Name: Vouwen en Karakterisatie van een Bio-responsieve Robot van DNA Origami (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Leer de fabricage van bio-responsieve robots via DNA origami met zelfassemblage, zuivering en TEM-beeldvorming. Dit protocol biedt een basis voor nanotechnologisch onderzoek en toekomstige biomedische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen S. Douglas bedanken voor zeer waardevolle discussies en advies, en alle leden van de Bachelet lab voor nuttige discussies en werk. Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de faculteit Life Sciences en het Instituut voor Nanotechnologie &amp; Advanced Materials aan de Bar-Ilan Universiteit.

1. Voorbereiding van Staples Pool Mixture <ol><li> Order gevriesdroogd DNA nanorobot nieten 96 putjes zoals vermeld in Tabel 1 (zie Materialen) en normaliseren tot 10 nmol. Voor een uitvoerige beschrijving van het ontwerp en de architectuur van het DNA nanorobot Zie Ben-Ishay et al. 14 en Douglas et al. 15). </li><li> Reconstitueer iedere kram goed met DNase / RNase-free ultrazuiver tot een concentratie van 100 uM. Voor nietjes genormaliseerd tot 10 nmol, reconstitueren met 100 ul van ultrapuur water. </li><li> Zwembad samen 20 pi van elke nietje met behulp van een multichannel pipet en een steriele 55 ml oplossing bekken. Opmerking: Aangezien de nanorobot vorm bestaat uit 254 stapelvezels strengen (inclusief Core, randen, handvatten en Guides sequenties tabel 1), de concentratie van elk van de nietjes in het nietjes zwembad 394 nM. Het verwijderen van nietjes uit het nietje zwembad, of het toevoegen van een aantal op verschillende vollumes, kan de opbrengst aanzienlijk verminderen of anderszins gevolg ongevouwen aggregaten. </li></ol> 2. Voorbereiding van Fabrication Reaction Mixture <ol><li> Voor een standaard reactiemengsel gebruiken 40 ul van M13mp18 virale genoom circulair enkelstrengs DNA, wat overeenkomt met 4 pmol steiger DNA (100 nM voorraad oplossing, zie Materials). De eindconcentratie van scaffold in de fabricage mengsel 20 nM, eindvolume 200 pl. <ol><li> Pas de hoeveelheid steiger DNA volgens specifieke behoeften; echter, houdt de eindconcentratie van scaffold DNA in het reactiemengsel bij een constante 20 nM. </li></ol></li><li> Nietjes toe te voegen aan een steiger om nietjes verhouding van 1 te bereiken tot 10, respectievelijk. Voor een 20 nM steiger DNA-concentratie, elk van de uiteindelijke concentratie 254 nietjes &#39;is 200 nm. Voor een 200 ul laatste reactie volume toe te voegen 102 ul van de nietjes zwembad mengsel (paragraaf 1.2). <ol><li> Voeg specifieke Gate sequenties apart the vouwen reactiemengsel op dit moment. Deze oligo&#39;s worden apart besteld en vereisen HPLC zuivering. Zorg ervoor dat Gate oligo&#39;s aanwezig zijn in een 01:10 steiger aan Gate volgorde verhouding zijn, dat wil zeggen 200 nm van elke oligo voor een 20 nM steiger concentratie. Voor een 200 ul reactievolume vouwen, voeg 0,4 ul van elk van de vier Gate oligo in een 100 pM voorraad concentratie. </li></ol></li><li> Voeg 10 x TAE stock buffer tot een eindconcentratie van 1 x TAE (40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA) te bereiken. Voor een 200 ul reactievolume vouwen, voeg 20 ul van 10x TAE. </li><li> Voeg 1 M MgCl2 tot een eindconcentratie van 10 mM. Voor een 200 ul reactievolume vouwen, voeg 2 pl 1 M MgCl2. </li><li> Voeg 36 ul DNase / RNase vrij ultrapuur water om een ​​eindvolume van 200 pl te bereiken. </li><li> Vortex en monster 100 ul monsters in PCR flesjes. Opmerking: Raadpleeg thermocycler specificatie met betrekking tot de maximale reactie volumes worden gebruikt.Vermindering van het volume aan deze limieten voldoen zal de verkregen opbrengst verminderen. Reactie volumes boven de maximale opgegeven zal de opbrengsten in gevaar brengen. </li></ol> 3. Temperatuur Annealing Ramp van Fabrication Reaction <ol><li> Programma thermische cycler als volgt: <ol><li> Helling 85 ° C tot 60 ° C met een snelheid van 5 min / ° C. </li><li> Helling 60 ° C tot 4 ° C bij een snelheid van 75 min / ° C. </li><li> Houd bij 4 ° C voor onbepaalde tijd. </li></ol></li><li> Na fabricage is opslag samples beëindigd bij -20 ° C. </li></ol> 4. Verwijdering van Excess Staples <ol><li> Voeg 100 ul van vouwen reactiemengsel tot een 0,5 ml centrifugaal filter met een MWCO van 100 kDa. Sla een 10 ui monster van nanorobots voorzuivering voor latere analyse. </li><li> Centrifugeer 10 minuten bij 9600 x g. </li><li> Voeg 400 gl vouwingsbuffer (1 x TAE, 10 mM MgCl2). </li><li> Herhaal de stappen 4,2 en 4,3 keer meer. </li><li>Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 9600 x g. </li><li> Herstel het concentraat door het plaatsen van de filter ondersteboven in een schone microcentrifugebuis en centrifugeren gedurende 1 min bij 9.600 x g. Final volumes kunnen variëren afhankelijk van het oorspronkelijke volume fabricage reactiemengsel dat in de filter werd gezet. Typisch een 25-60 ul eindvolume van geconcentreerde nanorobot monster wordt verkregen. </li><li> Meet concentratie van DNA in de monsters via spectrofotometer bij 260 nm. Gebruik moleculair gewicht van 5,3 ug / pmol bij de berekening van molaire concentraties van nanorobot monsters. Opmerking: De molaire extinctiecoëfficiënt van dsDNA, 50 ug / OD 260 is voldoende voor de meeste toepassingen. 