Name: In vivo Ondervraging van het centrale zenuwstelsel Translatome door Polyribosome Fractionation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Leer polyribosoomfractie van CNS-weefsel om translatie in het zenuwstelsel te bestuderen. Deze methode isoleert ribosoomgebonden RNA uit muishersenen en ruggenmerg voor analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF), de Systems Biology van Signalering in Cancer (Helmholtz Alliance op Systems Biology) en het Duitse Centrum van het Kankeronderzoek (DKFZ).

Alle dierproeven werden uitgevoerd conform de institutionele richtlijnen van de DKFZ. Let op: Om RNAse besmetting van de monsters te voorkomen, nemen elementaire voorzorgsmaatregelen voor het vermijden van RNAse vervuiling en bereiden alle buffers met DEPC behandeld water. 1. Voorbereiding van sucrosegradiënten <ol><li> Bereid 17.5, 25.6, 33.8, 41.9 en 50% sucrose oplossingen (zie tabel 1). Bereid gradiënten door langzaam toevoegen van 2 ml 50% sucrose oplossing naar de bodem van een polyallomer ultracentrifuge buis. Freeze de laag door het plaatsen van buizen voor 20 min bij -80 ° C. </li><li> Voeg de volgende lagen op het verminderen van sucrose percentages met bevriezing tussenliggende stappen, belanden tot 17,5% sucrose. Houd gradiënten op ijs tijdens toevoeging van sucrose oplossingen om het ontdooien van de onderliggende lagen te voorkomen. </li><li> Bereid sucrosegradiënten vers een dag voor gebruik en bewaar bij 4 ° C. Alternatively bereiden gradiënten vooraf opslag bij -80 ° C en ontdooien bij 4 ° C de nacht vóór het experiment. </li></ol> 2. Tissue Voorbereiding (ruggenmerg en / of de hersenen) <ol><li> Verdoven muis door een overdosis Xylazin en Ketamin NaCl en transcardiaal perfuseren met 20 ml Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) bevattende 200 ug / ml CHX die op ribosomen verbonden transcripten immobiliseert. Bevestig de juiste verdoving door niet-ontvankelijkheid tot teen wringt. </li><li> Extract weefsel snel. Open de schedel dorsaal en haal de hersenen. Voer laminectomie van de gehele thoracale en lumbale wervelkolom en pak het ruggenmerg. Gebruik hele brein (~ 400 mg) of een 4 cm stuk ruggenmerg (~ 90 mg), respectievelijk. </li><li> Transfer weefsel in ijskoude homogenisering buffer A (zie tabel 1) (ruggenmerg: 1 ml; hersenen: 4 ml) en dobbelstenen in kleine stukjes met een schone scalpel tot een verhoogde opname van cycloheximide toestaan. Perform alle verdere stappen op het ijs. </li><li> Incubeer gedurende 15 min en homogeniseren weefsel mechanisch met behulp van een Dounce homogenisator. Zorgvuldig gecontroleerde homogenisering is noodzakelijk om ervoor te zorgen dat de kernen intact blijven. Behandel alle monsters precies dezelfde manier de vergelijkbaarheid te waarborgen. Opmerking: voor hersenweefsel: Onderbreek weefsel door 5 slagen met een goed sluitend stamper. Voor ruggenmergweefsel: verstoren door 5 slagen met een los aanliggende stamper, gevolgd door 5 verdere slagen met een goed sluitend stamper. </li><li> Neem monsters (400 ul voor de hersenen en 200 ul van het ruggenmerg), flash bevriezen en bewaar bij -80 ° C voor totale RNA isolatie. </li><li> Verwijder kernen en ongestoorde cellen en weefsels fragmenten door centrifugatie bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Lage snelheid centrifugeren voorkomt verlies van ribosomen. </li><li> Lyse membraanfragmenten in de kernen supernatant gedurende 30 min door toevoeging van NP-40 en natriumdeoxycholaat detergentia (elk een eindconcentratie van 1%). </li></ol><ol><li> Deze stap verwijdert vettige componenten van het monster die anders het signaal maskeren in de polyribosome profiel. Eerste, pre-chill ultracentrifuge emmers en rotor bij 4 ° C en voor te bereiden 2 M, 1,1 M en 0,9 M sucrose oplossingen (zie tabel 1). </li><li> Meng lysaat met 1,22 volumina 2 M sucrose-oplossing en over in een polyethyleen buis ultracentrifuge. Vul alle buizen op gelijke volume van 10 ml met 1,1 M sucrose-oplossing, daarna overlay voorzichtig met 0,9 M sucrose-oplossing. </li><li> Plaats de ultracentrifuge buizen in de pre-gekoelde ultracentrifuge emmers. Centrifugeer gedurende 3 uur bij 100.000 xg bij 4 ° C. Daarbij