Name: Spiraalvormige Organisatie van Blood stollingsfactor VIII op Lipid nanobuisjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Leer de structuur van bloedstollingsfactor VIII op lipid nanobuisjes te bepalen met cryo-elektronenmicroscopie. Deze methode combineert helikale organisatie met 3D-reconstructie voor inzicht in membraangebonden eiwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door een Nationaal Scientist Development subsidie ​​van de American Heart Association: 10SDG3500034 en UTMB-NCB beginnen te SodM up fondsen. De auteurs erkennen de Cryo-EM en Scientific Computing faciliteiten op het Sealy Center for Structural Biology bij UTMB ( <a href="http://www.scsb.utmb.edu">www.scsb.utmb.edu</a> ), evenals Drs. Steve Ludtke en Ed Egelman voor hulp bij de 2D-en 3D spiraalvormige reconstructie algoritmen.

1. Monstervoorbereiding <ol><li> Bufferuitwisseling humane FVIII-BDD 14 en varkens-FVIII BDD 15 tegen HBS-Ca-buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH = 7,4) en concentreer tot 1,2 mg / ml. Houd de eiwitoplossing bij -80 ° C. </li><li> Bereid lipide nanotubes (LNT) door mengen galactosylceramide (GC) en fosfatidylserine (PS) en 1:04 w / w ratio chloroform. Damp het chloroform onder argon en de lipiden oplosbaar in HBS-buffer tot 1 mg / ml. Houd de LNT oplossing bij 4 ° C. </li></ol> 2. Cryo-elektronen microscopie van FVIII-LNT <ol><li> Cryo-EM Monsterbereiding <ol><li> Gloedlossing de 300 mesh Quantifoil R2 / 2 koperen roosters (carbon kant naar boven) in een mengsel van O 2 en H 2 gas voor 10 sec bij 50 W. </li><li> Meng de FVIII en LNT oplossingen HBS-buffer Ca 1:1 w / w ratio en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Breng een druppel van 2,5 ulvan FVIII-LNT monster naar de hydrofiele elektronenmicroscopie rooster in de Vitrobot Mark IV vochtige kamer (100% luchtvochtigheid). </li><li> Blot en flits bevriezen de grid (een vlek voor 3,5 sec, vlek kracht 1) in vloeibare C 2 H 6, afgekoeld door vloeibare N 2 tot amorfe ijs te verkrijgen. </li><li> Store roosters in opbergdozen onder vloeibare N2 (LN2). </li></ol></li><li> Cryo-EM Data Collection OPMERKING: De JEM2100-LaB6 (2010) is voorzien van een TEMCON besturingssysteem bestaat uit een computer met elektronenmicroscoop, een scherm met ramen lezen vacuümsysteem, verlichtingssysteem, HT, lens stromen en zo-on en twee panelen: links en rechts, geplaatst aan beide zijden van de kolom. De bundel verschuiving X, Y knoppen (SHIFT Y, SIFT Y) en de multifunctionele (DEF / STIG) knoppen zijn op beide panelen. Op het linker paneel is de verlichting (omhoog dimmen) knop. Op het paneel rechts: de vergroting (MAG / CAM LENGTH) en scherpstelling (FOCUS) knoppen en de drie imaging (MAG1, mag2, LOWMAG) en een diffractie (DIFF) modi knoppen. We krijgen onze data in MAG1 bij alpha 2. De minimale dosis belichtingcondities (MDS) vereist voor Cryo-EM data-acquisitie worden ingesteld met F1 tot en met F6 knoppen, bovenste rij op rechter paneel. In dit protocol de generieke instellingen worden gebruikt: F1 - hoger / lager scherm, F2 - ZOEK-modus, F3 - FOCUS mode, F4 - FOTO-modus, F5 - MDS OFF / ON en F6 - BEAM BLANK, gebruikt om het monster te beschermen tegen straling beschadigen afbuigen van de bundel. <ol><li> Plaats de cryo-houder in de cryo-station en vul de Dewar van de houder en de cryo-station met LN2. Wanneer de temperatuur bereikt -192 ° C, open blind op de houder tip, plaats eerder bevroren Cryo-EM rooster in de daarvoor bestemde plaats en beveiligen met een ring klem. </li><li> Plaats de cryo-houder in de elektronenmicroscoop. Vul het Dewar van de cryo-houder en de anti-Contaminator kamer met LN2. Wacht totdat de houder te stabiliseren gedurende 30-60 minuten. Druk op F6 op enzet de gloeidraad op. Als de gloeidraad verzadigd is, drukt u op F6 uit en open blind op de houder aan het net te bekijken. </li><li> Druk Lage Mag / alpha 1 (vastgesteld op 200X mag) en lokaliseren gebieden met dun ijs op de grid. </li><li> Schakel naar MAG 1/alpha 2 tot minimale dosis (MDS) in te stellen en het verwerven van Cryo-EM gegevens bij lage elektron doses, zonder beschadiging van het monster. <ol><li> Druk op F2 om onderzoek in te stellen. Stel vergroting op 40.000 x. Vergroten bundel met brigtness knop om minimale elektron dosis ~ 0,04 e - / Å 2 · s. Druk DIFF om naar diffractie modus. Zet camera lengte tot 120 cm met MAG / CAM LENGHT knop. Toon gebieden op het rooster binnen de vooraf geselecteerde gebieden in LOWMAG dat lipide nanobuisjes in de gaten van de koolstoffilm hebben. </li><li> Druk op F4 om de fotomodus vastgesteld op 40.000 X vergroting en stel belichting met HELDER knop bij doses van 16-25 e - / Å 2 · s. Druk Standaard Focus om de scherpte-voorwaarden te stellen het aanpassen van de Z-hoogtevan het monster met de Z-UP / DOWN (RECHTS bedieningspaneel). Stel defocus tussen -1,5 en -2,5 urn. </li><li> Lijn