Name: Aantonen van een multiresistente Mycobacterium tuberculosis Versterking Microarray (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Leer een versterkingsmicroarray-methode voor het genotyperen van multiresistent Mycobacterium tuberculosis. Deze techniek combineert PCR en hybridisatie in één kamer voor eenvoudigere diagnostiek in omgevingen met beperkte middelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) onder toekenning RC3 AI089106. MDR-TB nucleïnezuren werden verstrekt door het Fonds / United Nations Development Programme / Wereldbank / World Health Organization speciale programma het Kinderfonds van de Verenigde Naties voor Onderzoek en Opleiding in Tropische Ziekten (TDR), Genève, Zwitserland. Wij danken dr. Tom Shinnick van de Amerikaanse Centers for Disease Control en Prevention voor begeleiding op de specifieke genen en mutaties in de prototype-test op te nemen.

Voor laboratoria die universele PCR voorzorgsmaatregelen volgen, is het operationeel efficiënter om meerdere amplificatie microarrays en pakkingen per substraat op te nemen en te wassen alle versterking microarrays gelijktijdig in een container voor losgestort vervoer, zoals hier beschreven. Verbruiksartikelen formaten zijn beschikbaar voor het uitvoeren van stappen microarray wassen post-amplificatie in een volledig gesloten, gesloten amplicon test, zoals elders 30,33 gerapporteerd. 1. Setup <ol><li> Extraheren en zuiveren nucleïnezuren uit het monster in een geschikt bioveiligheid omstandigheden met een methode van keuze. De eis is dat nucleïnezuren zijn van voldoende zuiverheid voor asymmetrische, multiplex PCR amplificatie. </li><li> Bereid werkruimte door vlakken schoon te vegen en apparatuur met ontsmettingsmiddelen oplossingen. </li><li> Plaats amplificatiereagentia op ijs of koude blok. </li><li> Label een steriele 1,5 ml microfugebuisje voor de amplificatie master mix, en label een steriele 0,2 ml microfugebuisje tuvoor elk monster. </li><li> Na reagentia zijn ontdooid, kort vortex en inhoud verzamelen om de bodem van de buis met een puls-Spin in een mini-centrifuge. Niet vortex Taq-polymerase. Tik zachtjes tegen de buis te mengen en te volgen met een puls-spin-in mini-centrifuge. </li><li> Bereid een amplificatie master mix met de per-monsterreactiemengsel volumes worden getoond in Tabel 1. Ter compensatie van eventuele onnauwkeurigheden pipetteren, minstens een reactievolume dan het totale aantal monsters wordt verwerkt bereiden. Merk op dat de master mix bevat aanvullende Taq-polymerase, dan wat is voorzien van de muliplex PCR-buffer. Voeg alleen de versterking / inhibitie controle met betrekking tot de master mix nadat alle andere reagentia worden gecombineerd, en de voorraad reagensbuizen terug naar de opslag. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Per-Sample Volume (pl) </td><td> &lt;strong&gt; Final [] </td></tr><tr><td> Mulitplex PCR Buffer met HotStar Taq Plus </td><td> 25 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Bovine serum albumine (BSA) </td><td> 0,55 </td><td> 0,6 mg / ml </td></tr><tr><td> Formamide </td><td> 3.8 </td><td> 7,6% </td></tr><tr><td> Aanvullende Taq polymerase </td><td> 0.8 </td><td> eenheden / pl (4 stuks totaal) </td></tr><tr><td> MDR-TB primer mix </td><td> 15.75 </td><td> - </td></tr><tr><td> RNase-free H2O </td><td> 2.1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Amplification / Remming Controle </td><td> 1 </td><td> 5.0 fg / ul </td></tr><tr><td> Totaal </td><td> 49 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. MDR-TB versterking microarray master mix samenstelling. <ol start="7"><li> Vortex de master mix en inhoud verzamelen om de bodem van de buis met een puls-Spin in een mini-centrifuge. </li><li> Combineer 49 pi master mix en 1 pi van M. tuberculosis DNA aan elk van de monsterbuizen uit stap 1.4, hierboven. Voor een externe templateloze controle (NTC), gebruikt 1 pl moleculaire biologie rang water in plaats van de M. tuberculose DNA-monster. Vortex en pulse-draai de buis (s) als u klaar bent. </li></ol> 2. Belastingversterking Microarrays <ol><li> Voeg 48 ul van elke master mix / monster op het midden van hun respectieve microarrays, let daarbij goed op de microarray zelf niet aan. </li><li> Plaats een dekglas op de top van de microarray pakking en afdichting, en let niet te vangen eventuele luchtbellen in de microarray kamer. Luchtbellen kan een negatieve invloed hebben op amplificatie-efficiëntieen kunnen artefacten of ruis uit de daaropvolgende microarray creëren. </li></ol> 3. Thermische Fietsen <ol><li> Zodra alle microarrays worden geladen met staal, plaats substraten op het platte blok PCR-apparaat. Zorg ervoor dat de verwarmde deksel optie &quot;Off&quot; is ingeschakeld. Apparatuur verkregen uit Akonni Biosystems wordt reeds geprekwalificeerde voor gebruik. Anders, is het zeer belangrijk om te controleren of de platte blok PCR-apparaat (s) te voorzien (s) uniforme, consistente verwarming in alle microarray substraten. </li><li> Open de PCR-apparaat software, kies de juiste programma, voert u &quot;50 pl&quot; voor de reactie volume, en start de run. De thermische cycli hier beschreven protocol bestaat uit: <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Thermische Fietsen Stappen </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 88 ° C </td><td> 5 min </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 88 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 55 ° C </td><td> 1 min </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 65 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Herhaal de stappen (2-4) voor 50 cycli </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 65 ° C </td><td> 3 min </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 55 ° C </td><td> 3 hr </td></tr></tbody></table></li><li> Het totale aantal thermische cycli en 55 ° C na amplificatie wachttijd onafhankelijk variabelen die de gebruiker kan wijzigen, indien nodig of passend om het specifieke experiment. Omdat MDR-TB master mix gemaakt asymmetrische (voornamelijk enkelstrengs) amplicons, is meestal nuttig meer temperatuurcycli dan anders zou worden gebruikt voor een conventionele, exponentiële PCR amplificatie protocol omvatten. </li><li> Wanneer de thermische cycli en hybridisatie programma is voltooid, eindigt het programma, verwijder de versterking microarrays, sluit de software, en zet de PCR-apparaat (s).