, als BAF60C en MyoD zijn alleen vereist voor short tijd &quot;kick&quot; cellen in de juiste richting, werkwijzen op basis van gemodificeerde mRNA aflevering kunnen worden toegepast. Wanneer daarentegen de elementen nodig voor een langere tijd voordat de cellen hun endogene eiwitten exploiteren, een episomaal aanpak worden aanbevolen om variabiliteit en ongecontroleerde effecten door integratie in het genoom voorkomen. Tot slot merken wij op dat het verplicht is om BAF60C kenbaar maken vóór of tegelijk als MyoD (nooit na) om hESC conversie behalen in skeletspieren. De vereiste van een voorafgaande uiting van BAF60C vermoedelijk vertrouwt op zijn rol in de pre-setting de epigenetische landschap voor een goede MyoD chromatine distributie via het genoom 6,15. Als zodanig kan de toekomstige protocollen worden verbeterd door stoffen of andere manipulaties die BAF60C expressie in hESCs bevorderen.

Vanwege hun unieke vermogen om zichzelf te vernieuwen met behoud pluripotency worden menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) beschouwd als een bron van onschatbare waarde in de regeneratieve geneeskunde. Stamcel-gemedieerde herbevolking van zieke spieren en hESC-of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide generatie van skeletspieren voor in vitro ziektemodel zijn de belangrijkste doelen van studies gericht op het identificeren behandelingen en het ophelderen van de pathogenese van vele neuromusculaire ziekten. Echter, deze studies zijn uitgedaagd door de weerstand van hESC &#39;s om te zetten in de skeletspier cellen en door het gebrek aan informatie over de moleculaire regulatie van hESC-inzet in de richting van het skelet myogenese. Inderdaad, eerdere pogingen om de skeletspieren voorlopers genereren uit hESCs blijkt dat slechts embryoid lichaam (EB)-afgeleide nakomelingen of mesenchymale cellen zijn bevoegd om het skelet myogenesis volgende ectopische expressie van transcriptieactivatoren (activeren bv.Pax3 of Myf5) 1-3 of door blootstelling aan specifieke kweekomstandigheden 4-5. We hebben eerder aangetoond dat de component SWI / SNF, BAF60C (gecodeerd door SMARCD3), is een essentieel onderdeel van het transcriptieapparaat dat MyoD-gemedieerde activatie van spier-specifieke loci 6 toelaat. We hebben onlangs ontdekt dat de selectieve geen BAF60C verleent op hESCs de weerstand tegen MyoD gemedieerde activering van skelet myogenesis 7 die anders wordt waargenomen in BAF60C expressie somatische cellen 8-10, een proces gewoonlijk aangeduid als myogene conversie. Gedwongen expressie van BAF60C stelt MyoD om skelet myogenesis direct activeren in hESCs, op specifieke kweekomstandigheden, met BAF60C en MyoD het opleggen van een epigenetische handtekening die hESCs begaat jegens de myogene lijn 7. Van de nota, vorige proteomics analyse bleek de selectieve afwezigheid van BAF60C onder de SWI / SNF componenten in SER 11. We gebruikten deze kennis een epigenetische inzet van hESCs leggen op de myogene lineage, leidt tot de vorming van een homogene populatie van skeletmyoblasten die kunnen worden samengevoegd om driedimensionale vormen contractiele structuren (myospheres) die functioneel nabootsen geminiaturiseerde skeletspieren 7. inderdaad onze werkwijze voor het genereren skeletspier progenitoren hESCs voert de epigenetische inzet van hESCs de myogene lijn, die fenotypisch tot latente cellen worden blootgesteld aan differentiatiesignalen, zoals mobiele aggregatie en cultuur in differentiatie medium (zie specifiek protocol). Deze strategie maakt de uitbreiding van een homogene populatie van hESCs die epigenetisch zich inzetten voor skeletspieren afstamming en geschikt om de vorming van drie-dimensionale contractiele myospheres dat histologische en functionele eigenschappen van het skelet recapitulerenspieren. De myospheres bieden het eerste bewijs van geminiaturiseerde spieren exploiteerbare voor een &quot;ziekte in een schotel&quot;-model van spierziekten. Wanneer gegenereerd van patiënt afgeleid iPSCs, deze myospheres hebben het potentieel om langdurige ontwikkelings vragen verhelderen en de pathogenese van zeldzame ziekten, naast het aanbieden van het enorme potentieel als een instrument voor high throughput screening van therapeutische verbindingen. We merken ook op dat een directe uitlezing van myosphere analyse zou worden door immunohistochemie op punten, zoals beschreven in een Jupiter protocol Gomes et al.. 12