SEARCH en FOTO modus door het tekenen van een plein in het venster Live View op de digitale camera-monitor in ZOEK-modus die overeenkomt met het gebied dat moet worden afgebeeld in de fotomodus. </li><li> Druk op F3 om Scherpstelinstelling vastgesteld op 100.000 X vergroting. Focus verlichting aan de CCD-chip dekken (~ 4-5 cm straal) en de as af te bestralen gebied af te beelden in de fotomodus. Pas defocus te ~ -1.5 en -2.5 urn met de FOCUS knop en correct voor astigmatisme van het beeld met DEF / STIG knoppen. </li></ol></li><li> Selecteer de FVIII-LNT in ZOEK-modus af te beelden door het verwerven van live beelden in het venster Live View op de digitale camera. Centreer de FVIII-LNT op het plein getrokken op de LIVE VIEW venster. </li><li> Neem een ​​digitaal beeld op de CCD camera bij 52.000 X effectieve vergroting en 0,5 sec belichting door te schakelen naar de fotomodus en te klikken op de AcquirE-knop op de digitale microscoop camera monitor. Het beeld acquisitie voorwaarden worden gesteld, zoals de bundel blanco (SHUTTERS) alleen open wanneer het beeld wordt verkregen in de fotomodus. </li><li> Controleer de kwaliteit en defocus van de verworven afbeelding door op CTRL-F om het verkrijgen van een Fast Fourier Transform (FFT). </li></ol></li></ol> 3. 3D reconstructie OPMERKING: De beeldanalyse software die wordt gebruikt voor de 2D-en 3D-analyse: EMAN2 en IHRSR zijn vrij beschikbaar. EMAN2 kan worden gedownload van http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. De IHRSR software kan worden verkregen van professor Egelman: egelman@virginia.edu. De uiteindelijke IHRSR verfijningen worden uitgevoerd op de Texas Advanced Computing centrum cluster: http://www.tacc.utexas.edu/ aan de Universiteit van Texas, Austin. De 3D-reconstructie-algoritme zoals afgebeeld op figuur 1 bestaat uit twee stappen: eerste de keuze van een homogene reeks spiraalvormige segmenten (deeltjes) met de 2D verwijzing gratis alignment (RFA) algoritmen geïmplementeerd in EMAN 2, tweede bereiken van een 3D-reconstructie op basis van de spiraalvormige parameters en terug projectie algoritmen opgenomen in IHRSR. De eerste stap maakt gebruik van de ontwikkelde voor het selecteren van homogene deeltjes sets voor 3D-reconstructie met Single Particle SPA (algoritmes) waarvoor EMAN2 is specifiek ontwikkeld en verspreid programma: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Deze stap is aangepast aan de cryo-EM gegevens. De tweede stap wordt bereikt met de IHRSR algoritme, dat specifiek is voor het type spiraalvormige samenstellingen verkregen met de recombinante Factor VIII vormen. Dit algoritme is uitgebreid gedocumenteerd door de wetenschappelijke literatuur 12. <ol><li> Voer 2D beeldanalyse met de EMAN2 wetenschappelijke beeldverwerking suite: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 tot homogene deeltjes (spiraalvormige segment) sets voor spiraalvormige reconstructie selecteren. <ol><li> Selecteer Cryo-EM micro-opnamen met straight en goed georganiseerde spiraalvormige buizen met de digitale camera software en visualisatie tools. </li><li> Omkeren, normaliseren en het filter voor X-ray pixels in de e2workflow.py GUI, enkel deeltje reconstructie optie (spr): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager </li><li> Importeer het omgekeerde, genormaliseerd en X-ray pixel gefilterde beelden in de e2helixboxer.py GUI. Selecteer FVIII-LNT spiraalvormige buizen en segment op 256 x 256 pixels (2.9 Å / pix) met 90% overlap met: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer </li><li> Evalueer de onscherpte van de oorspronkelijke micro-opnamen en het contrast transfer functie (CTF) correctie (alleen fase correctie) van toepassing op de spiraalvormige segmenten van dezelfde micro-opnamen met de e2ctf.py optie opgenomen in het e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf. </li><li> Genereer initiële deeltjes (spiraalvormige segmenten) stelt in de e2workflow.py GUI - SPR optie: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow. </li><li> Bereken 2D klasse gemiddelden met de e2refine2d.py algoritme toepassen verwijzing gratis k-gemiddelde classificatie homogene datasets met dezelfde LNT en de mate van spiraalvormige orde (figuur 2) diameter selecteren, volgt het script: &#39;e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - ingang = INPUT.hdf - NCLs = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = fase - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = gemiddelde - normproj-classkeepsig &#39;, de NCLs waarde dienovereenkomstig te veranderen. <ol><li> Classificeren de in &#39;NCLs = 151&#39; 150 klassen over 8 iteraties met &#39;classkeep = 0,8&#39; eerste gegevens, wat betekent dat deeltjes met minder dan 80% gelijkenis met de klasse gemiddelde zijn uitgesloten van de betreffende klasse. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d </li><li> Deeltjes samenvoegen van klasgemiddeldenmet uitgesproken spiraalvormige diffractie in e2display.py tussenliggende dataset te creëren. </li><li> Classificeren van de set in 50 klassen &#39;NCLs = 51&#39; naar klassen met dezelfde diameter en de mate van orde differentiëren tussenliggende data. </li><li> Deeltjes samenvoegen van klassen met dezelfde diameter en de mate van orde in e2display.py om de uiteindelijke dataset voor de drie-dimensionale reconstructie te maken: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector. </li></ol></li></ol></li><li> Voer schroefvormige reconstructie met iteratief Helical Real Space Reconstruction (IHRSR) dat is beschreven in Egelman 17, 18. <ol><li> Schatten de opkomst, Az (A) van de FVIII-LNT helix uit de gecombineerde Fourier-transformatie van de deeltjes in de uiteindelijke dataset. </li><li> Definieer de azimuthoek ΔΦ (º) door het uitvoeren van parallelle IHRSR verfijningen met een constante Az, toenemende ΔΦ van 576; tot 60 ° in stappen van 5 °. </li><li> Run 100 opeenvolgende IHRSR cycli voor elk laatste set met een karakterloze cilinder als een eerste volume en de eerste spiraalvormige parameters Az en ΔΦ zoals gedefinieerd in 3.2.1 gegevens. en 3.2.2. </li><li> Inspecteer de laatste delen van convergentie van de spiraalvormige parameters en de correspondentie tussen klasse gemiddelden van de 2D-indeling van de uiteindelijke dataset en de projecties van de uiteindelijke IHRSR reconstructie. </li><li> Impose symmetrie de definitieve 3D-reconstructies, overeenkomend met de asymmetrische eenheid verdeling waargenomen in de definitieve asymmetrische 3D-volumes: 4-voudig voor de humane FVIII-LNT en 5-voudig voor varkens FVIII-LNT. Voer nogmaals een 100 verfijning cycli tot een uiteindelijke symmetrized 3D reconstructie te genereren. </li><li> Bereken de Fourier Shell Correlatie curve voor beide volumes door eerst het scheiden van de overeenkomstige gegevens in even en oneven: &#39;e2proc2d.py &lt;infile&gt; &lt;outfile&gt; - split = 2 &#39;. Dan start 100 IHRSR opeenvolgende verfijningen zoals beschreven in 3.2.3. Bereken de FSC van de 3D-volumes gemaakt op basis van de even en oneven datasets: &#39;e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc&#39;. </li></ol></li><li> Visualiseren en Segment de FVIII-LNT volumes in UCSF hersenschim. </li><li><ol><li> Open de laatste delen van stap 3.2.5. in UCSF Chimera en zet de contour niveau tot 0,005 in het TOOLS&gt; datavolume&gt; Volume Viewer optie. </li><li> In TOOLS&gt; datavolume&gt; SEGMENT MAP, select volume in SEGMENT tabblad kaart en klik op segment segment het volume. </li><li> Segmenten groep die overeenkomt met een eenheid cel door te selecteren met CTRL + SHIFT en klikken groep. </li><li> Kleur de segmenten door eenheidscel en Helix met ACTIES&gt; COLOR optie om de structurele kenmerken te benadrukken. </li></ol></li></ol> 4. Electron tomography <ol><li> Negatief gekleurde FVIII-LNT Monsterbereiding <ol> &lt;li&gt; Bereid FVIII-LNT monsters voor de Cryo-EM-experimenten. </li><li> Glimontladingen koolstof beklede 300-mesh koperen rooster (carbon naar boven) in een mengsel van O2 en H2-gas gedurende 10 seconden bij 50 W als voor Cryo-EM experimenten. </li><li> Breng een druppel van 2,5 ul FVIII-LNT ophanging met 6-nm colloïdaal goud nanodeeltjes aan het net, dep de overtollige vloeistof en negatief vlekken door het toepassen van 5 pi 1% uranylacetaat oplossing gedurende 2 minuten. Dep de overtollige vloeistof en lucht drogen het rooster. </li></ol></li><li> Elektronentomografie Data Collection <ol><li> Breng het rooster in de interne tilt houder. </li><li> Plaats de houder in de elektronenmicroscoop. </li><li> Verzamel tilt serie automatisch met de SerialEM software 19 bij 2 ° stappen over een hoek van -60 ° tot +60 ° en beelden opnemen met een CCD-camera bij 52.000 X effectieve vergroting, -6 tot -10 urn defocus en elektronen dosis van 150 - 170 electrons / Å 2 · s per tomogram. </li></ol></li><li> Elektronentomografie Reconstructie van FVIII-LNT Opmerking: Reconstrueer de pFVIII-LNT en hFVIII-LNT gekanteld serie verworven in 4.2. met de optie ETomo van de IMOD software volgt de tutorial: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html <ol><li> Met behulp van een terminal venster, open het tomogram in 3DMOD. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html. </li><li> Bin het tomogram door 4 met de IMOD BINVOL gebieden de omvang van het tomogram verminderen. </li><li> Kies de juiste hoek met de lipide nanobuis langs de Y-as in de binned tomogram met de opdracht IMOD ROTATEVOL roteren. </li><li> Draai de volledige tomogram met het commando IMOD ROTATEVOL. </li><li> Snijd de geselecteerde lipide nanobuis georiënteerd langs de Y-as met de IMOD CLIP AFM.WIJZ commando. </li><li> Open de bijgesneden sub-tomogram met 3DMOD. </li><li> Klik op de tomogram naar de regeling van factor VIII-moleculen samen te visualiserenDe segmenten in Z-as en langs de Y-as in de sub-tomogram volume. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Realizing+the+potential+of+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Realizing the potential of electron cryo-microscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).</li>