</li></ol> 4. Was en droog <ol><li> Voor wassen tot 24 substraten gelijktijdig bereiden minstens 250 ml 1x SSPE - 0,1% Triton X-100 wasbuffer, en twee containers met ten minste 250 ml gedeïoniseerd of Milli-Q-kwaliteit water elk. De wasbuffer kan worden voorbereid. </li><li> Verwijder voorzichtig het deksel slip en de pakking van elkaar amplificatie microarray kamer met behulp van een flatscreen-end tang. Deze stap is het punt waarop er het grootste risico van fysiek schadelijke gel element arrays. Gebruik geschikte PCR-besmetting controles om de verspreiding van versterkte nucleïnezuren voorkomen binnen de werkomgeving. </li><li> Plaats microarray substraten in een houder histologie glijbaan, en leg alle dia&#39;s in de was bak daarin de wasbuffer. Bedek de container met een deksel. </li><li> Was microarrays gedurende 10 min bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Dompel de microarrays drie keer elk in twee opeenvolgende wasbeurten gedeïoniseerd ofMilli-Q kwaliteit water en de lucht drogen. </li></ol> 5. Imaging De asymmetrische MDR-TB primer mix genereert Cy3-gelabelde amplicons. Gel element microarrays kunnen worden afgebeeld met elke standaard microarray imager staat beeldvorming Cy3. De volgende imaging procedure is specifiek voor de MDR-TB master mix, Dx2100 veld draagbare imager, en geautomatiseerde analyse software die door Akonni. <ol><li> Zorg ervoor dat de Ethernet-kabel van de imager is aangesloten op de computer. </li><li> Zet de imager. De schakelaar bevindt zich op het achterpaneel van het instrument. Blauwe LED&#39;s aan de voorzijde van de imager gaat branden wanneer imager is ingeschakeld. </li><li> Zet de computer aan. </li><li> Op de desktop computer, dubbelklikt u op het pictogram om de software automatische beeldanalyse software te starten. </li><li> Wacht tot de software om een ​​verbinding met de imager camera vast. Wanneer de verbinding is gemaakt, de knop Analyseren beschikbaar, enmelding &quot;Connection Successful&quot; wordt weergegeven in de linker bovenhoek van het scherm. </li><li> Plaats de gedroogde versterking microarray met de microarray afgekeerd van de gebruiker, en de richting van het objectief. Als de microarray onjuist georiënteerd ten opzichte van de lens en camera, de geautomatiseerde analyse software niet een raster te plaatsen op afbeelding de fluorescentie. </li><li> Sluit de toegangsdeur. Een voorbeeld van de afbeelding zal beschikbaar zijn op het computerscherm. </li><li> Selecteer de MDR-TB analyse script van de drop-down menu en voer de gewenste Exposure Time (in milliseconden). Een typische uitgangspunt voor gel element versterking microarrays is 100-500 msec. </li><li> Verzadigde pixels zal op het preview-beeld worden weergegeven in het rood. Pas de blootstellingstijd aan het aantal verzadigde beeldpunten binnen individuele vlekken minimaliseren. </li><li> Klik op Analyseren om het imago van de fluorescentie te verwerven en te analyseren. De software zal automatisch plaatsen van eenMDR-TB test-specifieke raster op de afbeelding, extract geïntegreerde intensiteit en achtergrondwaarden, en rapporteren resistentie en genotypering resultaten. De geautomatiseerde analyse zal doorgaans een paar seconden duren. Voor uitdagende beelden die krassen, stof, fluorescerende artefacten, of fysieke schade aan de microarray functies bevatten, moet de software van maximaal 1 minuut om de analyse te voltooien. </li><li> Zodra de analyse is voltooid, klikt u op Opslaan, selecteer de doelmap, typ een bestandsnaam en klik op OK. Onderliggende microarray gegevens worden opgeslagen als een. Xls-bestand en kan worden geëxporteerd voor off-line analyses, indien gewenst. </li><li> Zodra de analyse is voltooid, verwijdert u de versterking microarray van de imager, en klik op Nieuw om de volgende analyse te starten. </li><li> Wanneer u klaar bent het verzamelen van gegevens, sluit de software, sluit de computer af, en zet de imager. </li></ol>