48 ug / OD 260 houdt rekening met de poly thymine ssDNA strekt de randen nietjes. </li></ol> 5. Agarosegelelektroforese Analyse van gevouwen Nanorobots <ol><li> Bereiding van 0,5 x TBE (45 mM Tris-boraat, 1 mM EDTA), 2% agarosegel gesupplementeerd met 10 mM MgCl2 </sub&gt; (aangepast van Ernesto Castro et al. 21): <ol><li> Bereid 0,5x TBE buffer door verdunning van 6,25 ml van 10x TBE voorraad buffer in 118,75 ml van DDH 2 O. </li><li> Oplossen in 125 ml 0,5X TBE buffer 2,5 g agarose. </li><li> Kook in de magnetron tot de agarose volledig is opgelost. </li><li> Voeg 1,25 ml van 1 M MgCl 2 tot eindconcentratie van 10 mM. </li><li> Voeg 7 pl van 10 mg / ml ethidiumbromide. </li><li> Wachten voor oplossing enigszins afkoelen en vul de gel lade voordat de agarosegel stolt. Installeer de gewenste kam onmiddellijk. </li><li> Bereid 1 L 0,5x TBE loopbuffer door toevoeging van 50 ml 10 x TBE-buffer voorraad en 10 ml 1 M MgCl 2 om 940 ml van DDH 2 O. </li><li> Zodra gel vast add loopbuffer om de elektroforese-inrichting en zet inrichting in een ijsbad. </li></ol></li><li> Belasting 1 ug totaal DNA van de nanorobots voorzuivering (stap 3.2), en na zuivering (stap 4.7), naast een steigerDNA-monster en een 1 kb DNA-merker, op de gel. Een voorbeeld wordt gegeven in figuur 2. Werkelijke hoeveelheden monsters afhankelijk van de concentratie verkregen na zuivering. Elk monsters geladen met laadbuffer in een 1: 6 eindvolume ratio. </li><li> Stel stroombron tot 80 V en draaien gel voor 3 uur. Voer de gel in een bad gevuld met ijs en water. Nanorobots zal ontvouwen en verschijnen als een uitstrijkje als de agarosegel wordt tijdens elektroforese. Tijdens elektroforese voeg extra ijs om het apparaat te houden van verwarming. </li><li> Bekijk gel op een UV tafel (Figuur 2). </li></ol> 6. Negative Stain van Nanorobot met Uranyl-formaat <ol><li> Bereiding van 2% uranyl-formiaat stockoplossing (naar Castro et al. 23): <ol><li> Weeg 100 mg van uranyl-formaat poeder in een 15 ml buis. </li><li> Kook DNase / RNase gratis ultrapuur water gedurende 3 minuten om de-oxygenaat-. </li><li> Voeg 5 ml gedeoxygeneerd heet water (~ 60 ° C)in de 15 ml buis met het uranyl-formiaat poeder (uit de vorige stap). Goed sluit het deksel, wikkel in aluminiumfolie en vortex grondig gedurende 10 min (Fasten buis naar een vortex). Oplossing moet troebel met een gele kleur verschijnen. </li><li> Filter oplossing door een 0,2 um spuit fi lter. Oplossing moet helder worden. </li><li> Aliquot 200 ul van de oplossing in microcentrifugebuizen. </li><li> Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 5 minuten in een tafelmodel centrifuge pool monsters op de bodem van de buis. </li></ol></li><li> Laden van het monster op raster en negatieve kleuring: <ol><li> Ontdooi een 200 pi hoeveelheid van 2% uranyl-formiaat oplossing (bereid in paragraaf 6.1). Voeg 10 ul van 0,5 M NaOH-oplossing en grondig vortex gedurende 3 min. Centrifuge bij maximale snelheid gedurende 5 minuten met behulp van een tafelblad centrifuge. </li><li> Ondertussen, glow-ontlading raster met kamer lucht bij 0,2 mbar en 25 mA voor 30 sec. </li><li> Voeg 15 ul van 2 nM nanorobot monster na zuivering (sectiop 4,7) op de bovenzijde van het rooster (gehouden met een pincet) en laat absorberen 1 min. Gebruik fi filter papier om het overtollige vocht weglopen door het plaatsen van het rooster boven op het filterpapier. Raak het oppervlak rooster niet aan. </li><li> Voeg 10 ul van de 2% uranyl-formaat (van stap 6.2.1) op de bovenzijde van het rooster (gehouden met een pincet). </li><li> Gebruik Snel fi filter papier om het overtollige vocht weglopen door het plaatsen van het rooster boven op het filterpapier. Raak het oppervlak rooster niet aan. </li><li> Herhaal de stappen 6.2.4 en 6.2.5. </li><li> Voeg 10 ul van de 2% uranyl-formaat (van stap 6.2.1) op de bovenzijde van het rooster (gehouden met een pincet). Laat kleurstofoplossing inwerken 30 sec. </li><li> Gebruik fi filter papier om het overtollige vocht weglopen door het plaatsen van het rooster boven op het filterpapier. Raak het oppervlak rooster niet aan. </li><li> Laat het rooster drogen gedurende ten minste 30 min, open op een filterpapier, vóór het injecteren in de TEM. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Watson, J. D., Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetical+implications+of+the+structure+of+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 171, 964-967 (1953).</li>
<li>Kosuri, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+de+novo.+DNA+synthesis%3A+technologies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Meth%22%5BJournal%5D)">Large-Scale de novo. DNA synthesis: technologies and applications.</a> Nature Meth. 11 (5), 499-507 (2014).</li>
<li>Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+for+structural+DNA+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology.</a> Nature Nanotech. 6 (12), 763-772 (2011).</li>
<li>Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+junctions+and+lattices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid junctions and lattices.</a> J Theor Biol. 99 (2), 237-247 (1982).</li>