<li>Fujiyoshi, Y., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+crystallography+of+proteins+in+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Electron crystallography of proteins in membranes.</a> Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).</li>
<li>Toole, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+cDNA+encoding+human+antihaemophilic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor.</a> Nature. 312, 342-347 (1984).</li>
<li>Fay, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factor+VIII+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+hematology%22%5BJournal%5D)">Factor VIII structure and function.</a> International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).</li>
<li>Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+membrane-bound+factor+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Domain organization of membrane-bound factor VIII.</a> Biopolymers. , (2013).</li>
<li>Pipe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemophilia%3A+new+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+%2F+the+Education+Program+of+the+American+Society+of+Hematology.+American+Society+of+Hematology.+Education+Program%22%5BJournal%5D)">Hemophilia: new protein therapeutics.</a> Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).</li>
<li>Gatti, L., Mannucci, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+porcine+factor+VIII+in+the+management+of+seventeen+patients+with+factor+VIII+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies.</a> Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).</li>
<li>Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+coagulation+Factor+VIII+bound+to+lipid+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes.</a> Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).</li>
<li>Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+recombinant+human+coagulation+factor+VIII+to+lipid+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes.</a> FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).</li>
<li>Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+urease+activates+blood+platelets+through+a+lipoxygenase-mediated+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+and+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway.</a> Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).</li>
<li>Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+crystallization+of+soluble+and+membrane+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins.</a> Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).</li>
<li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+helical+filaments+and+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of helical filaments and tubes.</a> Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).</li>
<li>Lusher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+introduction+of+recombinant+factor+VIII--a+clinician%27s+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Haemophilia+%3A+the+official+journal+of+the+World+Federation+of+Hemophilia%22%5BJournal%5D)">Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience.</a> Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).</li>
<li>Thim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+new+recombinant+factor+VIII+%28N8%29%5BTitle%5D)+AND+%22Haemophilia+%3A+the+official+journal+of+the+World+Federation+of+Hemophilia%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8).</a> Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).</li>
<li>Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+expression+of+recombinant+porcine+coagulation+factor+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).</li>
<li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+algorithm+for+the+reconstruction+of+helical+filaments+using+single-particle+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods.</a> Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).</li>
<li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method%3A+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).</li>
<li>Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Dimensional+structure+of+membrane-bound+coagulation+factor+VIII%3A+modeling+of+the+factor+VIII+heterodimer+within+a+3-dimensional+density+map+derived+by+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography.</a> Blood. 99, 1215-1223 (2002).</li>
<li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financieel belang en ze kunnen direct worden benaderd over een van de gepubliceerd in dit manuscript procedures.