<table><tbody><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>6-well low attachment plate</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>GFR Matrigel</td><td>BD Biosciencies</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>MEFs (growth arrested)14</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Invitrogen</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>1 mM L-glutamine (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>ITS Liquid Media Supplement</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>N2-supplement&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>HS</td><td>Invitrogen</td><td>16050114</td><td></td></tr><tr><td><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES Cell Cloning &amp; Recovery Supplement</a></td><td>Stemgent</td><td>01-0014-100</td><td></td></tr><tr><td>bfgf</td><td>Sigma</td><td>4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyoD</td><td>BD Biosciences</td><td>554130</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyHC</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Anti-myogenin</td><td>DSHB</td><td>F5D</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie myospheres van hescs door epigenetische herprogrammeren

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generatie van een homogene en overvloedige bevolking van spiercellen van humane embryonale stamcellen (hESCs) is een vereiste voor celtherapieën en een &quot;ziekte in een schotel&quot; model van menselijke neuromusculaire ziekten. Belangrijke hindernissen, zoals een lage dichtheid en heterogeniteit van de bevolking van belang, evenals een gebrek aan protocollen voor de vorming van drie-dimensionale contractiele structuren, zijn de toepassingen van stamcellen beperkt voor neuromusculaire aandoeningen. We hebben een protocol dat deze grenzen overwint door ectopische introductie van bepaalde factoren in hESCs ontworpen - de bepaling spier factor MyoD en SWI / SNF chromatine remodeling complex component BAF60C - die in staat zijn om hESCs herprogrammeren in skeletachtige spiercellen. Hier beschrijven we het protocol opgericht om hESC afgeleide myoblasts genereren en hun clustering te bevorderen tot driedimensionele geminiaturiseerde structuren (myospheres) die functioneel mimic geminiaturiseerde skeletspieren 7 </sup&gt;.

Figuur 1A toont een schema van het protocol voorgesteld om myospheres genereren uit hESCs. De kritische stappen besturen (aangeduid door de pijlen) zijn de efficiëntie van de infectie in hESCs en myogene bewerking in de myospheres. In onze experimenten benutten we een lentivirale vector die codeert BAF60C dat GFP-fluorescentie draagt. We meestal infecteren de cellen met BAF60C en FACS-sort 72 uur na de infectie te verrijken voor de bevolking uitdrukken BAF60C. Wanneer de cellen bereiken rond 70-80% van samenvloeiing, we besmetten met MyoD lentivirus. Na de eerste infectie duurt gewoonlijk twee of drie dagen voor de cellen die confluentie bereiken. Figuur 1B toont expressie van de exogene genen voudige inductie ten opzichte hESCs niet geïnfecteerd. Figuur 1C toont de expressie en verdeling op het eiwitniveau van de factoren geïntroduceerd. BAF60C<html> expressie wordt weergegeven als GFP fluorescentie, terwijl MyoD expressie wordt gedetecteerd door immunofluorescentie met een MyoD antilichaam. Wij beschouwen Dag 0 de dag beginnen we de differentiatie van geïnfecteerde hESCs in EB-aggregaten. Na 15 dagen in DM medium, wordt een gedeelte van de myospheres (meestal een volledig goed) ingebed in OCT verbinding 12 en deelbaar te immunofluorescentie voeren voor myogene markers myogene omzettingsrendement controleren. Figuur 1D toont representatieve kleuring voor myogenin en myosine zware keten optimale myogene differentiatie. Myospheres kunnen andere of ongebruikelijke vormen hebben, wellicht als gevolg van fusie met kleinere myospheres. Vanaf dag 10, is het mogelijk om sporadische krimp observeren in de myospheres (zie filmpje 1 en 2). 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. A) Schematische weergave van het protocol voor het genereren van myospheres van hESCs. B) mRNA niveaus van exogene genen in hESCs geïnfecteerd met BAF60C en MyoD (H9-BM) gevolgd met qRT-PCR en uitgedrukt als voudige inductie, zoals vergeleken met geïnfecteerde hESCs bespotten (H9-ctr). C) Immuunfluorescentie beelden die MyoD kleuring (rood) en BAF60C fluorescentie (groen) als gevolg van de IRES-GFP element in de vector. D) Immunofluorescentie uitgevoerd op myosphere secties gekleurd voor myogenin (MYOG ), zware keten van myosine (MyHC) en tegengekleurd voor DAPI (zie Immuunfluorescentie details). Schaal bar is 100 micrometer. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> Figuur 2. Representatieve Foto Celweergave in verschillende stadia van deprotocol van de infectie (deel I) aan de differentiatie (deel II). Schalingsbalk 100 urn. Overwegende dat de EB-achtige structuren van d1 tot d5 zijn meestal rond van vorm (D), myospheres gegroeid meer dan 15 dagen volgens het schema in figuur 1A presenteren een onvoorspelbare vorm en zijn heterogeen in cultuur; Twee voorbeelden in E en F.