<li>Chen, J. H., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+from+DNA+of+a+molecule+with+the+connectivity+of+a+cube%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube.</a> Nature. 350 (6319), 631-633 (1991).</li>
<li>Wei, B., Dai, M., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+shapes+self-assembled+from+single-stranded+DNA+tiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles.</a> Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li>
<li>Yin, P., Hariadi, R. F., Sahu, S., Choi, H. M. T., Park, S. H., Labean, T. H., Reif, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+DNA+tube+circumferences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321 (5890), 824-826 (2008).</li>
<li>Rothemund, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li>
<li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li>
<li>Douglas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li>
<li>Zhang, F., Nangreave, J., Liu, Y., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+DNA+nanotechnology%3A+state+of+the+art+and+future+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Structural DNA nanotechnology: state of the art and future perspective.</a> J Am Chem Soc. 136 (32), 11198-11211 (2014).</li>
<li>Douglas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+3D+DNA-origami+shapes+with+caDNAno%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno.</a> Nucleic Acids Res. 37 (15), 5001-5006 (2009).</li>
<li>Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+bio-responsive+robot+from+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Designing a bio-responsive robot from DNA origami.</a> J Vis Exp. (77), e50268(2013).</li>
<li>Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+logic-gated+nanorobot+for+targeted+transport+of+molecular+payloads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads.</a> Science. 335 (6070), 831-834 (2012).</li>
<li>Tan, W., Donovan, M. J., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+from+cell-based+selection+for+bioanalytical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Aptamers from cell-based selection for bioanalytical applications.</a> Chem Rev. 113 (4), 2842-2862 (2013).</li>
<li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+Aptamer-Guided+Cancer+Therapeutics+and+Diagnostics%3A+The+Next+Generation+of+Cancer+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid Aptamer-Guided Cancer Therapeutics and Diagnostics: The Next Generation of Cancer Medicine.</a> Theranostics. 5 (1), 23-42 (2015).</li>
<li>Zhang, D. Y., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+nanotechnology+using+strand-displacement+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions.</a> Nat Chem. 3 (2), 103-113 (2011).</li>
<li>Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+aptamers+for+recognition+of+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Generating aptamers for recognition of virus-infected cells.</a> Clin Chem. 55 (4), 813-822 (2009).</li>
<li>Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+DNA+aptamers+using+Cell-SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Prot%22%5BJournal%5D)">Development of DNA aptamers using Cell-SELEX.</a> Nature Prot. 5 (6), 1169-1185 (2010).</li>
<li>McKeague, M., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+Opportunities+for+Small+Molecule+Aptamer+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Challenges and Opportunities for Small Molecule Aptamer Development.</a> J Nucleic Acids. 2012, (2012).</li>
<li>Amir, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+computing+by+DNA+origami+robots+in+a+living+animal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Universal computing by DNA origami robots in a living animal.</a> Nature Nanotech. 9 (5), 353-357 (2014).</li>
<li>Castro, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+to+scaffolded+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Meth%22%5BJournal%5D)">A primer to scaffolded DNA origami.</a> Nature Meth. 8 (3), 221-229 (2011).</li>
<li>Sobczak, J. P., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+folding+of+DNA+into+nanoscale+shapes+at+constant+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid folding of DNA into nanoscale shapes at constant temperature.</a> Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).</li>
<li>Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+and+scalable+preparation+of+pure+and+dense+DNA+origami+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li>
<li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).</li>
<li>Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+a+3D+DNA-origami+object%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We beschreven de vervaardiging, zuivering en visualisatie van de DNA nanorobot. Na vervaardiging van de hexagonale chassis van de inrichting, is de functie van de nanorobot geprogrammeerd met de eenvoudige introductie van specifieke vracht en waarneming strengen de robot die gemakkelijk hun aangewezen positie ondervinden van de waterstofbinding complementariteit met beschikbare enkelstrengs docking plaatsen 14 , 15,22. De fabricage beschreven protocol gebruikt een langzame anneali...