<ol><li>Lemaire, J. -F., Casenghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+diagnostics+for+tuberculosis%3A+fulfilling+patient+needs+first%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Int.+AIDS+Soc%22%5BJournal%5D)">New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first.</a> J. Int. AIDS Soc. 13, 40(2010).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Tuberculosis+diagnostic+technology+landscape%22">Tuberculosis diagnostic technology landscape</a>. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).</li>
<li>Notomi, T., Okayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucl. Acids Res. 28, e63(2000).</li>
<li>Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicase-dependent+isothermal+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Helicase-dependent isothermal DNA amplification.</a> EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).</li>
<li>Pritchard, C. G., Stefano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+detection+of+viral+nucleic+acid+at+subattomole+levels+using+Q+beta+replicase%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biol.+Clin%22%5BJournal%5D)">Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase.</a> Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).</li>
<li>Compton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+sequence-based+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid sequence-based amplification.</a> Nature. 350, 91-92 (1991).</li>
<li>Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal%2C+in+vitro+amplification+of+nucleic+acids+by+a+multienzyme+reaction+modeled+after+retroviral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).</li>
<li>Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+chip+array+for+differentiation+of+mycobacterial+species+and+detection+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Chin.+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance.</a> Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).</li>
<li>Troesch, A., Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+species+identification+and+rifampin+resistance+testing+with+high-density+DNA+probe+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).</li>
<li>Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+TB-biochip+oligonucleotide+microarray+system+for+rapid+detection+of+rifampin+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).</li>
<li>Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+defined+Mycobacterium+tuberculosis+populations+using+RNA+amplification+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies.</a> BMC Genomics. 9, 94(2008).</li>
<li>Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+mycobacterium+species+isolates+by+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).</li>
<li>Park, H., Jang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+genotyping+of+Mycobacterium+species+from+clinical+isolates+and+specimens+by+oligonucleotide+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).</li>
<li>Yao, C., Zhu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rpoB%2C+katG+and+inhA+gene+mutations+in+Mycobacterium+tuberculosis+clinical+isolates+from+Chongqing+as+determined+by+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray.</a> Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).</li>
<li>Sun, A. H., Fan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+rpoB+gene+mutations+in+rif-resistant+M.+tuberculosis+isolates+by+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Environ.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray.</a> Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).</li>
<li>Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+drug-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+with+a+scanning-frame+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray.</a> Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).</li>
<li>Fu, L., Shinnick, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+action+of+INH+on+a+highly+INH-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strain+using+Genechips%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips.</a> Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).</li>
<li>Fu, L. M., Shinnick, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+exploration+of+the+drug+action+of+capreomycin+on+Mycobacterium+tuberculosis+using+Affymetrix+oligonucleotide+GeneChips%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect%22%5BJournal%5D)">Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips.</a> J. Infect. 54, 277-284 (2007).</li>
<li>Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+pncA+genotyping+of+pyrazinamide-resistant+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).</li>
<li>Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hybridisation+on+oligonucleotide+microarrays+for+analysis+of+drug-resistant+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis.</a> Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).</li>
<li>Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+and+allele+specific+PCR+detection+of+point+mutations+in+Mycobacterium+tuberculosis+genes+associated+with+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance.</a> J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).</li>
<li>Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+mapping+of+mutations+of+pyrazinamide-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strains+with+a+scanning-frame+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).</li>
<li>Yue, J., Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rifampin-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strains+by+using+a+specialized+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).</li>
<li>Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+CombiChip+Mycobacteria+Drug-Resistance+detection+DNA+chip+for+identifying+mutations+associated+with+resistance+to+isoniazid+and+rifampin+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).</li>
<li>Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+macroarrays+for+the+identification+of+MDR+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).</li>
<li>Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+the+genotype+MTBDR+line+probe+assay+for+detection+of+resistance+to+rifampin+and+isoniazid+in+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis+with+low-+and+high-level+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).</li>
<li>Padilla, E., Gonzalez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+the+new+version+of+the+INNO-LiPA+Mycobacteria+and+GenoType+Mycobacterium+assays+for+identification+of+Mycobacterium+species+from+MB%2FBacT+liquid+cultures+artificially+inoculated+with+mycobacterial+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains.</a> J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).</li>
<li>Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnostic+performance+of+the+GenoType+MTBDRplus+Version+2+line+probe+assay+is+equivalent+to+that+of+the+Xpert+MTB%2FRIF+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay.</a> J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).</li>
<li>Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+line+probe+assay+for+rapid+identification+of+pncA+mutations+in+pyrazinamide-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).</li>
<li>Chandler, D. P., Bryant, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+amplification+microarrays+for+infectious+disease+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics.</a> Microarrays. 1, 107-124 (2012).</li>
<li>Vincent, V., Rigouts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TDR+Tuberculosis+Strain+Bank%3A+a+resource+for+basic+science%2C+tool+development+and+diagnostic+services%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Tuberc.+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services.</a> Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).</li>
<li>Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-volatile+copolymer+compositions+for+fabricating+gel+element+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays.</a> Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).</li>
<li>Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plastic%2C+disposable+microfluidic+flow+cell+for+coupled+on-chip+PCR+and+microarray+detection+of+infectious+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents.</a> Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).</li>
<li>Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplicon+secondary+structure+prevents+target+hybridization+to+oligonucleotide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).</li>
<li>El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+sloppy+molecular+beacon+probes+for+identification+of+Mycobacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).</li>
<li>Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+molecular+detection+of+tuberculosis+and+rifampin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