ribosomen worden afgezet in de pellet terwijl vetcomponenten zweven en blijven in de supernatant. </li></ol> 4. Sucrosegradiënt Fractionering <ol><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof en los pellet in homogenisering buffer B (zie tabel 1 </strong&gt;). Meet de absorptie bij 260 nm voor elk monster met een Nanodrop of gelijkwaardige apparaten en normaliseren bedraagt ​​laden volgens de absorptiewaarde. </li><li> Plaats sucrose gradiënten (bereiding beschreven in een vorige sectie) in het voorgekoeld ultracentrifuge emmers. Laag monsters voorzichtig bovenop de gradiënt. Voeg een lege sucrosegradiënt als technische controle. </li><li> Stel het gewicht van elke emmer met homogenisering buffer. Centrifugeer de monsters gedurende 1,5 uur bij 285.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Beginnen met de voorbereiding van de Isco fractioneerinrichting 30 min voor het einde van centrifugeren. Als een ander model fractioneerinrichting wordt gebruikt, volgt het protocol van de fabrikant. <ol><li> Stel de juiste gevoeligheid (0,2 AUFS voor hersenen of 0,05 AUFS voor ruggenmerg) voor de UV-lamp en zet hem aan om op te warmen. Monteer de buis piercer, sluit deze via de rollende pomp tot 60% sucrose-oplossing door de buis piercer. </li><li> Test de instellingen door het pompen van sucrose (stroom rate: 1 ml / min), met name ervoor zorgen dat er geen lekken in de leidingen die belletjes in het verloop zal introduceren. </li><li> Lege achtergrond absorptie door handmatig pompen gradiëntbuffer in de UV-detector en het corrigeren van de basislijn. </li></ol></li><li> Verwijder voorzichtig de ultracentrifuge emmers met daarin de sucrosegradiënten met gesedimenteerde monsters van de rotor en leg ze op ijs. Vermijd stoten van hellingen tot verlies van de resolutie voorkomen. </li><li> Run gradiënten op de fractioneerinrichting. Start eerst naar de achtergrond absorptie evalueren en zorgen voor een goede technische opzet leeg gradiënten. <ol><li> Bevestig verloop op de UV-detector en doorboren de bodem van de buis met de buis piercer. Start de pompen van 60% sucrose, wat het verloop zal verdringen met gesedimenteerd monsters naar boven door de UV-detector en in de druppel dispenser. </li><li> De absorptie bij 260 nm wordt vastgelegd op de absorptieprofiel van het monster te genereren, met pieken vermelding van de sedimentatie van mRNA&#39;s geassocieerd met ribosomale subeenheden, monosomes, en vervolgens toenemend aantal ribosomen. </li></ol></li><li> Verzamel monsters in 20 fracties via de druppel dispenser (600 pl elk, in 2 ml buizen). </li></ol> 5. RNA isolatie van Individual Breuken <ol><li> Voeg 10% SDS tot een eindconcentratie van 1% tot individuele fracties en meng goed om eiwitten ontvouwen en dissociëren ribosomen. Op dit moment monsters bij -80 ° C worden ingevroren Afhankelijk van de vraag te behandelen, kunnen fracties worden samengevoegd volgens het absorptieprofiel. </li><li> Isoleer RNA met zure fenol / chloroform extractie, die ook verwijdert verontreinigende sporen van DNA. <ol><li> Voeg een volume zure fenol / chloroform (voorverwarmd tot KT) aan elk monster gedurende 10 minuten bij 65 ° C en drukloos onder de zuurkast daarna. </li><li> Centrifuge monsters gedurende 20 min bij 17.000 xg bij kamertemperatuur. Overdragen waterfase voorzichtig naar een nieuwe 1,5 mlbuis. Let op faseomkering in dichtere sucrose fracties, waarbij de waterige fase kan daarbij beneden na centrifugeren. </li><li> Voeg een volume isopropanol, 1/9 volume natriumacetaat (pH 5,2) en 1 pi GlycoBlue aan elk monster om RNA te precipiteren. Houd monsters minimaal 1 uur bij -80 ° C. </li><li> Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 17.000 xg en 4 ° C. GlycoBlue levert visualisatie van de pellet. Verwijder supernatant, wassen pellet een keer met ijskoude 80% ethanol en drogen aan de lucht pellet. Los de pellet in RNAse vrij water. </li></ol></li><li> Kwantificeren hoeveelheid RNA door Nanodrop en te analyseren RNA integriteit door een Bioanalyzer chip. RNA dat wordt verkregen door de gepresenteerde protocol is geschikt voor alle geavanceerde high throughput assays zoals microarray en diepe sequencing. </li></ol>