Hier beschrijven we een protocol gebaseerd op epigenetische herprogrammering van menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) in de richting van het genereren van een homogene populatie van de skeletspieren voorlopers die onder permissieve cultuur omstandigheden vormen driedimensionale clusters van samentrekkende spiervezels (myospheres), die biologische kenmerken van de menselijke recapituleren skeletspieren.

Generatie Myospheres Van hESCs door Epigenetische herprogrammeren

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van myos-sferen: EB-achtige structuren bestaande uit skeletspiercellen afgeleid van menselijke embryonale stamcellen. Dit wordt bereikt door de cellen te herprogrammeren via lentivirale infectie met Baf 60 C. De tweede stap van de procedure is om dezelfde cellen te infecteren met een tweede virus, het myo D-lentivirus.De geïnfecteerde cellen worden vervolgens gedurende vijf dagen in een op serum gebaseerd kweekmedium gestimuleerd om EB-achtige aggregaten te vormen. Vervolgens wordt het EB-medium vervangen door een serumvrij differentiatiemedium en worden de aggregaten nog twee weken verder gekweekt tot myosferen. Ten slotte wordt immunofluorescentie gebruikt om coupes van de in OCT ingebedde aggregaten te visualiseren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge opbrengst bij de degeneratie van skeletspiercellen die, net als afgeleiden van mesenchymale of mesodermale progenitoren, geen sortering vereist en daarom compatibel is met een driedimensionaal cultuursysteem. Voeg de dag vóór de infectie van menselijke embryonale stamcellen in zeswells-platen het human embryonic stem cell cloning and recovery supplement toe aan het medium bij 1000 x voor een uiteindelijke concentratie van 2 µM. Infecteer de menselijke embryonale stamcellen de volgende dag met high titer bath 60 CGFP lentivirus. Dissocieer eerst een well met cellen tot een suspensie van enkelvoudige cellen door één milliliter trypsine toe te voegen en de plaat vijf minuten te incuberen. Verzamel vervolgens de suspensie en breng deze over naar een 15 milliliter buis.Voeg negen milliliter van het bereide medium toe en centrifugeer de cellen 5 minuten lang bij 1.200 RPM terwijl u wacht op een milliliter mt. SIR, one. Voeg polybrain toe tot een eindconcentratie van 6 µg/mL en het herstelsupplement voor menselijke embryonale stamcellen bij 2 µM.Resuspendeer vervolgens de cellen in deze oplossing en breng ze over naar een enkele put van een six-well low attachment plate. Voeg nu het geconcentreerde bath 60 C-virus toe met een multiplicity of infection van 100 miljoen. Incubeer de plaat gedurende drie uur met het virus.Verzamel vervolgens de cellen en verdeel deze over twee met matrigel gecoate putjes van een plaat. Voeg aan elk putje twee milliliters mt, SIR toe, waarvan één met een supplement van twee micromolair, en incubeer de cellen vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C. Vervang de volgende dag het medium door vers medium.De cellen zullen na 48 uur na het begin van de infectie al geclusterd lijken te zijn. Controleer de fluorescentie om de infectie-efficiëntie te evalueren. Ga door met de dagelijkse mediumverversingen totdat de cellen een confluentie van 80% hebben bereikt, dissocieer vervolgens de cellen en voeg het myo D-virus toe aan de cellen volgens hetzelfde protocol.Houd de geïnfecteerde cellen in stand met dagelijkse mediumwisselingen totdat ze de dag voor dit groeipunt een confluentie van 80% bereiken. Zaai MES uit op met matrigel gecoate platen tegen 1000 cellen per vierkante centimeter om de geïnfecteerde cellen over te brengen naar de ME'S-plaat. De volgende dag.Gebruik trip ALI om ze te dissociëren en breng de cellen over naar een buis van 15 milliliter. Voeg negen milliliter medium voor menselijke embryonale stamcellen toe en centrifugeer deze. Gebruik 1.200 RPM gedurende vijf minuten.Resuspendeer