De omvang van multiplexing met een amplificatie microarray wordt uiteindelijk bepaald door de efficiëntie van multiplex asymmetrische PCR, niet de microarray. In onze ervaring, kan 10-12 unieke primer paren gemakkelijk worden multiplexfunctionaliteit een amplificatie microarray-formaat. Conventionele primer en probe ontwerpcriteria gelden derhalve nieuwe assays, behalve dat men moet ook potentiële interacties tussen oplossing-fase nucleïnezuren en microarray geïmmobiliseerde probes, het thermisch rendement van de thermi...

Vroege opsporing en snelle behandeling worden beschouwd als de meest effectieve controle strategieën om Mycobacterium tuberculosis (MTB) transmissie 1 verminderen, en er is nu een brede consensus in de tbc-gemeenschap die een point of care (POC) of in de buurt POC test om gelijktijdig diagnosticeren TB en resistentie tegen (DR) nodig. Technologieën zoals Cepheid GeneXpert en andere nucleïnezuur amplificatie testen verminderen de tijd tot de diagnose voor veel tbc-patiënten, en zorgen voor een snelle uitlezing aangeeft resistentie tegen rifampicine of geselecteerde mutaties die resistentie tegen andere eerste of tweede lijn drugs 2. Hoewel realtime isotherme nucleïnezuur amplificatie zijn bedoeld om de resistentie mutaties die leiden tot MDR-TB identificeren, het spectrum van mutaties detecteren ze vaak ontoereikend om een ​​geïndividualiseerd drugregime overeenkomt met de resistentie profiel van de patiënt te ontwerpen, en technische beperkingen met betrekkingoptische overspraak of de complexiteit van amplificatie en rapportage chemische 03-07 mei het aantal loci of mutaties die worden gedetecteerd beperken. Zo detectie technologieën met een hogere multiplexing capaciteit nodig zijn om bekend hiaten in MDR-TB POC diagnostiek. Microarrays en de WHO-onderschreven Hain lijnprobe testen kunnen de &quot;meerdere genen, meerdere mutaties&quot; uitdaging van de diagnose van MDR-TB 8-29 pakken. Helaas zijn deze hybridisatie gebaseerde, multiplex detectie platforms gebruiken multistep, ingewikkeld, en open-amplicon protocollen die significante opleiding en deskundigheid in de moleculaire technieken vereisen. De amplificatie microarray 30 is ontworpen om een aantal van deze microarray workflow en operationele problemen aan te pakken. De vereenvoudiging van vloeibare principes zijn aan te vullen, hybridiseren, en detecteren nucleïnezuur doelen binnen een enkele microfluïdische kamer. De gebruiker nucleïnezuur en amplificatie introduceert master mengen in een vloeibare kamer met een pipet en begint de thermische cycli protocol. Voor de batchverwerking methode hier getoond, zijn microarrays vervolgens gewassen in bulk oplossing, gedroogd, en afgebeeld. Deze studie toont de functionaliteit van een amplificatie microarray met een MDR-TB microarray test voor rpoB (30 mutaties), KATG (2 mutaties), inha (4 mutaties), rpsL (2 mutaties), embB (1 mutatie), IS1245, IS6110 en een interne amplificatie en hybridisatie controle. Ten minste een matched pair van microarray probes (wild-type (WT) en single-nucleotide mutant (MU)) is opgenomen voor elke mutatie van belang. Gezuiverde nucleïnezuren uit multiresistente M. tuberculose van de TDR Tuberculose Strain Bank 31. Gel element microarrays worden geproduceerd op glassubstraten door copolymerisatie hoofdzaak zoals elders 32 beschreven, behalve dat we 4% monomeer en 0,05 mM elke probe in de polymerizatie mengsel. Arrays zijn omgeven met een 50 ml pakking voor gebruik. Na thermische cycli, hybridisatie en wassen stappen, zijn versterking microarrays afgebeeld op een Akonni draagbare analyzer. -Achtergrond gecorrigeerde, geïntegreerde signaal intensiteiten worden verkregen uit de ruwe. Tif beelden met behulp van een vaste cirkel algoritme. Noise elk gel-element wordt berekend als drie maal de standaardafwijking van de lokale plek achtergronden. Gendoelstellingen worden doorgaans beschouwd detecteerbaar voor signaal-ruisverhouding (SNR)-waarden ≥ 3. Om de aanwezigheid of afwezigheid van een specifieke mutatie in elk gen of codon bepalen, wordt een discriminant verhouding berekend uit de SNR waarden (WT-MU) / (WT + MU). Discriminant verhoudingen &lt;0 zijn indicatief voor een resistentie mutatie op de locus, terwijl verhoudingen&gt; 0 zijn aanwijzingen voor de wild-type sequentie.