<ol><li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+3%27UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+%28BDNF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li>
<li>Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Grolleau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+specific+translational+control+by+rapamycin+in+T+cells+uncovered+by+microarrays+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).</li>
<li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li>
<li>Zivraj, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+profiling+reveals+distinct+and+developmentally+regulated+repertoire+of+growth+cone+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).</li>
<li>Brittis, P. a, Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110 (2), 223-235 (2002).</li>
<li>Tcherkezian, J., Brittis, P. a, Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141 (4), 632-644 (2010).</li>
<li>Colak, D., Ji, S. -J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).</li>
<li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+3%27UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+%28BDNF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li>
<li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li>
<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li>
<li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. Schlaeger, T. 1, (2011).</li>
<li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes%3A+postnatal+development+and+experimental+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li>
<li>Larocca, J. N., Norton, W. T., et al. Isolation of myelin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLarocca%2C+JN+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3, (2007).</li>
<li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li>
<li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. a, Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

Geen belangenconflict verklaard.

Hoewel polyribosome fractionering is geen nieuwe techniek, het blijft een bijzonder uitdagend. Gebaseerd op het uitgangsmateriaal, kan aanzienlijk optimalisatie nodig zijn. Dit is vooral het geval voor in vivo CNS monsters, waarbij de hoeveelheid materiaal is vaak een beperking en vetweefsel componenten isolatie van het vertalen van mRNA&#39;s belemmeren. De meeste gepubliceerde protocollen fractionering behandelen gist of zoogdierlijke cellijnen, en er zijn vastgestelde protocollen voor de hersenen 12,13,14. In tegenstelling, zijn er nauwelijks publicaties waarin fractionering van het ruggenmerg, en eerdere protocollen vereisen ruggenmerg van een groot aantal dieren dat mag worden samengevoegd 15. Daarom werden een aantal essentiële aanpassingen aan de fractionering protocol aanpassen voor CNS weefsels, waaronder enkele muis ruggenmerg. Ribosoom immobilisatie met cycloheximide wordt uitgevoerd tijdens dier perfusie om dissociatie van ribosomen Durin voorkomeng het lange proces van weefsel-extractie. Vervolgens worden polysomal RNA geëxtraheerd in een bepaald wijze polyribosome maximaal rendement. Ten eerste gecontroleerde homogenisering van het weefsel door douncing, houdt de kern intact en voorkomt DNA verontreiniging. De kern wordt vervolgens volledig verwijderd door centrifugeren. De combinatie van detergentia NP-40 en natriumdeoxycholaat zorgt lysis van het endoplasmatisch reticulum en het vrijgeven van de membraan geassocieerde ribosomen. Bovendien, UV-absorberende componenten binnen de vetrijke myeline verdoezelen polyribosome profielen. Myeline beursgang is daarom noodzakelijk, waar dichte verbindingen zoals polyribosomen worden afgedraaid en lichtere verbindingen zoals myeline float en worden verwijderd 16. Polyribosomen worden vervolgens gesedimenteerd dan 17,5% tot 50% sucrose gradiënt. In plaats van het handmatig gelaagdheid en het bevriezen van elke sucrose laag, kan gradiënten ook worden bereid met behulp van een gradiënt mixer. Extractie van RNA uit fracties met zure fenol / chloroform maakt DNA worden verwijderd met minimale RNA verlies. Kunnen echter faseomkering plaatsvinden op dichte sucrose fracties (bovengenoemde component 16). Dit protocol verschaft voordelen ten opzichte van andere conventionele werkwijzen die het niveau van translatie pakken. Bijvoorbeeld, zowel het meten van gefosforyleerde S6 (een prominente vertaling merker) en de etikettering van ontluikende ketens met radioisotopen geven informatie over wereldwijde vertaaldiensten niveau maar weinig zeggen wat specifiek wordt vertaald. Polyribosome fractionering, anderzijds, kan niet alleen de beoordeling van globale vertaling, maar ook de identiteit vertalen mRNA en bijbehorende regulerende eiwitten. Kwantitatieve real time PCR kan worden uitgevoerd op geïsoleerde RNA&#39;s voor een snelle uitlezing van geselecteerde mRNA, en microarrays en de volgende generatie RNA sequencing kan voor genoomwijde studies worden uitgevoerd. De hier gepresenteerde optimalisaties kan de techniek worden gebruikt met minimale hoeveelheden CNS weefsels derhalve verminderening het aantal dieren dat nodig is en het verbeteren van de algehele experimentele kwaliteit door het verminderen van weefsel verwerkingstijd. Aan de andere kant, kan deze techniek niet Outlook is geïnstalleerd ribosomen onderscheiden van het vertalen van degenen. Afschriften dragen vastgelopen ribosomen zal neerslaan in de zware fracties, en dit moet in gedachten worden gehouden bij het interpreteren van de gegevens. Er zijn recent gerapporteerd technieken, namelijk RiboTaq en TRAP, waarbij ribosomen zijn gelabeld met epitoop tags of reporters respectievelijk een celtype-specifieke wijze en bijbehorende mRNA geïsoleerd door immunoprecipitatie 17,18. Deze techniek kan worden gekoppeld aan fractionering polyribosome hoge resolutie lezen voor specifieke celpopulaties bieden. Ribosoom mond-printen is een andere nieuwe techniek die nucleasedigestie gaat om kleine fragmenten te genereren, of &quot;voetafdrukken&quot;, van mRNA&#39;s die worden beschermd door ribosomen. Bibliotheken worden vervolgens gegenereerd uit deze voetafdrukken en gesequenced. Deze methode provIDE een codon-specifieke Volledige genoomanalyse vertaling en kan vastgelopen ribosomen identificeren, niet-AUG start codon en kleine upstream open reading frames, die niet kan worden bereikt door fractionering polyribosome 19. Toch kan polyribosome fractionering worden gekoppeld aan ribosoom profilering voor isolatie van verteerd fragmenten die enkel ribosomen, dus verrijkend voor de moleculaire species die nodig is voor de bibliotheek preparaat waarin hoge zuiverheid van het monster is vaak nodig. Tezamen polyribosome fractionering is een flexibele methode blijvende betekenis en kan gekoppeld worden aan verschillende stroomafwaartse toepassingen, waaronder genomische assays zoals next-generation sequencing.