De toepassingen voor nucleïnezuren nanotechnologie zijn verbazingwekkend. De volgzaamheid van de Watson-Crick baseparing en het gemak en de relatief lage kosten van grootschalige synthese van op maat gemaakte oligo 2 een explosie toepassingen 3 en onderzoek op het gebied van DNA nanotechnologie gegenereerd. Structurele DNA nanotechnologie, gebaseerd op de immobiele Seeman knooppunt 4,5 als hoeksteen maakt gebruik van DNA als een zelfassemblerende elementaire eenheid voor de constructie van willekeurige vormen 6-8. De recente ontwikkeling van de steigers DNA Origami 9-techniek maakt de constructie van complexe 2D / 3D nano-architecturen 10-12 met sub-nanometer precisie en een efficiënte route voor het bouwen van nieuwe functionele objecten met toenemende complexiteit en verbazingwekkende diversiteit. De constructie is gebaseerd op een lange scaffold enkelstrengs DNA, gewoonlijk afgeleid van een viraal genoome, die kunnen worden gevouwen door de hybridisatie van honderden korte enkelstrengs DNA-oligo genoemd nietjes. De hoge structurele resolutie verkregen met deze techniek is het directe gevolg van de natuurlijke omvang van de DNA dubbele helix, terwijl de reproduceerbaarheid van fabricage is het resultaat van afstemming van de korte enkelstrengs sequenties nietje de maximum waterstofbinding complementariteit haalbaar vergemakkelijken. Met het gebruik van een langzame temperatuur annealing de helling gemaakt laagste energie thermodynamisch voorkeur nanostructuur in hoge opbrengsten en betrouwbaarheid wordt bereikt. De eenvoudige implementatie van ontwerpregels knooppunt in een computercode kon de ontwikkeling van CAD-hulpmiddelen, zoals caDNAno 13, dat zeer de taak van het ontwerpen van grote, complexe structuren met honderden verbonden knooppunten vereenvoudigen. Eerder beschreven we het ontwerp van een DNA nanorobot met behulp van het gereedschap caDNAno 14,15. Hier tonen we de fabricage envisualisatie via transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) van de nanorobot een 3D holle zeshoekige nanodevice, met afmetingen van 35 x 35 x 50 nm 3, die een belangrijke conformationele verandering in reactie ondergaan een voorafbepaalde stimuli en dit specifieke lading, zoals eiwitten of nucleïnezuur oligo, afgezonderd binnen. Terwijl 12 laadstations zijn beschikbaar in de holle chassis, het werkelijke aantal gebonden lading verschilt met lading grootte. Lading moleculen variëren van kleine DNA-moleculen enzymen, antilichamen en 5-10 nm goud nanodeeltjes. Cargocan ofwel uniform of heterogeen, zodat elke nanorobot bevat een mengsel van verschillende moleculen. Sensing wordt bereikt via twee dubbele helix vergrendeling poorten ontwerp tot eiwitten, nucleïnezuren of andere chemische stoffen te voelen, hetzij op basis van aptasensor 16,17 of DNA-streng verplaatsing 18 technologieën. Recente ontwikkelingen in aptameer selectie protocollen 19-21 staat het ontwerp van nanorobots reagereneen steeds groeiend aantal moleculen en celtypen. Eerder werk toonde een nanorobot met een specifiek antilichaam, die bij kan binden aan het antigeen ervan relais ofwel een remmend of een vruchtbare signaal naar de binnenkant van specifieke celtypen in een gemengde celpopulatie 15. Een interessante eigenschap van deze nanodevices is hun vermogen om nog meer complexe taken en logische regeling uitvoeren met de introductie van verschillende nanorobot subtypes in één populatie. Onlangs toonden we specifieke subtypen van nanorobots uitvoeren als positief of negatief regelen, besturen van een effector populatie die een actief molecuul cargo 22. De hier gepresenteerde protocol beschrijft de vervaardiging, zuivering en beeldvorming van een nanorobot omheind met sensor aptameer sequenties die selectief PDGF binden aan de opening van de nanorobot 15,22 vergemakkelijken. Het fabricageproces beschreven is vergelijkbaar met de nanorobot fabricageproces aanvankelijk afgebeeld door Douglas et al. 15 met de veranderingen die gericht zijn op vermindering van de totale duur proces, terwijl het verhogen van de opbrengst en zuivering tarieven.