In dit werk een methode gepresenteerd om tussen twee membraangebonden organisaties sterk homoloog eiwit: mens en varken FVIII zelf-geassembleerde op lipide nanobuizen aangetroffen in het menselijk lichaam omstandigheden. In de beschreven procedure, zijn mens en varken FVIII succes spiraalvormig georganiseerd lipide nanobuisjes, dat is de meest kritische stap. De volgende belangrijke stap is om het monster in dunne amorfe ijs in de buurt van vloeibare N 2</sub...

Bloed stollingsfactor VIII (FVIII) is een groot glycoproteïne van 2332 aminozuren georganiseerd in zes domeinen: A1-A2-B-A3-C1-C2-3. Na activatie FVIII Trombine fungeert als cofactor voor Factor IXa bij de membraangebonden TENase complex. Binding van geactiveerde FVIII (FVIIIa) naar FIXa in een membraan afhankelijk wijze verhoogt FIXa proteolytische rendement meer dan 10 5 maal, wat essentieel is voor een efficiënte bloedstolling 4. Ondanks de belangrijke rol speelt bij coagulatie FVIII en TENase complexvorming, het functionele membraan gebonden FVIII structuur nog worden opgelost. Om dit aan te pakken, hebben enkele lipide dubbellaag nanobuisjes (LNT) rijk aan fosfatidylserine (PS) kan binden met hoge affiniteit FVIII 8, 9 en lijkt het geactiveerde bloedplaatjes oppervlak ontwikkeld 10. Opeenvolgende spiraalvormige ordening FVIII gebonden aan LNT is bewezen doeltref zijnve voor de structuurbepaling van FVIII-membraan gebonden toestand door Cryo-EM 5. Gefunctionaliseerde LNT zijn een ideaal systeem om eiwit-eiwit en eiwit-membraan interacties schroeflijnvormig georganiseerde membraan geassocieerde proteïnen Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM heeft het voordeel boven traditionele structurele werkwijzen zoals röntgenkristallografie en NMR, als het monster wordt bewaard in het dichtst bij de fysiologische omgeving (buffer, membraan, pH), zonder toevoegingen en isotopen. Bij FVIII, bestuderen van de membraangebonden structuur met deze techniek is nog fysiologisch relevant, aangezien LNT lijken dicht door grootte, vorm en samenstelling van de pseudopodia van de geactiveerde bloedplaatjes waar TENase complexen assembleren in vivo. Gebreken en tekort aan FVIII oorzaak hemofilie A, een ernstige bloeden aandoening die 1 op de 5000 mannen van de menselijke bevolking 4, 6. De meeste effectieve therapie voor Hemofilie A is levenslang toedienen van recombinant FVIII (hFVIII). Een belangrijke complicatie van de recombinante FVIII Hemofilie A therapie is de ontwikkeling van remmende antilichamen tegen de menselijke vorm die ongeveer 30% van hemofilie A patiënten 13. In dit geval is fVIII van varken (pFVIII) concentraat gebruikt, omdat varkens FVIII displays laag kruisreactiviteit met remmende antilichamen tegen humane factor VIII en vormen functionele complexen met humaan FIXa 7. Vaststelling van de membraangebonden organisatie van zowel varkens en menselijke FVIII vormen is belangrijk om de structurele basis van FVIII cofactorfunctie en implicaties bloed hemostase begrijpen. In deze studie beschrijven we een combinatie van lipide nanotechnologie, Cryo-EM en structuuranalyse ontworpen om de membraangebonden ordening twee zeer homologe FVIII vormen lossen. De gepresenteerde Cryo-EM databank 3D structuren schroeflijnvormig georganiseerd Porcine en humane FVIII op negatief geladen LNT tonen het potentieel van de voorgestelde nanotechnologie als basis voor structuurbepaling van FVIII en membraangebonden stollingsfactoren en complexen in een fysiologische omgeving membraan.