<table><tbody><tr><td>MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips</td><td>Akonni Biosystems</td><td>Inquire</td><td></td></tr><tr><td>Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus</td><td>Qiagen</td><td>#206143</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymerase</td><td>Qiagen</td><td>#201207</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-free water</td><td>Qiagen</td><td>#206143&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#BP227-500</td><td></td></tr><tr><td>20 mg mL-1 non-acetylated bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#3B6917</td><td></td></tr><tr><td>5X concentrated MDR-TB primer mix</td><td>Akonni Biosystems</td><td>Inquire</td><td></td></tr><tr><td>500 fg uL-1 amplification and inhibition control</td><td>Akonni Biosystems</td><td>Inquire</td><td></td></tr><tr><td>20X SSPE</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#BP1328-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Disinfecting Spray&nbsp;</td><td>Current Technologies, Inc.</td><td>#BRSPRAY128</td><td></td></tr><tr><td>70% Isopropyl Alcohol</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>#8416</td><td></td></tr><tr><td>Microarray imager, with automated image and data analysis software</td><td>Akonni Biosystems</td><td>100-20011</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler with flat block insert</td><td>Akonni Biosystems</td><td>100-10021</td><td></td></tr><tr><td>High-throughput wash station and slide holder</td><td>ArrayIt</td><td>HTW</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting forceps</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#10-300</td><td></td></tr><tr><td>Mini Vortexer</td><td>VWR</td><td>#3365040</td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifuge</td><td>VWR</td><td>#93000-196</td><td></td></tr><tr><td>Airbrush Compressor Kit</td><td>Central Pneumatic</td><td>#95630</td><td></td></tr></tbody></table>

aantonen van een multiresistente<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em&gt; versterking microarray

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Vereenvoudiging microarray workflow is een noodzakelijke eerste stap voor het creëren van MDR-TB-microarray gebaseerde diagnostiek die routinematig kan worden gebruikt in een lagere-resource-omgevingen. Een amplificatie microarray combineert asymmetrische PCR-amplificatie, doelgrootte selectie, doel etikettering, en microarray hybridisatie binnen een enkele oplossing en in een enkele microfluïdische kamer. Een batch processing methode wordt gedemonstreerd met een 9-plex asymmetrische master mix en low-density gel element microarray voor genotypering van multiresistente Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). De hier beschreven protocol kan in 6 uur worden ingevuld en voorzien juiste genotypering met minstens 1.000 cel equivalenten van genomisch DNA. Integratie on-chip wasstappen haalbaar, wat zal resulteren in een volledig gesloten amplicon werkwijze en systeem. De omvang van multiplexing met een amplificatie microarray uiteindelijk beperkt door het aantal primerparen die kunnen worden gecombineerd tot een enkele master mix en toch bereiken gewenste gevoeligheid en specificiteit prestatiemetingen dan het aantal probes die zijn geïmmobiliseerd op de array. Evenzo kan de totale analysetijd verkort of verlengd worden afhankelijk van de specifieke beoogde toepassing, vraagstelling en gewenste detectiegrenzen. Toch is de algemene aanpak aanzienlijk stroomlijnt microarray workflow voor de eindgebruiker door het verminderen van het aantal arbeidsintensieve en tijdrovende processtappen, en biedt een vereenvoudigde biochemische en microfluïdische pad voor het vertalen van microarray-gebaseerde diagnostiek in de dagelijkse klinische praktijk.

Kwalitatieve beeldanalyse kan inzicht geven in bronnen van experimentele noise of variabiliteit die zijn uitdagend te identificeren in data tabellen gegenereerd door geautomatiseerde software voor beeldanalyse. Zo kan het nuttig zijn om visueel te vergewissen dat 1) Alle gel elementen intact en onbeschadigd zijn, 2) de globale achtergrond is vrij van fluorescerende artefacten die individuele signaal invloed kunnen ruisverhouding (SNR) waarden, 3) er is geen bewijs voor blaasvorming of niet-uniforme amplificatie / hybrid...

Een amplificatie microarray combineert asymmetrische PCR-amplificatie en microarray hybridisatie in een enkele kamer, die aanzienlijk stroomlijnt microarray workflow voor de eindgebruiker. Vereenvoudiging microarray workflow is een noodzakelijke eerste stap voor het maken van microarray-gebaseerde diagnostiek die routinematig kan worden gebruikt in een lagere-resource-omgevingen.