Genexpressie wordt bepaald door de gecombineerde werking van transcriptie, translatie en stabiliteit van mRNA en eiwitten, de vertaling met het meest overheersende effect 1. Het is nu duidelijk dat elk van deze stappen is sterk gereguleerd. Micro-RNA, vorming van RNA korrels, alternatieve en cytoplasmatische polyadenylatie zijn enkele voorbeelden van post-transcriptionele regulatie van genexpressie 2,3. Elk van deze mechanismen ontkoppelt transcriptie uit de omrekening en beïnvloedt het proteoom in het biologische systeem van belang. Dus, niet verwonderlijk, mRNA niveaus alleen zijn een imperfecte uitlezing van eiwit niveaus 4. Kwantitatieve proteomics biedt de meest directe bepaling van genexpressie, maar ondanks de recente ontwikkelingen, er nog steeds aanzienlijke beperkingen gevoeligheid en eiwitsequentie resolutie. Daarom is het aanpakken van de translatome, het repertoire van het vertalen van mRNA&#39;s, biedt een uitstekend compromis tussen het bestuderen van detranscriptoom en proteoom. Het is nauwkeuriger dan transcriptomics bij de beoordeling van de definitieve genexpressie, en biedt zowel hogere dekking en volgorde resolutie dan proteomics. In zoogdiersystemen, de meeste vertaling gebeurtenissen beginnen via cap-afhankelijke initiatie. Een groep van eukaryote initiatie factoren samen met de 40S kleine ribosomale subunit verzamelen op kap van een mRNA de 5 &#39;. Het complex scant vervolgens het mRNA en bij het bereiken van de startcodon augustus, werft de 60S grote ribosomale subeenheid vormen een complete 80S ribosoom. De rek fase verloopt het ribosoom bewegen langs het mRNA met verlengingsfactoren helpen de opname van aminozuren van geladen tRNA naar de ontluikende peptideketen. Meerdere ribosomen kan gaan langs een mRNA gelijktijdig en het aantal ribosomen verbonden is getoond te correleren met de mate van eiwitsynthese 5,6. Dit maakt ribosomal laden een betrouwbare indicatie voor translation en maakt scheiding van actief vertalen van mRNA&#39;s op basis van bezinking. Naast de kwantificering van het vertalen van mRNA&#39;s, kunnen sequentie-informatie worden verkregen motieven betrokken bij de vertaling regelgeving te identificeren. RNA ook bindende eiwitten en andere vertaling factoren kunnen worden geïsoleerd uit verschillende fracties, de studie en de ontdekking van verwante regulerende eiwitten vergemakkelijken. In het zenuwstelsel is translationele controlesignalen gekoppeld aan processen zoals mRNA opslag, transport en plaatselijke eiwitsynthese. Groeikegels is aangetoond dat een bepaalde gelokaliseerde pool van mRNA onderscheiden van de rest van het axon 7 haven. Bovendien axonen bekwaam lokaal synthetiseren eiwitten 8,9. Als gevolg hiervan heeft de lokale controle van de vertaling uitgegroeid tot een cruciaal onderwerp van studie in de neurobiologie. Het potentieel van polyribosome fractionering deze pakken is geïllustreerd in verschillende studies, waarbij de techniek gebruikt omonderzoeken axon begeleiding in het ruggenmerg ontwikkeling, en toonde de activiteit-afhankelijke vertaling van BDNF in de hersenen 10,11.