<table><tbody><tr><td>JEM2100 met LaB6</td><td>JEOL Ltd.</td><td>JEM-2100</td><td>bediend op 200 kV</td></tr><tr><td>met TEMCON-software</td><td>JEOL Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gatan626 Cryo-houder</td><td>Gatan, Inc.</td><td>626.DH</td><td>gekoeld tot -175 &deg;C</td></tr><tr><td>met temperatuurregelaar</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gatan 4K x 4K CCD-camera</td><td>Gatan, Inc.</td><td>US4000</td><td>4.096 x 4.096 pixel bij 15 &mu;m/pixel fysieke resolutie</td></tr><tr><td>Solarus Model 950 plasmareiniger</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koolstof gecoate 300-mesh 3 mm koperen raster</td><td>Ted Pella</td><td>01821</td><td>plasma gereinigd gedurende 10 sec op hoog vermogen</td></tr><tr><td>Quantifoil R2/2 300 mesh</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Q225-CR2</td><td>Koolstof gecoate 300-mesh Cu rasters met 2 mm diameter gaten&nbsp;</td></tr><tr><td>Uranyl acetaat dihydraat</td><td>Ted Pella</td><td>19481</td><td>1% oplossing, gefilterd</td></tr><tr><td>Galactosyl ceramide</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>860546</td><td></td></tr><tr><td>Dioleoyl-sn-glycero-fosfo-L-serine</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>EM software Digital Micrograph</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td></tr><tr><td>EM software EMAN</td><td>gratis download</td><td></td><td><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&nbsp;</a></td></tr><tr><td>EM software Spider</td><td>gratis download</td><td></td><td><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td></tr><tr><td>EM software IHRSR</td><td>gratis download</td><td></td><td>Programma's beschikbaar van Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/</td></tr><tr><td>EM software (IMOD)</td><td>gratis download</td><td></td><td><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&nbsp;</a></td></tr><tr><td>EM software (SerialEM)</td><td>gratis download</td><td></td><td><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td></tr><tr><td>UCSF-Chimera</td><td>gratis download</td><td></td><td><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td></tr></tbody></table>

