Aantonen van een multiresistente Mycobacterium tuberculosis Versterking Microarray
25 april 2014
Een amplificatie microarray combineert asymmetrische PCR-amplificatie en microarray hybridisatie in een enkele kamer, die aanzienlijk stroomlijnt microarray workflow voor de eindgebruiker. Vereenvoudiging microarray workflow is een noodzakelijke eerste stap voor het maken van microarray-gebaseerde diagnostiek die routinematig kan worden gebruikt in een lagere-resource-omgevingen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om multi-drug resistent microbacterium tuberculosis te genotypen, met behulp van een amplificatie microarray. Dit wordt bereikt door een multiplex asymmetrische PCR uit te voeren over de top van een microarray binnen een enkele microfluïdische reactiekamer. Daar wordt het monster gelijktijdig geamplificeerd, gelabeld, grootte geselecteerd, enkelstrengs gemaakt en gehybridiseerd naar de microarray.
Vervolgens, nadat de microarray is gewassen, toont een lezer of microbacterium tuberculosis aanwezig is, en of het een DNA-mutatie bevat die bekend is om resistentie te verlenen tegen rifampicijn iso, niazi ethambutol of streptomycine. Het voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande microarray line probe of nucleïnezuur hybridisatie methoden is dat een amplificatie microarray de interactie van de gebruiker met de test aanzienlijk vereenvoudigt. Toch, terwijl het de analytische gevoeligheid van PCR en de multiplexcapaciteit van een microarray biedt. Voor deze procedure, zorg voor een schone werkruimte die is schoongemaakt met een ontsmettingsoplossing en zorgen voor nucleïnezuren die puur genoeg zijn voor multiplex PCR.
Na het ontdooien en mengen van alle stockoplossingen, assembleer de PCR master mix. Bij het bereiden van deze mix, maak ten minste één extra volume van mengsel voor de TB-test die hier wordt getoond. Voeg ook extra T-polymerase toe aan de master mix.
Naast de hoeveelheid tack die wordt geleverd met de stock reagentia mix, een microliter aliquoten van monster DNA tot 49 microliters van master mix. Voeg voorzichtig 48 microliters van elk reactiemengsel toe aan het centrum van de juiste microarray. Raak de microarray zelf niet aan.
Bedek vervolgens voorzichtig de microarray en verzegel deze onjuist. Het aanbrengen van de dekplaat kan bellen introduceren die kunnen leiden tot artefacten, verdamping, slechte amplificatie of niet-uniforme hybridisatie. Elk van deze omstandigheden kan tot een foutieve uitslag leiden.
Laad vervolgens de microsnelheid in de thermische cycler. Met de substraten tegen de verwarmingsblok, moet de verwarmde dekseloptie uitgeschakeld zijn. Voor laboratoria die universele PCR-voorzorgsmaatregelen volgen, is het efficiënter om meerdere amplificatie microarrays per dia en meerdere tests tegelijkertijd te verwerken.
Voer nu het juiste thermische cyclusprogramma uit. Dit programma heeft 50 amplificatiecycli, wat hoog lijkt, maar noodzakelijk is vanwege de overwegend enkelstrengse amplicon-populatie die door de reactie wordt gecreëerd. Wanneer de reactie voltooid is, verwijder de microarrays en schakel de thermische cycler uit.
Open voorzichtig de microarraykamer met vlakke en pincetten. Verwijder de slip, deksel en afdichting. De microarray kan door deze stap worden beschadigd, dus wees voorzichtig onjuist.
Het verwijderen van de afdichtingsassemblage kan leiden tot fysiek beschadigingen van de microarray. Zorg ervoor dat u de dekplaat niet buigt of buigt en let er goed op dat u het oppervlak van de microarray niet krast met de pincetten. Breng nu de microarray substraten over naar een histologie diahouder. Bad de substraten in de wasbuffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie, volg het wasoplossingsbad met twee of drie meer wasbeurten, allemaal in gedeïoniseerd water.
Droog de microarrays voordat u doorgaat naar beeldvorming. Een zachte stroom gecomprimeerde lucht kan voor dit doel worden gebruikt in deze demonstratie, parameters zijn specifiek voor de MDR TB-test en een Econ DX 2100 velddraagbare beeldvormer. Een blauw licht op de beeldvormer geeft aan dat deze klaar is.
Schakel de computer in. Open de systeemmsoftware die door een conni wordt geleverd en wacht tot de software aankondigt dat deze een verbinding met de camera heeft gemaakt. Plaats vervolgens de gedroogde microarray in de beeldvormer.
Met de microarray naar de lens toe en weg van de gebruiker. De software zal nu een voorbeeldbeeld bieden vanuit het vervolgkeuzemenu. Selecteer het MDR TB-analysescript.