<table><tbody><tr><td>DNase/RNase vrij gedistilleerd water</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>M13mp18 ssDNA sjabloon</td><td>NEB</td><td>N4040S</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE</td><td>Gibco</td><td>15558-042</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 ml centrifugale filter 100K MWCO</td><td>Amicon</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>TBE buffer</td><td>Promega</td><td>V4251</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromide 10&nbsp;mg/ml oplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA marker</td><td>NEB</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>Loading Dye</td><td>NEB</td><td>B7021S</td><td></td></tr><tr><td>uranylformiaat</td><td>polysciences</td><td>24762</td><td></td></tr><tr><td>koolstofgecoate TEM rasters&nbsp;</td><td>Science services</td><td>EFCF400-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler c1000 Touch</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glow Discharge K100X</td><td>Emitech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV tafel Gel Doc EZ Imager</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM FEI-G12</td><td>Tecnai</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vouwen en karakterisatie van een bio-responsieve robot van dna origami

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Het DNA nanorobot een holle zeshoekige nanometrische inrichting, ontworpen om in reactie op specifieke stimuli en presenteren lading binnen afgezonderd. Zowel stimuli en lading kan worden afgestemd op specifieke behoeften. Hier beschrijven we de DNA nanorobot fabricage protocol, met behulp van de DNA origami techniek. De procedure initieert door het mengen van korte enkelstrengs DNA-nietjes in een voorraad mengsel dat vervolgens naar een lange, cirkelvormige, enkelstrengs DNA scaffold wordt toegevoegd in aanwezigheid van een opvouwbare buffer. Een standaard thermo cycler geprogrammeerd om het mengen reactietemperatuur geleidelijk te verlagen om de krammen te scaffold gloeien, de drijvende kracht achter het vouwen van de nanorobot vergemakkelijken. Nadat het 60 uur vouwreactie is voltooid, wordt overmaat nietjes verwijderd met behulp van een centrifugaal filter, gevolgd door visualisatie via agarose-gelelektroforese (AGE). Tenslotte wordt een succesvolle vervaardiging van de nanorobot geverifieerd door transmissie- elektronenmicroscopie (TEM),het gebruik van uranyl-formiaat als negatief vlek.