<table><tbody><tr><td>Hank&rsquo;s balanced salts solution</td><td>Gibco</td><td>14170-138</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 ml, 14 x 95 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>voorzichtigheid</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td>gevaar</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>waarschuwing</td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td>gevaar</td></tr><tr><td>RNasin Plus RNase Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2611</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche</td><td>11332473001</td><td>gevaar</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>waarschuwing</td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td>gevaar</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder, 1 ml/7 ml</td><td>Wheaton</td><td>357538/357542</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 ml, 40,000 rpm, 285,000 x&nbsp;g</td><td>Beckman Coulter</td><td>331302</td><td></td></tr><tr><td>Density Gradient Fractionator</td><td>Teledyne Isco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo ondervraging van het centrale zenuwstelsel translatome door polyribosome fractionation

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Meerdere processen zijn betrokken bij genexpressie waaronder transcriptie, translatie en de stabiliteit van mRNA en eiwitten. Elk van deze stappen wordt strak gereguleerd, waardoor de uiteindelijke dynamiek van eiwitgehalte. Verschillende regulerende mechanismen bestaan ​​op het vertalen stap, waardoor mRNA niveaus alleen een onbetrouwbare indicator van genexpressie. Daarnaast heeft de lokale regulatie van mRNA translatie is vooral betrokken bij neuronale functies verschuiven &#39;translatomics&#39; om de focus van de aandacht in de neurobiologie. De gepresenteerde methode kan gebruikt worden om de brug transcriptomics en proteomics. Hier beschrijven we essentiële aanpassingen aan de techniek van polyribosome fractionering, die de translatome ondervraagt ​​op basis van de vereniging van actief vertaald mRNA&#39;s om meerdere ribosomen en hun onderscheidend bezinken in sucrosegradiënten. Traditioneel werken met in vivo monsters, met name de central zenuwstelsel (CZS), is een uitdaging door de beperkte hoeveelheden materiaal en de aanwezigheid van vetweefsel componenten bewezen. Om dit aan te pakken, wordt de beschreven protocol specifiek geoptimaliseerd voor minimale hoeveelheid CZS-materiaal, zoals blijkt uit het gebruik van enkele muis ruggenmerg en de hersenen. In het kort worden CNS weefsels geëxtraheerd en vertalen ribosomen geïmmobiliseerd op mRNA met cycloheximide. Myeline beursgang wordt vervolgens uitgevoerd om vetrijke componenten te verwijderen. Fractionering wordt uitgevoerd op een sucrosegradiënt waar mRNA worden gescheiden volgens hun ribosomale laden. Geïsoleerde fracties zijn geschikt voor een scala aan downstream testen, met inbegrip van nieuwe genoom brede assay technologieën.

Figuur 2 toont representatieve polyribosome profielen na fractionering. De profielen van de hersenen en het ruggenmerg tonen kenmerkende absorptiekrommen als hiervoor beschreven cellijnen. mRNA gebonden aan kleine ribosomale subeenheden (40S) sediment in lichtere fracties en lijken eerst als een piek op het profiel, gevolgd door de grote ribosomale subeenheid (60S) en monosome (80S) gebonden mRNA. mRNA&#39;s gebonden aan meerdere ribosomen sediment bij zwaardere fracties, met de latere toppen aangeeft toenemend aantal gebonden ribosomen. Global vertaling kan worden beoordeeld uit het profiel. Als voorbeeld, hersenweefsel een hogere polyribosome verhouding monosome dan ruggenmerg weefsel aangeeft actiever vertaling. RNA geëxtraheerd uit individuele fracties werden beoordeeld door Bioanalyzer, tonen de verdeling van 18S en 28S rRNA. 18S rRNA eerder in het profiel weergegeven, overeenkomstig de kleine ribosomale subeenheden sedimenteren in lichtere sucr<html> ose fracties. Typische opbrengsten van totaal RNA 10-20 ug voor de hersenen en 2-4 ug van het ruggenmerg. RNA opbrengst van afzonderlijke fracties tot 4 ug en 0,8 ug voor de hersenen en het ruggenmerg respectievelijk afhankelijk van de fractie. Een blanco sucrosegradiënt al toont achtergrondinformatie absorptie bij 260 nm, door de aanwezigheid van DTT. Deze achtergrond kan tijdens de data-analyse worden afgetrokken om monster waarden normaliseren. EDTA behandeling stortte de polyribosome pieken, waaruit de sedimentatie wordt bepaald door de vertaling. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1. Workflow en mogelijke toepassingen van in vivo polyribosome fractionering.&gt; Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Figuur 2. (A) Typische polyribosome profielen van de hersenen en het ruggenmerg, met beoordeling van de geëxtraheerde RNA door Bioanalyzer. (B) Distributie van GAPDH mRNA dan fracties door qRT-PCR. (C) Polyribosome profielen van lege gradiënt en de hersenen met en zonder EDTA behandeling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> 2x gradiëntbuffer </td><td> 30 mM Tris-HCl pH 7,4, 30 mM MgCl2, 600 mM NaCl, 200 ug / ml cycloheximide (CHX), 2 mM dithiothreitol (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sucrose-oplossing 17,5% </td><td> 8,67 g sucrose, 25 ml 2x gradiëntbuffer, tot 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sucrose-oplossing 25,6% </td><td> 12,8 g sucrose, 25 ml 2x gradiëntbuffer, tot 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sucrose-oplossing 33,8% </td><td> 16,9 g sucrose, 25 ml 2x gradiëntbuffer, tot 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sucrose-oplossing 41,9% </td><td> 20,95 g sucrose, 25 ml 2x gradiëntbuffer, tot 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sucrose-oplossing 50% </td><td> 25 g sucrose, 25 ml 2x gradiëntbuffer, tot 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> homogeniseringbuffer A </td><td> 0,25 M sucrose, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4), 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 200 ug / ml CHX, 1x Roche volledige proteaseremmer, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), 100 E / ml RNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 2M sucrose-oplossing </td><td> 68,4% sucrose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche volledige proteaseremmer, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1M sucrose-oplossing </td><td> 38,5% sucrose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche volledige proteaseremmer, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0.9M sucrose-oplossing </td><td> 30,8% sucrose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche volledige proteaseremmer, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> homogenization buffer B </td><td> 0,25 M sucrose, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholaat </td><td> 200 ug / ml CHX, 1x Roche volledige proteaseremmer, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 100 E / ml RNAsin </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Lijst van buffers en oplossingen.