de gepelletteerde cellen in zes milliliters vers menselijk embryonaal stamcelmedium. Verwijder nu het medium uit twee platen met mes en voeg de geïnfecteerde cellen hieraan toe. Incubeer de cellen gedurende enkele dagen.Zodra een confluentie van 80% is bereikt, wordt al het medium verwijderd en wordt één milliliter collagenase IV toegevoegd. Voeg na vijf minuten incubatie in collagenase bij 37 °C één milligram per milliliter toe.Vervang de collagenase door één milliliter medium voor menselijke embryonale stamcellen. Schraap vervolgens de kolonies onder een dissectiemicroscoop los met een 10 milliliter pipetpunt, breng de kolonies over naar een 15 milliliter buis en laat ze bezinken. Verwijder na drie minuten het supernatant en resuspendeer de cellen in medium voor menselijke embryonale stamcellen.Zaai vervolgens de cellen in een verhouding van één op vier uit op meth-platen. Voor deze procedure moeten de geïnfecteerde cellen in een hoog aantal aanwezig zijn en kwalitatieve kolonies hebben gevormd. Verwijder het medium uit elke put en voeg één milliliter collagenase IV toe.Voeg een concentratie van één milligram per milliliter toe zoals voorheen, en stop de collagenasereactie na vijf minuten door deze te vervangen door EB-medium. Gebruik vervolgens snel een microscoop om de koloniën weg te schrapen. Met behulp van een 10 milliliter pipetpunt is het mogelijk om de cellen te dissociëren in kleine celklonten.Verzamel deze aggregaten in een buis van 15 milliliter en verwijder, nadat ze ongeveer drie minuten hebben bezonken, het supernatant. Resuspendeer de cellen in drie milliliter EB-medium en breng alles over naar een enkele put van een six well low attachment plate. Incubeer deze plaat een nacht en controleer ze de volgende dag op grote koloniefragmenten.Indien er aggregaten worden gevonden, breek deze dan op door ze een paar keer door een pipet van vijf milliliter te laten vloeien. Als er veel individuele cellen drijven, verzamel de aggregaten dan door sedimentatie en vervang het medium door vers EB-medium.Vervang het medium om de dag na vijf dagen cultiveren. Verzamel de celaggregaten en was deze één keer met twee milliliters PBS, waarbij de cellen onder normale zwaartekracht mogen sedimenteren. Vervang vervolgens het PBS door drie milliliters DM-medium en breng de cellen voor de volgende 15 cultuurdagen terug in dezelfde putjes van de plaat.Vervang het medium elke drie dagen. Gedurende deze tijd zullen mesosferen worden gevormd. Humane embryonale stamcellen werden geïnfecteerd met batch 60 C die GFP-fluorescentie draagt.Na 72 uur werden de cellen via FACS gesorteerd. Cellen die BAF 60 C tot expressie brachten, werden gekweekt tot een confluentie van ongeveer 75% en vervolgens geïnfecteerd met myo D lentivirus. Exogene genexpressie werd in de geïnfecteerde cellen gedetecteerd middels kwantitatieve real-time PCR.De expressie en distributie op eiwitniveau werden onderzocht. Vervolgens komt GFP overeen met de expressie van baf 60 C, en een myo D-antilichaam werd gebruikt om de expressie van myo D te controleren. 15 dagen nadat de menselijke embryonale stamcellen begonnen met het vormen van EB-achtige aggregaten.Een deel van de myos-sferen werd ingebed in OCT-compound en gesneden; de coupes vertoonden een positieve kleuring voor myogene markers en myosin heavy chain markers. Vanaf dag 10 was het mogelijk om sporadische contracties in de myos-sferen waar te nemen. Sommige myos-sferen kregen verschillende of ongebruikelijke vormen, mogelijk als gevolg van fusie tussen myos-sferen.Deze techniek zal het onderzoek in het veld van ziektemodellering en therapie bevorderen, omdat myosferen kunnen worden gegenereerd uit pluripotente stamcellen van patiënten met verschillende spierziekten. Om die reden bieden myosferen een in vitro ziektemodel dat geschikt is voor drugscreening en het bestuderen van de pathogenese van ziekten.