spiraalvormige organisatie van blood stollingsfactor viii op lipid nanobuisjes

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

<html> Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) 1 is een krachtige aanpak om de functionele structuur van eiwitten en complexen in een gehydrateerde toestand en membraan milieu 2 onderzoeken. Coagulatie Factor VIII (FVIII) 3 is een multi-domein bloedplasma glycoproteïne. Gebrek of tekort aan FVIII is de oorzaak voor Hemofilie type A - een ernstige bloeden stoornis. Na proteolytische activatie FVIII bindt aan de serineprotease Factor IXa op de negatief geladen bloedplaatjes membraan, dat essentieel is voor normale bloedstolling 4. Ondanks de centrale rol FVIII speelt bij de bloedstolling, structurele informatie voor zijn membraangebonden staat onvolledig 5. Recombinant FVIII concentraat is de meest effectieve middel tegen type Hemofilie A en in de handel verkrijgbaar FVIII kan worden uitgedrukt als mens of varken, beide aldus functionele complexen met humaan Factor IXa 6,7. &quot;&gt; In deze studie presenteren we een combinatie van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM), lipide nanotechnologie en structuuranalyse aangebracht op het membraan gebonden structuur van twee zeer homologe FVIII vormen lossen. Mens en varken De in ons laboratorium ontwikkelde methodologie de twee functionele recombinante FVIII vormen spiraalvormig organiseren negatief geladen lipide nanotubes (LNT) wordt beschreven. De representatieve resultaten demonstreren dat onze benadering voldoende gevoelig voor de verschillen in de schroeflijnvormige ordening tussen twee zeer homologe worden (86% sequentie identiteit definiëren ) eiwitten. Gedetailleerde protocollen voor de spiraalvormige organisatie, Cryo-EM en electron tomography (ET) gegevensverzameling krijgen. de tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) structuuranalyse toegepast op de 3D reconstructies van mens en varken vinden FVIII-LNT wordt besproken. De gepresenteerde mens en varken FVIII-LNT structuren tonen het potentieel van de voorgestelde methodologie om berekend wordene de functionele, membraan-gebonden organisatie van bloed stollingsfactor VIII, met een hoge resolutie.

Recombinant mens en varken FVIII succesvol spiraalvormig georganiseerd negatief geladen enkele dubbellaag LNT, lijkt het geactiveerde bloedplaatjes oppervlak. De schroeflijnvormige ordening van de mens en varken FVIII-LNT was consistent in de opgevangen digitale microfoto (figuur 2). De controle LNT en de mens en varken FVIII-LNT spiraalvormige buizen werden geselecteerd en gesegmenteerd met de e2helixboxer.py GUI en initiële data sets gemaakt met de e2workflow.py GUI, Single deeltje op...

We presenteren een combinatie van cryo-elektronenmicroscopie, lipide nanotechnologie en structuuranalyse aangebracht op het membraan gebonden structuur van twee zeer homologe FVIII vormen lossen: mens en varken. De in ons laboratorium ontwikkeld om de twee functionele recombinante FVIII vormen spiraalvormig organiseren negatief geladen lipide nanotubes (LNT) methode wordt beschreven.

Spiraalvormige Organisatie van Blood stollingsfactor VIII op Lipid nanobuisjes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Het algemene doel van deze procedure is om te laten zien hoe de structuur van factor VIII-helix georganiseerd op lipidennanobuizen wordt gedefinieerd door cryo-elektronenmicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst helic gezuiverde factor VIII op lipidennanobuizen te organiseren en cryo-elektronenmicroscopiegegevens te verzamelen bij vloeibare stikstoftemperatuur en lage elektronendoseringen. Vervolgens wordt de aan het membraan gebonden structuur van factor VIII berekend door enkele deeltjes en helic 3D-reconstructie-algoritmen te combineren.Vervolgens worden elektronentomografiegegevens verzameld en wordt de 3D-reconstructie gegenereerd. Uiteindelijk worden de berekende factor VIII-lipidennanobuisstructuren gevalideerd door de 3D-volumes te segmenteren en ze te vergelijken met de tomografiereconstructies. De gedemonstreerde methode kan helpen om een ​​sleutelvraag op het gebied van structurele biologie en bloedstolling te beantwoorden, zoals wat de aan het membraan gebonden organisatie van factor VIII is en hoe deze zich verhoudt tot zijn functie bij de stolling.De GM 2100 lab six is uitgerust met een TE con-besturingssysteem dat bestaat uit een computer die is aangesloten op de ele

helical-organization-blood-coagulation-factor-viii-on-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Deze studie beschrijft een nieuwe microplaat test die FV stollingsactiviteit tijdens fibrine stolselvorming in menselijk plasma die niet eerder gerapporteerd. De methode gebruikt een kinetische microplaatlezer de verandering in absorptie bij 405 nm meet continu in fibrine stolselvorming in menselijk plasma.

Meting van Factor V activiteit in humaan plasma met een Microplate coagulatietest

Dit protocol beschrijft de toepassing van gecombineerde nabij-infrarood fluorescerende (NIRF) beeldvorming en micro-computertomografie (microCT) voor het visualiseren van cerebrale thromboemboli. Deze techniek maakt de kwantificering van trombus last en evolutie. De NIRF beeldvormende techniek visualiseert fluorescent gelabelde trombus in weggesneden hersenen, terwijl de microCT techniek visualiseert trombus in levende dieren met behulp van goud-nanodeeltjes.