Dit protocol illustreert wezenlijke modificaties van polyribosome fractionering om de translatome in vivo CZS monsters te bestuderen. Het maakt het mogelijk globale beoordeling van vertaling en transcriptie regulatie door de isolatie en vergelijking van de totale RNA gebonden RNA fracties ribosoom.

In vivo Ondervraging van het centrale zenuwstelsel Translatome door Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het identificeren van translerende mRNAs in primair CNS-weefsel. Het protocol begint met het extraheren van de relevante weefsels uit muizen in cycloheximide. Dit wordt gevolgd door mechanische homogenisatie en lysis in detergent.Vervolgens wordt er een myeline-flotatie uitgevoerd, waardoor de vetrijke lipidecomponenten van de weefsels worden verwijderd die de polysoomprofielen zouden maskeren. De pellet, die ribosomen en geassocieerde mRNA's bevat, wordt gesedimenteerd op een sucrosegradiënt om mRNA dat geassocieerd is met ribosomen te scheiden. De gradiënt wordt vervolgens gefractioneerd om een polysoomprofiel te verkrijgen, waarbij elke piek mRNA's vertegenwoordigt die geassocieerd zijn met een bepaald aantal ribosomen of ribosomale subunits.Fracties die polyribosomen bevatten worden vervolgens gezuiverd om RNA te verkrijgen voor downstream toepassingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het mogelijk maakt om met kleine hoeveelheden CNS-weefsel te werken en dat het veelzijdig is in de downstream toepassingen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de studie naar translatie in het zenuwstelsel, zoals veranderingen in translatieniveaus onder verschillende omstandigheden en de rol van translatie, regulatoire factoren en sequentiemotieven.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat in vivo CNS-materialen meestal beperkt zijn en de statische componenten in het weefsel de polyribosoomprofielen kunnen maskeren. Begin direct met de weefselextractie bij een muis die transcordiaal is geperfuseerd met HBSS bevattend cycloheximide. Open de schedel dorsaal en verwijder de hersenen. Breng de hersenen over naar ijskoude buffer A en snijd het hersenweefsel direct in kleine stukjes.Voer vervolgens een laminectomie uit van de thoracicale en lumbale wervelkolom. Verwijder vier centimeter van het ruggenmerg en breng dit over naar ijskoud buffer A op ijs. Snijd de afzonderlijke weefsels in kleine blokjes om de opname van cyclo heide te verhogen en incubeer deze vervolgens gedurende 15 minuten op ijs.Disrumpeer vervolgens de weefsels met de homogenisator om ervoor te zorgen dat de kernen intact blijven. Brain tissue vereist vijf slagen met een nauwsluitende stamper, waarna het weefsel door het gaas in buisjes wordt overgebracht. Spinal cord tissue vereist vijf slagen met een ruimpassende stamper, gevolgd door nog eens vijf slagen met een nauwsluitende stamper.Verzamel nu aliquoten voor totale RNA-isolatie: 200 µL ruggenmerg en 400 µL hersenflash. Vries deze in en bewaar ze bij -80 °C. Centrifugeer de weefsels 10 minuten lang bij 500 ×g om de celkernen, onbeschadigde cel- en weefselfragmenten te verwijderen.Verzamel het supernatant dat het endoplasmatisch reticulum met de eraan gebonden ribosomen bevat, en gooi de pellet met de kernen weg. Lyseer vervolgens de membraanfragmenten van het endoplasmatisch reticulum om de ribosomen vrij te maken door NP 40- en natriumdesoxycholaat-detergentia toe te voegen tot een eindconcentratie van elk 1%. Laat de monsters 30 minuten op ijs incuberen. Een van de uitdagingen bij het werken met weefsels van het zenuwstelsel is dat myeline en andere lipiderijke componenten voorkomen in Master Polysome-profielen.Om dit probleem aan te pakken, moet vooraf het proces van flotatiemodellering worden geïntroduceerd om deze componenten te verwijderen. Koel de ultracentrifugebekers en de rotor vooraf af tot 4 °C. Meng nu de verzamelde lysaten met 1,22 volumes 2 M sucrose.Overbreng elk mengsel naar een polyethyleen ultracentrifugebuis en vul de buizen aan tot 10 milliliters met 1,1 molar sucrose. Leg vervolgens voorzichtig een laag 0,9 molar sucrose over de inhoud van de buizen. Plaats de buizen nu in de gekoelde emmers en balanceer deze met buffer