Representatieve resultaten worden getoond in figuur 2A. Alle lanen bevatten 1 ug totaal DNA, gemeten via de spectrofotometer (OD 260). Vergeleken met cirkelvormige enkelstrengs DNA scaffold (Baan 2), zijn nanorobots gehinderd in de gel als gevolg van hun hogere molecuulgewicht gevolg nietjes hybridisatie met het DNA scaffold (Lane 3. Rode pijl). Het laagmoleculaire band in Lane 3 vertegenwoordigt overtollige nietjes die niet binden aan de steiger DNA (groene pijl). Na zuivering via centrifuga...

DNA origami is een krachtige methode voor het fabriceren van nauwkeurige objecten op nanoschaal door het zelfsamenstellen van DNA-moleculen te programmeren. Hier beschrijven we een protocol voor het vouwen van een bio-responsieve robot uit DNA origami, de zuivering en negatieve kleuring voor transmissie-elektronenmicroscopische beeldvorming (TEM).

Vouwen en Karakterisatie van een Bio-responsieve Robot van DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

folding-characterization-bio-responsive-robot-from-dna

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

We beschrijven experimentele details van de synthese van patronen en herconfigureerbare deeltjes van tweedimensionale (2D) precursors. Deze methodologie kan worden gebruikt om deeltjes te maken in een verscheidenheid van vormen zoals veelvlakken en grijpinrichtingen bij lengteschalen variërend van micro tot centimeter schaal.