Voer een belichtingstijd in tussen 100 en 500 milliseconden. Overbelichte pixels worden gelezen. Pas de belichting aan om deze te minimaliseren.
Wanneer de verzadiging is ingesteld om overbelichting te minimaliseren, start u de analyse. De software plaatst een MDRT TB-raster op het beeld scores, monsters en achtergrondintensiteiten, en rapporteert vervolgens geneesmiddelresistentie en genotyperingsresultaten. Zodra de analyse is voltooid en opgeslagen, verwijdert u de chip uit de beeldvormer en start u een nieuwe analyse sessie om de volgende array te analyseren.
Vervolg de analyse voor elk van de verwerkte microarrays. Sla elke keer de gegevens op. Kwalitatieve beeldafname kan inzicht geven in bronnen van experimentele ruis of variabiliteit die moeilijk te identificeren is in gegevenstabellen gegenereerd door geautomatiseerde beeldanalysesoftware.
Een hoogwaardige array zonder artefacten is hier te zien. Verschillende artefacten kunnen leiden tot de introductie van bellen die halo's creëren. Ondanks array artefacten, zal de software nog steeds waarden ophalen van het gescande.
Een diagnostische rapportage-algoritme zou, ondanks het herkennen van waarden, deze array als ongeldig beschouwen. Een verdunningsreeks van wild type H 37 RA genomisch DNA werd gebruikt op een microarray PCR-sjabloon bij 6,25 picogrammen, equivalent aan 1.250 cellen. Alle sondes werden gedetecteerd.
Een SNR-waarde boven drie is een positief resultaat, en geregistreerde waarden waren veel hoger. Vervolgens werden WHO-referentie isolaten gegenotypeerd. Enkele nucleotide polymorfismen die op de array aanwezig waren, werden gedetecteerd als de overeenkomstige mutatie in het MDR TB-genoom.
Verschillende voorbeelden van het detecteren van nabije buurmutaties waren ook duidelijk. Een discussie wordt gegeven in het tekstprotocol. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer drie en een half tot zes en een half uur worden uitgevoerd, afhankelijk van de concentratie van DNA, de specifieke test, de efficiëntie en uniformiteit van de thermische cycler, en de gewenste analytische of klinische gevoeligheid en specificiteit.
Ook kunnen het aantal amplificatiecycli en post-amplificatie hybridisatietijden gemakkelijk worden verkort of verlengd om de gewen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe amplificatie-microarraymethode voor het genotyperen van multiresistente Microbacterium tuberculosis. Door asymmetrische PCR-amplificatie en microarray-hybridisatie in één enkele kamer te integreren, is de workflow aanzienlijk gestroomlijnd, waardoor deze geschikt is voor omgevingen met beperkte middelen.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Genetica
- Diagnostiek
Achtergrond
- Multi-resistente microbacterium tuberculosis vormt een aanzienlijke uitdaging voor de volksgezondheid.
- Traditionele detectiemethoden kunnen complex zijn en veel middelen vereisen.
- Er is behoefte aan vereenvoudigde diagnostische methoden in omgevingen met beperkte middelen.
- Deze studie onderzoekt een nieuwe benadering met behulp van amplificatie-microarrays.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het genotyperen van multi-resistente Mycobacterium tuberculosis.
- Het vereenvoudigen van de interactie van de gebruiker met de diagnostische test.
- Het combineren van amplificatie- en hybridisatieprocessen in één enkele microfluïdische reactie.
Gebruikte methoden
- Multiplex asymmetrische PCR uitgevoerd op een microarray.
- Gelijktijdige amplificatie, labelen, selectie op grootte en hybridisatie.
- Wassen van de microarray na de hybridisatie.
- Gebruik van een reader om de aanwezigheid van Microbacterium tuberculosis en geassocieerde mutaties te detecteren.
Belangrijkste resultaten
- De amplificatie-microarraymethode vereenvoudigt het diagnostische proces.
- Het behoudt de analytische sensitiviteit van PCR.
- Het maakt een multiplex-capaciteit mogelijk die vergelijkbaar is met die van traditionele microarrays.
- De resultaten wijzen op een effectieve detectie van drugresistentiemutaties.
Conclusies
- De amplificatie-microarray is een veelbelovend instrument voor de diagnostiek van tuberculose.
- Deze methode zou de testcapaciteit in omgevingen met beperkte middelen kunnen verbeteren.