B. Plaats de gebalanceerde emmers in de gekoelde rotor en laat de centrifuge draaien bij 100, 000 Gs. Gedurende drie uur bij vier degrees Celsius zullen de ribosomen en RNA's pelletteren onder de gesuspendeerde lipiden.Verwijder na de myeline-floatatiespin de supernatant en los de pellets met ribosomen op in buffer B. Meet vervolgens de absorbentie van de ribosoomoplossingen bij 260 nanometer met een NanoDrop-apparaat. Schat aan de hand van deze waarden de totale RNA-concentraties. Breng de monsters nu over naar klaargemaakte sucrosegradiënten.Zorg ervoor dat de gradiënten niet worden verstoord en voeg een lege gradiënt toe als controle. Balanceer de gekoelde emmers met de monsters zoals eerder beschreven. Centrifugeer vervolgens gedurende anderhalf uur bij 285, 000 Gs en vier graden Celsius.Terwijl de centrifuge draait, bereidt u de fractioneer prepareert u de fractioneer. Stel eerst de gevoeligheid van de UV-lamp in. Bevestig vervolgens de buisdoorborer aan de fractioneer en verbind deze via een slangetje met een fles 60% sucrose.Pomp met behulp van een tussenliggende rollenpomp sucrose met een snelheid van één milliliter per minuut in de fractioneerder. Controleer op luchtlekken die bellen veroorzaken en trek deze afdichtingen aan. Pomp vervolgens handmatig gradiëntbuffer in de UV-detector om de basislijn in te stellen.Nadat de monsters voorzichtig uit de ultracentrifuge zijn gehaald zonder schokken, plaatst u er één in de fractionator en doorboort u vervolgens de bodem van de buis met de doorboorder. Start het pompen van de 60%sucrose om de gradiënt langs de UV-detector en in de druppeldispenser te verplaatsen. Registreer het absorptieprofiel bij 260 nanometers.Verzamel 20 fracties vanuit de druppeldispenser in buisjes van twee milliliter. Verzamel 600 µL per fractie en ga verder met het verwerken van de monstergradiënten door aan elke fractie 10% SDS toe te voegen tot een eindconcentratie van 1% SDS en meng dit goed. Isoleer vervolgens het RNA met behulp van een zure fenol-chloroformextractie.Begin met het toevoegen van één volume zuur fenylchloroform op kamertemperatuur en verhit de buizen vervolgens 10 minuten lang tot 65 °C. Open de vials na het verhitten voorzichtig in een zuurkast om de druk te laten ontsnappen. Centrifugeer de fracties daarna 20 minuten bij 17.000 ×g op kamertemperatuur en verzamel de waterige fase, die zich boven of onder de sucrose kan bevinden.Voeg vervolgens één volume isopropanol, één negende volume natriumacetaat en één microliter glyco blue toe. Precipiteer het RNA gedurende ten minste een uur bij -80 °C en pellet het vervolgens door centrifugatie. Was de pellets daarna één keer met gekoelde 80% ethanol en pellet het RNA opnieuw; laat de pellets vervolgens aan de lucht drogen, resuspendeer ze in water en ga verder met de downstream-analyse.Als alternatief kunnen monsters worden bewaard bij -80 °C tot aan het gebruik. Een blanco sucrosegradiënt vertoont enige achtergrondabsorptie bij 260 nm vanwege de aanwezigheid van DTT. Deze achtergrond kan tijdens de data-analyse worden afgetrokken om de monsterwaarden te normaliseren; de profielen van RNA uit de hersenen en het ruggenmerg vertonen karakteristieke absorptiecurves, waarbij mRNA's die gebonden zijn aan kleine ribosomale subunits sedimenteren in lichtere fracties die vroeg in het profiel verschijnen.Deze worden gevolgd door de grote ribosomale subunit en mono-gebonden mRNA's; mRNA's die gebonden zijn aan meerdere ribosomen sedimenteren in latere fracties. Behandeling van de monsters met EDTA deed de polyribosoompieken inklappen, wat aantoont dat het sedimentatieprofiel het gevolg was van translatie. Aanvullende methoden zoals Ribot-attack en trap kunnen aan deze techniek worden gekoppeld om celtype-specifieke studies naar translatie uit te voeren.Na deze ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers in het vakgebied van de neurobiologie om de rol van translatieregulatie bij de ontwikkeling van neuronen en bij ziekten te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u polysoomfractionering uitvoert op kleine hoeveelheden CNS-weefsel en hoe u RNA zuivert voor daaropvolgende downstream-applicaties naar keuze.