Origami Inspired Zelf-assemblage van Patterned en Herconfigureerbare Deeltjes

DNA-origami is een krachtige methode voor het vervaardigen van nauwkeurige nanoschaal objecten door de zelf-assemblage van DNA-moleculen programmeren. Hier beschrijven we hoe origami DNA kan worden gebruikt om een ​​robot robot kan voelen biologische signalen en reageren door vormverandering vervolgens doorgegeven aan een gewenst effect te ontwerpen.

Het ontwerpen van een Bio-responsieve Robot van DNA Origami

DNA-tegeling is een effectieve benadering om programmeerbare nanostructuren te maken. We beschrijven de protocollen om complexe tweedimensionale vormen te construeren door de zelfassemblage van enkelstrengse DNA-tegels.

Zelf-assemblage van Complex Tweedimensionaal Vormen van enkelstrengs DNA Tiles

Reproduceerbare reinigingsprocessen voor substraten die worden gebruikt in DNA origami-onderzoek worden beschreven, inclusief RCA-reiniging op tafel en derivatisering van siliciumoxide. Protocollen voor oppervlaktevoorbereiding, DNA origami-depositie, droogparameters en eenvoudige experimentele opstellingen worden geïllustreerd.

Voorbereiding van Mica en Silicon substraten voor DNA Origami Analyse en Experimentation

Hier, wordt een geautomatiseerde workflow voor het uitvoeren van modulaire DNA "apparaat" vergadering met behulp van een modulaire klonen DNA vergadering methode op vloeistof aangestuurde robots gepresenteerd. Het protocol maakt gebruik van een intuïtieve softwaretool voor het genereren van vloeibare handler selectielijsten voor combinatorische DNA apparaat bibliotheek generatie, waaruit we met behulp van twee vloeibare behandeling platforms.

Geautomatiseerde robot Liquid Handling samenstel van modulaire DNA voorzieningen

We beschrijven het gedetailleerd protocol voor ontwerp, simulatie, NAT-lab experimenten en analyse voor een herconfigureerbare DNA accordeon rek van 6 bij 6 mazen.

Ontwerp en de synthese van een accordeon herconfigureerbare DNA-Rack

Hier, wordt een protocol inzake de bescherming van DNA origami nanostructuren in Mg-uitgeput en nuclease-rijke media met behulp van natuurlijke kationische polysaccharide chitosan en synthetische lineaire polyethyleneimine (LPEI) coatings gepresenteerd.

Gentherapie geïnspireerd Polycation Coating voor bescherming van DNA Origami nanostructuren

We beschrijven het gedetailleerd protocol voor de DNA origami gebaseerde montage van gouden nanostaafjes in chirale Enterprise metamolecules met sterke chiroptical reacties. Het protocol is niet beperkt tot chirale configuraties en kan gemakkelijk worden aangepast voor de fabricage van diverse Enterprise-architecturen.

Vergadering van gouden nanostaafjes in chirale Enterprise Metamolecules met behulp van DNA Origami sjablonen

Hier beschrijven we een protocol om discrete en nauwkeurige anorganische nanostructuren op substraten te maken met behulp van DNA-origami vormen als leidende templates. De methode wordt aangetoond door het creëren van plasmonic gouden bowtie-vormige antennes op een transparante ondergrond (Sapphire).

DNA origami-gemedieerde substraat nano-Atterning van anorganische structuren voor sensing toepassingen

Het doel van dit protocol is het vormen van ensembles van moleculaire motoren op DNA origami nanostructuren en observeren het ensemble motiliteit met behulp van totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie.

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Leer de fabricage van bio-responsieve robots via DNA origami met zelfassemblage, zuivering en TEM-beeldvorming. Dit protocol biedt een basis voor nanotechnologisch onderzoek en toekomstige biomedische toepassingen.

Vouwen en Karakterisatie van een Bio-responsieve Robot van DNA Origami

Meer video's verkennen