Gecombineerde nabij-infrarood Fluorescent Imaging en Micro-computertomografie voor het direct visualiseren Cerebral Thromboemboli

Dit artikel beschrijft een experimenteel model van hemostase die gelijktijdig meet bloedplaatjesfunctie en coagulatie. Bloedplaatjes en fibrine fluorescentie wordt gemeten in real-time en bloedplaatjesadhesie rate, coagulatie snelheid, en het begin van coagulatie bepaald. Het model wordt gebruikt voor bloedplaatjes stollingsbevorderende eigenschappen bepalen onder stroom concentraten voor transfusie.

Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time

In deze paper beschrijven we een methode om te beoordelen endothelial von Willebrand factor release en de daaropvolgende bloedplaatjes vangen onder vloeistof shear stress in reactie op inflammatoire stimuli met behulp van een in vitro kamer-stroomsysteem.

Onderzoeken van von Willebrand Factor pathofysiologie met behulp van een Flow kamer Model van von Willebrand Factor-bloedplaatjes String vorming

Solid-ondersteund, eiwit-vrij, dubbele fosfolipide dubbelgelaagde membranen (DLBM) kunnen worden omgezet in complexe en dynamische lipide nanobuis netwerken en kunnen dienen als 2D onderop modellen van het endoplasmatisch reticulum.

Spontane vorming en omlegging van kunstmatige lipide nanobuis netwerken als een Bottom-Up-Model voor endoplasmatisch Reticulum

Dit protocol beschrijft een proces voor het fabriceren van lipide nanobuisnetwerken met behulp van glijdende kinesinemotiliteit in combinatie met gigantische unilamellaire lipideblaasjes.

Multi-Component Lipid Nanotube Networks fabriceren met behulp van de Gliding Kinesin Motility Assay

We presenteren een in vitro vasculaire ziekte model om hele bloed interacties met patiënt-afgeleide endotheel te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om tromboogene eigenschappen van primaire endotheelcellen onder verschillende omstandigheden te bestuderen. De methode is vooral geschikt om in situ tromboïgeniteit en antistollingstherapie te evalueren tijdens verschillende fasen van stolling.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Een punctiewondprocedure voor hemostatische trombusvorming wordt hier gepresenteerd. De gevormde trombi zijn groot en hebben een diameter van honderden microns. Daarom zijn benaderingen voor volumebeeldvorming geschikt. We stellen geassembleerde elektronenmicroscopie met een breed gebied voor als een benadering met hoge resolutie die voor velen beschikbaar is en detailleren een preparatief protocol.

Hemostase van punctiewonden en voorbereiding van monsters voor gemonteerde elektronenmicroscopieanalyse met een groot gebied

In-vitro trombolyse-assays hebben vaak moeite om in-vivo-omstandigheden na te bootsen, of het nu gaat om de modeltrombus die wordt verteerd of in de omgeving waarin trombolyse plaatsvindt. Hierin onderzoeken we hoe de koppeling van de Chandler-lus en Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) wordt gebruikt voor high-fidelity, ex-vivo, stolsellysisbewaking.

Fibrinolyse volgen van Chandler Loop-gevormde volbloedstolsels onder afschuifstroom in een in-vitro trombolysemodel

Dit werk beschrijft een microfluissue-assay die schuifspanning gebruikt om de vorming van tromben in het bloed te triggeren en karakteriseert de trombus aan de hand van meerdere dimensies van uitlezen. De test kan de protrombische neiging van bloedmonsters meten en is daardoor nuttig voor ziektediagnose, geneesmiddelenontdekking, evenals basismechanistische studies gerelateerd aan trombose.

Thrombus Profiling Assay: Een op microfludiica gebaseerd platform voor het volledig karakteriseren van biomechanische trombogenese

Leer de structuur van bloedstollingsfactor VIII op lipid nanobuisjes te bepalen met cryo-elektronenmicroscopie. Deze methode combineert helikale organisatie met 3D-reconstructie voor inzicht in membraangebonden eiwitten.

Spiraalvormige Organisatie van Blood stollingsfactor VIII op Lipid nanobuisjes

Meer video's verkennen