in-vivo-interrogation-central-nervous-system-translatome-polyribosome

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit artikel beschrijft een protocol voor de extractie van het vertalen van ribosomen van eukaryotische cellen. Eenmaal uitgepakt, worden ribosomen gescheiden in monosomes en polyribosomes door sucrose gradiënt fractionering om verschillende ribosomale populaties te analyseren. Als zodanig is deze methode is de gouden standaard voor de behandeling van de regulering van de vertaling.

Eukaryotische Polyribosome Profiel Analyse

Een techniek om translationeel pauze sites op mRNA te identificeren wordt beschreven. Deze procedure is gebaseerd op isolatie van beginnende Polypeptiden ophopen op ribosomen tijdens in vitro translatie van een doel-mRNA, gevolgd door de grootte analyse van de ontluikende ketens met een denaturerende gelelektroforese.

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

Hier beschrijven we een werkwijze veranderingen in de initiatie van mRNA translatie van eukaryote cellen in reactie stresssituaties analyseren. Deze methode is gebaseerd op de snelheid scheiding op sucrosegradiënten vertalen ribosomen van niet-translating ribosomen.

Analyse van de translatie-initiatie tijdens stress Voorwaarden door polysome Profiling

Ribosomen spelen een centrale rol in de eiwitsynthese. Polyribosome (polysome) fractionering van sucrose dichtheidsgradiëntcentrifugatie maakt een directe bepaling van de vertaling efficiëntie van de individuele mRNA's op een genoom-brede schaal. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor biochemische analyse van de ribosoom-en-polysome geassocieerde factoren zoals chaperonnes en signaalmoleculen.

Polysome fractionering en analyse van zoogdieren Translatomes op een genoom-brede schaal

Het vermogen van cellen om zich aan stress aan te passen is cruciaal voor hun overleven. Regulatie van mRNA-translatie is een van deze aanpassingsstrategieën, die zorgt voor een snelle regulering van het proteoom. Hier bieden we een gestandaardiseerd polysoomprofileringsprotocol om specifieke mRNA's te identificeren die selectief worden getransleerd onder stressomstandigheden.

Beoordeling van Selectieve mRNA Vertaling in zoogdiercellen door polysoom Profiling

Het vertalen van Ribosoom Afiniteitszuivering (TRAP) kan de celtype-specifieke translatie van mRNA vastleggen. Hier rapporteren we het eerste TRAP-protocol dat zich richt op de isolatie van mRNA in zeldzame celpopulaties van Drosophila-embryo's.

TRAP-rc, vertalen Ribosoom Affiniteitszuivering van Rare Cell Populaties van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

Hier beschrijven we de immunopreciatie van riosomen en bijbehorend RNA uit geselecteerde populaties volwassen mannelijke muizenkiemcellen met behulp van het RiboTag-systeem. Strategische veredeling en zorgvuldige immunoneerslag resulteren in schone, reproduceerbare resultaten die informeren over het vertalen van de kiemcel en inzicht geven in de mechanismen van gemuteerde fenotypes.

RiboTag immunoprecipitatie in de kiemcellen van de mannelijke muis

De ontwikkeling van het zoogdierbrein vereist een goede controle van genexpressie op het niveau van vertaling. Hier beschrijven we een polysoomprofileringssysteem met een eenvoudig te assembleren sucrose gradiëntvormings- en fractioneringsplatform om de translationele status van mRNAs in de zich ontwikkelende hersenen te beoordelen.

Analyse van vertaling in de zich ontwikkelende muishersenen met behulp van polysoomprofilering

We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen, targeting-, vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode voor in vivo, directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

Leer polyribosoomfractie van CNS-weefsel om translatie in het zenuwstelsel te bestuderen. Deze methode isoleert ribosoomgebonden RNA uit muishersenen en ruggenmerg voor analyse.

In vivo Ondervraging van het centrale zenuwstelsel Translatome door Polyribosome Fractionation

Meer video's verkennen