- Verdere validatie en optimalisatie zijn noodzakelijk voor wijdverbreid gebruik.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Deze amplificatie-microarraymethode stroomlijnt de genotypering van MDR-TB door asymmetrische PCR, labelen en hybridisatie te integreren in één enkele microfluïdische kamer, waardoor handmatige stappen worden verminderd en implementatie in omgevingen met beperkte middelen mogelijk wordt. De aanpak behoudt de sensitiviteit op PCR-niveau terwijl het multiplexed detectie van resistentie-verlenende mutaties ondersteunt, wat een weg biedt naar vereenvoudigde, schaalbare diagnostiek voor de surveillance van infectieziekten. Door gebruikersinteractie en verwerkingstijd tot een minimum te beperken, vult het kritieke tekortkomingen in translationele microbiologische workflows op, waarbij snelheid, reproduceerbaarheid en een lage afhankelijkheid van infrastructuur essentieel zijn voor targetvalidatie en assayontwikkeling in een vroeg stadium.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar genetische targets die geassocieerd zijn met resistentiemechanismen voor geneesmiddelen in Mycobacterium tuberculosis.
- Operationele waarde: Ondersteunt hypothesetoetsing door multiplexe SNP-detectie in een enkele reactie, waardoor variabiliteit door monstersplitsing wordt verminderd.
- Translationele waarde: Biedt een ziekterelevante methode voor het evalueren van resistentie-verlenende mutaties, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie in programma's voor anti-infectieve targets.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve hybridisatiesignalen die correleren met allelische varianten, waardoor allelspecifieke discriminatie mogelijk is.
- Operationele waarde: Combineert amplificatie en detectie in een gesloten systeem, waardoor het risico op contaminatie wordt geminimaliseerd en de reproduceerbaarheid tussen batches wordt verbeterd.
- Klaarheid van de assay: Maakt gebruik van een 9-plex asymmetrische mastermix die compatibel is met arrays met lage dichtheid, wat schaalbare multiplexing aantoont voor pathogenen-genotyperingspanels.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Genotypeert MDR-TB-stammen direct met behulp van WHO-referentie-isolaten, waardoor de klinische relevantie van gedetecteerde mutaties wordt gewaarborgd.
- Voorspellend vertrouwen: Bereikt een SNR >3 als drempelwaarde voor positiviteit, wat een kwantitatieve benchmark biedt voor de evaluatie van de prestaties van de assay.
- Continuïteit van de workflow: Levert genotyperingsresultaten op die compatibel zijn met downstream-algoritmen voor resistentie-interpretatie, wat de afstemming van translationele biomarkers ondersteunt.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen workflows van vroege ontdekking tot preklinische fasen door een snelle read-out van genotypering in een gesloten systeem te bieden, wat beslissingen over targetvalidatie en leadoptimalisatie in anti-infectieuze programma's ondersteunt.
- Discovery Biology: Faciliteert onderzoek op pathway-niveau naar resistentiemechanismen door het detecteren van meerdere mutaties in genen zoals rpoB, katG en embB.
- Screening: Maakt high-throughput strain-profilering mogelijk met minimale handmatige tijd, wat screening van klinische isolaten of gemuteerde bibliotheken ondersteunt.
- Analytics: Levert gemultiplexte fluorescentie-readouts die de hybridisatie-efficiëntie kwantificeren, waardoor vergelijking van de abundantie van mutante allelen onder verschillende condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Maakt gebruik van klinisch relevante DNA-inputs (tot wel 1.000 cel-equivalenten), waardoor de brug wordt geslagen tussen synthetische en patiëntafgeleide monstertests.
- Enterprise hergebruik: Het microfluidische amplificatie-microarray-formaat is aanpasbaar aan andere pathogeenpanels, wat hergebruik van het platform voor verschillende infectieziektedoelen bevordert.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit bij resistentie-genotypering door gelijktijdige, gemultiplexte mutatiedetectie te bieden.
- Operationele waarde: Elimineert afzonderlijke amplificatie- en hybridisatiestappen, waardoor de actieve werktijd en technische variabiliteit afnemen.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen bij targetvalidatie mogelijk door resistentieprofielen binnen 6,5 uur te leveren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen die gericht zijn op resistente stammen door betrouwbare genotypering van preklinische isolaten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microfluïdische handling en de optimalisatie van asymmetrische PCR om de uniformiteit van de amplificatie te waarborgen.
- Is afhankelijk van thermocyclers met instelbare parameters voor het deksel en compatibele fluorescentie-imagingsystemen voor endpoint-detectie.
- Vereist gestandaardiseerde wasprotocollen om carry-over tussen runs te voorkomen bij batchverwerking.
- Er moet rekening worden gehouden met de compatibiliteitslimieten van primers in multiplex mastermixen, aangezien de mate van multiplexing wordt beperkt door de compatibiliteit van primerparen en niet door de probedichtheid.
- De prestaties zijn gevoelig voor de kwaliteit en concentratie van het DNA-inputmateriaal, waardoor kwaliteitscontrole (QC) van het genomisch materiaal vóór de amplificatie noodzakelijk is.