generation-of-myospheres-from-hescs-by-epigenetic-reprogramming

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont de procedure voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van induceerbare lentivirus die uitdrukken Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4.

Het genereren van iPS Cellen van MEF door gedwongen Expressie van Sox-2, okt-4, c-Myc en Klf4

We presenteren een protocol voor een efficiënte herprogrammering van menselijke somatische cellen in het menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met behulp van retrovirale vectoren die coderen voor Oct3 / 4, Sox2, Klf4 en c-myc (OSKM) en de identificatie van de opnieuw aangeleerd hiPSC door live kleuring met Tra- 1-81 antilichaam.

Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

Muis embryonale fibroblasten kunnen met lage efficiëntie worden gereprogrammeerd tot geïnduceerde pluripotente stamcellen door de geforceerde expressie van transcriptiefactoren Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. De zeldzame tussenproducten van de herprogrammeringsreactie worden via FACS geïsoleerd door middel van labeling met antilichamen tegen celoppervlaktemarkers Thy-1.2, Ssea-1 en Epcam.

Celoppervlaktemerker Mediated Zuivering van iPS Cell Intermediates van een Herprogrammeerbare muismodel

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed met behulp van een episoom gebaseerd herprogrammering strategie en histondeacetylaseremmers.

Efficiënte iPS Cell Generation van Blood behulp episomen en HDAC-remmers

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Het hier beschreven protocol beschrijft de inductie van een hemogenetisch programma in muis embryonale fibroblasten via overexpressie van een minimale set transcriptiefactoren. Deze technologie kan worden toegepast op het menselijk systeem om platforms te bieden voor toekomstig onderzoek naar hematopoëse, hematologische ziekten en hematopoietische stamceltransplantatie.

Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor efficiënte generatie van integratievrije iPSC's uit menselijke volwassen perifere bloedcellen. Met behulp van vier oriP/EBNA-gebaseerde episomale vectoren om de herprogrammeringsfactoren, KLF4, MYC, BCL-XL, of OCT4 en SOX2 tot expressie te brengen, kunnen duizenden iPSC-kolonies worden verkregen uit 1 mL perifeer bloed.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Dit protocol demonstreert de inductie van een hemogeen programma in menselijke dermale fibroblasten door afgedwongen expressie van de transcriptiefactoren GATA2, GFI1B en FOS om hematopoietische stam en voorlopercellen te genereren.

Hemogene herprogrammering van menselijke fibroblasten door afgedwongen expressie van transcriptiefactoren

Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen. Deel 1 van 3.

Van MEF op I Matrigel: passage hESC &#39;s in de aanwezigheid van MEFs

Leer myosferen genereren van hESCs door epigenetische herprogrammering met lentivirale infectie van Baf 60 C en Myo D. Deze methode produceert contractiele spiervezels voor onderzoek naar spierbiologie.

Generatie Myospheres Van hESCs door Epigenetische herprogrammeren

Meer video's verkennen