Aantonen van een multiresistente<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Versterking Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om multi-drug resistent microbacterium tuberculosis te genotypen, met behulp van een amplificatie microarray. Dit wordt bereikt door een multiplex asymmetrische PCR uit te voeren over de top van een microarray binnen een enkele microfluïdische reactiekamer. Daar wordt het monster gelijktijdig geamplificeerd, gelabeld, grootte geselecteerd, enkelstrengs gemaakt en gehybridiseerd naar de microarray.Vervolgens, nadat de microarray is gewassen, toont een lezer of microbacterium tuberculosis aanwezig is, en of het een DNA-mutatie bevat die bekend is om resistentie te verlenen tegen rifampicijn iso, niazi ethambutol of streptomycine. Het voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande microarray line probe of nucleïnezuur hybridisatie methoden is dat een amplificatie microarray de interactie van de gebruiker met de test aanzienlijk vereenvoudigt. Toch, terwijl het de analytische gevoeligheid van PCR en de multiplexcapaciteit van een microarray biedt. Voor deze procedure, zorg voor een schone werkruimte die is schoongemaakt met een ontsmettingsoplossing en zorgen voor nucleïnezuren die puur genoeg zijn voor multiplex PCR.Na het ontdooi

demonstrating-multi-drug-resistant-mycobacterium-tuberculosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Antimicrobiële gevoeligheid testen van Mycobacterium tuberculosis is een uitdaging, maar essentieel voor de patiëntenzorg. Dit microtiterplaat formaat biedt het testen van 12 antimycobacteriële drugs en zorgt voor minimale remmende concentratie (MIC) waarden, die zal helpen bij een passende behandeling.

Antimicrobiële gevoeligheid testen van Mycobacterium tuberculosis-complex voor de eerste en tweede lijn drugs door de bouillon verdund in een microtiterplaat Format

De Xpert MTB / RIF-test integreert monster ontsmetting, hands-free bediening, on-board steekproef verwerking, en ultra-gevoelige hemi-geneste PCR voor de simultane detectie...

Diagnose van longtuberculose met de Xpert MTB / RIF Test

This video demonstrates an assay to evaluate the efficacy of drugs against Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection. An in vitro infection model containing Mtb/macrophage aggregates is generated that mimics in vivo infection. Upon introducing suitable antibiotics, their efficacy is tested via resuzarin assay to monitor the survival of bacteria with increasing drug concentrations.

An Assay to Evaluate Drug Efficacy against a Mycobacterium tuberculosis Infection Model

Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Nieuwe modellen en testen die het vroege proces van geneesmiddelontwikkeling voor de volgende generatie tuberculosebestrijdende middelen zouden verbeteren, zijn zeer wenselijk. Hier beschrijven we een snelle, goedkope en BSL-2-compatibele test om de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen Mycobacterium tuberculosis te evalueren, die gemakkelijk kan worden aangepast voor screening met hoge doorvoer.

Een High-throughput Compatible Assay te evalueren Drug De werkzaamheid tegen macrofaag gepasseerd<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

We beschrijven een tuberculose moleculaire bacteriële load test uitgevoerd na warmte-inactivatie van sputum. Warmteinactivatie maakt sputummonsters niet-besmettelijk en voorkomt de noodzaak van containmentniveau 3-laboratoria voor moleculaire tests op tuberculose.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Deze studie ontwikkelde een test voor high-throughput screening tegen Mycobacterium abscessus met een recent gecreëerde dubbele reporterstam, waarbij fluorescentie en luminescentie worden gebruikt om de levensvatbaarheid van bacteriën snel te beoordelen. Dit protocol zal relevant zijn voor onderzoekers die nieuwe geneesmiddelen willen screenen op deze resistente bacterie.

Ontwikkeling van tests voor high-throughput medicijnscreening tegen mycobacteriën

Hier presenteren we een DNA-microarray-chipmethode voor het identificeren van Mycobacterium-soorten , die de diagnostische nauwkeurigheid en efficiëntie van verwante ziekten voor klinisch gebruik zal verbeteren.

Identificatie van Mycobacterium-soorten door middel van DNA-microarray-chipmethode

Monstervoorbereiding van<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extracten voor Nuclear Magnetic Resonance metabolietvorming

Mycobacterium tuberculosis vormt drug tolerant biofilms wanneer gekweekt in bepaalde omstandigheden. Hier beschrijven werkwijzen voor het kweken M. tuberculose biofilms en het bepalen van de frequentie van de drug tolerante persisters. Deze protocollen zullen nuttig zijn voor verdere studies naar de mechanismen van tolerantie in M. tuberculose.

Groei Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Leer een versterkingsmicroarray-methode voor het genotyperen van multiresistent Mycobacterium tuberculosis. Deze techniek combineert PCR en hybridisatie in één kamer voor eenvoudigere diagnostiek in omgevingen met beperkte middelen.

Aantonen van een multiresistente

Meer video's verkennen